Summary
Un romanzo fluorescenza
Abstract
Ibridazione fluorescente in situ (FISH) è una tecnica che permette sequenze di DNA specifiche per essere rilevato su cromosomi in metafase o interfase in nuclei cella 1. La tecnica utilizza sonde di DNA con sequenze uniche che ibridano a interi cromosomi o specifiche regioni cromosomiche, e serve come un potente strumento in aggiunta alle classiche citogenetica. Per esempio, molti studi precedenti riportato la rilevazione frequente di aberrazioni cromosomiche aumento dei pazienti affetti da leucemia connessi con l'esposizione benzene, benzene-avvelenamento pazienti e lavoratori sani esposti a benzene, utilizzando l'analisi citogenetica classica 2. A base di pesce, alterazioni cromosomiche leucemia-specifici sono stati osservati per essere elevati nei lavoratori apparentemente sani esposti a benzene 3-6, indicando i ruoli critici dei cambiamenti cytogentic a benzene-indotta leucemogenesi.
In generale, un test singolo pesce prende in esame solo uno o pochi cromosomi pochi intereo loci specifici per vetrino, in modo ibridazioni più bisogno di essere condotta su più diapositive per coprire tutti i cromosomi umani. Cariotipo spettrale (SKY) permette di visualizzare contemporaneamente l'intero genoma, ma l'esigenza di un apposito software e attrezzature limiti la sua applicazione 7. Qui, descriviamo un nuovo metodo di analisi FISH, OctoChrome-FISH, che può essere applicato per Chromosomics, che definiamo qui come l'analisi simultanea di tutti i 24 cromosomi umani in una diapositiva in studi sull'uomo, come ad esempio il cromosoma studio a livello aneuploidia (CWA) 8. La base del metodo, commercializzato dalla Cytocell come il Sistema Multiprobe Chromoprobe, è un dispositivo OctoChrome che è divisa in 8 quadrati, ciascuno dei quali svolge tre diverse intere sonde pittura cromosomiche (Figura 1). Ciascuno dei tre sonde è marcato direttamente con un fluoroforo colore diverso, verde (FITC), rosso (Texas Red), e blu (cumarina). La disposizione di combinazioni cromosomiche sul OctoChromdispositivo e è stato progettato per facilitare l'identificazione delle non-casuali alterazioni cromosomiche strutturali (traslocazioni) che si trovano nei più comuni leucemie e linfomi, per esempio t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Inoltre, le variazioni numeriche (aneuploidia) nei cromosomi possono essere rilevati simultaneamente. La diapositiva corrispondente modello è anche diviso in 8 quadrati sulla quale sono vincolati in metafase (Figura 2), e sia posizionata sopra il dispositivo OctoChrome. Le sonde e DNA bersaglio sono denaturato ad alta temperatura e ibridato in una camera umida, e quindi tutte le 24 cromosomi umani possono essere visualizzati simultaneamente.
OctoChrome FISH è una tecnica promettente per la diagnosi clinica di leucemia e linfoma e per il rilevamento di aneuploidie in tutti i cromosomi. Abbiamo applicato questo nuovo approccio cromosomica in uno studio CWA dei lavoratori cinesi benzene esposti 8,10.
Protocol
1. Preparazione del vetrino del campione
- FISH OctoChrome è stato progettato per esaminare i cambiamenti cromosomici in metafase delle cellule umane, incluso ma non limitato a colture di cellule del sangue periferico, le cellule staminali / progenitrici, e le linee cellulari. I campioni devono essere preparati seguendo la procedura standard per la raccolta di metafasi 3,11-13: impiegando il trattamento Colcemid per arrestare le cellule in metafase, trattamento ipotonico a gonfiare le cellule e fissativo Carnoy di fissare le cellule in sospensione a circa 0,5-1 x 10 6 cellule per ml.
- Pulire il 8-piazza slitta (fornito nel kit OctoChrome, Catalogo #: PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, Regno Unito, figura 2) mediante immersione in etanolo puro per 2 min.
- Prima di effettuare il diapositiva campione, far cadere una piccola quantità di cellule su un vetrino per controllare la densità delle cellule. Se la densità cella è troppo elevato (celle sovrapposte troppi), diluire la sospensione con fissativo fresco. Se la densità cellulare è troppo bassa (cella troppo pochis su slitta), centrifugare le cellule e risospendere in un volume più piccolo di fissativo fresco. Pipettare pl 5-10 di sospensione cellulare in ciascuna delle 8 aree del vetrino template in una sequenza di quadrati alternati 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Una volta i primi due piazze trovi essiccato all'aria, individuare le piazze rimanenti nello stesso modo. Questo impedirà ai spread cellulari di interferire con l'altro.
- La slitta essiccato può essere conservato a -20 ° C in atmosfera di azoto per maggiore di 5 anni prima ibridazione.
2. Localizzazione di metafasi con un sistema automatizzato
- Applicare 20 l di 4 ',6-Diamidino-2-fenilindolo (0,2 mg / ml) al centro di ogni metà della slitta e poi coprire con un coprioggetto.
- Eseguire una scansione automatica del vetrino campione di localizzare le cellule in metafase usando Metafer software (MetaSystems, Altlußheim, Germania). Questo facilita la localizzazione di tutte le metafasi e futuri rivalutazione di tutte le immagini delle cellule.
- Guarda i risultati di scansione ed eliminare manualmente non-metafase artefatti.
3. Ibridazione
- Preparazione del vetrino campione e dispositivo OctoChrome
- Immergere il vetrino campione in tampone 2x SSC a temperatura ambiente per 30 minuti per lavare via DAPI.
- Disidratare il vetrino del campione attraverso una serie di lavaggi con etanolo (2 minuti nel 70%, 85% e 100% etanolo), lasciare asciugare e mettere su un piano di cottura 37 ° C per 5 minuti.
- Posizionare il Multiprobe Camera Chromoprobe Hybridization (fornito nel kit OctoChrome) in un bagno di acqua a 37 ° C e lasciar equilibrare a 37 ° C (+ / - 1 ° C).
- Miscelare la soluzione di ibridazione (fornito nel kit OctoChrome) con ripetute pipettature e pre-riscaldare a 25 microlitri aliquota per dispositivo OctoChrome a 37 ° C.
- Preriscaldare OctoChrome ogni dispositivo (fornito nel kit OctoChrome, vedi figura 2) a 37 ° C posizionando il lato dell'etichetta dispositivo verso il basso su una piastra. NON toccare tche le superfici in rilievo del dispositivo OctoChrome in quanto contengono le sonde.
- Posizionamento del vetrino campione sopra il dispositivo OctoChrome (figura 2)
- Aggiungere 2 pl di pre-riscaldata soluzione di ibridazione a ciascuna delle otto aree sul pre-riscaldato dispositivo OctoChrome mentre rimane a 37 ° C.
- Agitare delicatamente il vetrino sul dispositivo OctoChrome in modo tale che il numero 1, che ora è a testa in giù, si trova sopra la zona alto a destra del dispositivo OctoChrome. Per facilitare la localizzazione di piazza 1, la sua posizione sul dispositivo è stato segnato in Orange.
- Assicurarsi che il vetrino sia ben allineato con le zone corrispondenti sul dispositivo OctoChrome. Abbassare delicatamente il vetrino sopra il dispositivo OctoChrome modo che le gocce di soluzione di ibridazione rendono contatto con la diapositiva. Applica gentile, persino pressione per garantire che la soluzione ibridazione si diffonde ai bordi di ciascuna delle aree in rilievo sul dispositivo OctoChrome.
- Sollevarela slitta / OctoChrome, accuratamente tenendo la fine smerigliato del vetrino, e invertire in modo che la diapositiva è sotto il dispositivo OctoChrome. Assicurarsi che il dispositivo non strisci lungo il vetrino in quanto ciò potrebbe causare la contaminazione incrociata delle sonde.
- Posizionare su un 37 ° C (+ / - 1 ° C) piastra riscaldante per 10 minuti.
- Denaturazione
- Trasferire il dispositivo di scorrimento del campione / OctoChrome alla piastra avendo cura di tenerlo in posizione orizzontale. Assicurarsi che il vetrino campione uniformemente a contatto con la piastra di cottura.
- Denaturare sulla piastra riscaldante a 75 ° C (+ / - 1 ° C) per 5 minuti.
- Ibridazione
- Luogo diapositiva campione / dispositivo OctoChrome alla Camera di ibridazione Chromoprobe Multiprobe.
- Sostituire il coperchio e galleggiare la camera nel 37 ° C (+ / - 1 ° C) bagnomaria (non - agitazione) per una notte. Si prega di notare: NON sigillare il coperchio sulla camera di ibridazione; NON sigillare il coperchio sul bagnomaria; NON ibridarsi in unoincubatore. Questi passaggi sono fondamentali per il controllo dell'umidità.
- Post-ibridazione lavaggi
- Preparazione di soluzioni di lavaggio
Soluzione 1: Preparare un Coplin / Hellendahl contenente 0.4x SSC. Equilibrare a 72 ° C (+ / - 1 ° C) in un bagno d'acqua e regolare il pH a 7,0.
Soluzione 2: Preparare una Coplin / Hellendahl contenente SSC 2x e Tween 20 0,05%. Lasciare riposare a temperatura ambiente. - Rimuovere il dispositivo OctoChrome attenzione dal vetrino e porre il vetrino nella soluzione 1 per 2 minuti.
- Immergere il vetrino nella soluzione 2 per 30 secondi.
4. Montaggio e visualizzazione dei risultati
- Applicare 20 pl di DAPI al centro di ogni metà del il vetrino e applicare un vetrino coprioggetti.
- Incubare al buio per 10 minuti a temperatura ambiente prima vedendo mediante microscopia a fluorescenza.
5. Risultati rappresentativi
FiguRe 3A mostra una cellula normale in metafase Square 2. (1) - (3): i cromosomi 8, 21 e 12 sono state dipinte di rosso, verde e blu, e sono visualizzati attraverso una Red Texas, FITC e DEAC filtro, rispettivamente, (4): Visualizzazione attraverso un DAPI / FITC / Texas Red triplo filtro. In generale, i cromosomi dipinti con blu non sono chiare attraverso il filtro tripla e devono essere viste sotto il filtro specifico DEAC.
Figura 3B mostra rappresentativi cellule anormali con leucemia specifica traslocazione cromosomica e aneuploidia. (1): t (8; 21), una traslocazione cromosomica comune nella leucemia mieloide acuta, (2): Trisomia 21, tre copie del cromosoma 21, uno aneuploidia comune nella leucemia.
Figura 1. Disposizione di combinazioni cromosomiche sul dispositivo OctoChrome e risultati attesi pittura cromosomiche.
Figura 2. Posizionamento del vetrino sul dispositivo OctoChrome.
Figura 3. Risultati rappresentativiottenuto da pesce OctoChrome (Piazza 2).
Figura 3A. Una cellula normale con cromosomi 8, 12, 21 dipinti in Piazza 2.
Figura 3B. Rappresentante cellule anomale con leucemia specifica traslocazione cromosomica e aneuploidia in Piazza 2.
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Discussion
Questo romanzo OctoChrome-FISH test permette di esaminare contemporaneamente tutti i 24 cromosomi umani in una ibridazione solo su una diapositiva. La disposizione delle combinazioni cromosomiche sugli 8 quadrati è stato progettato per facilitare l'identificazione delle non-casuali riarrangiamenti cromosomici nei più comuni leucemie e linfomi. Così, il saggio può rilevare numerico (aneuploidia) nonché strutturali (traslocazioni) alterazioni cromosomiche contemporaneamente.
La fase più critica in questo saggio è controllando l'umidità durante l'ibridazione pernottamento in camera di galleggiamento nel bagnomaria. Le sonde FISH e buffer di ibridazione facilmente asciugare se l'umidità è bassa, o diventare eccessivamente diluito, assorbendo troppa umidità, se l'umidità è alta. In entrambi i casi i risultati potrebbe inficiare i risultati. Una modifica possibile superare questa sfida è quella di sigillare il dispositivo OctoChrome e vetrino con nastro adesivo e ibridare su un 37 °; Piastra C durante la notte nel buio.
Diapositive campione che sono stati di età compresa troppo può essere inadatto per uso in questo saggio direttamente. Mentre digerendo tali campioni con pepsina migliorerà ibridazione, memorizzare diapositive campione preparati in atmosfera di azoto a -20 ° C è fortemente raccomandato per minimizzare invecchiamento.
OctoChrome-FISH è una tecnica promettente per la diagnosi clinica di leucemia e linfoma. E 'anche molto utile per esaminare riarrangiamenti cromosomici più specifici relativi alla leucemia e linfoma umano nelle popolazioni esposte a potenziali e leukemogens lymphomagens e per lo studio delle aneuploidie che inducono effetti delle sostanze chimiche in un cromosoma a livello modo. Il nostro studio precedente CWA usando questa tecnica hanno dimostrato che alcuni cromosomi possono essere più colpita rispetto ad altri 8,10 l'esposizione al benzene, una sostanza chimica industriale di primaria importanza e di un inquinante ambientale ubiquitario che provoca la leucemia umana 14.Questo fenomeno di "aneuploidia selettivo" poteva essere esplorato in altre esposizioni chimiche che utilizzano CWA.
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Disclosures
Non abbiamo nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare il Dott. Cliona M. McHale per criticamente la lettura e la modifica del manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dal National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health concessione R01ES017452 a L Zhang.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
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