Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Chromosomics: Påvisning av numeriske og strukturelle endringer i Alle de 24 menneskelige kromosomer samtidig ved å bruke en Novel OctoChrome FISH Assay

doi: 10.3791/3619 Published: February 6, 2012

Summary

En roman fluorescens

Abstract

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er en teknikk som gjør at spesifikke DNA-sekvenser for å bli oppdaget på metafase eller interfase kromosomer i cellekjerner en. Teknikken benytter DNA prober med unike sekvenser som hybridize til hele kromosomer eller spesifikke kromosomale regioner, og fungerer som en kraftig supplement til klassiske cytogenetikk. For eksempel rapporterte mange tidligere studier hyppig påvisning av økte kromosomavvik i leukemi pasienter knyttet til benzen eksponering, benzen-forgiftning pasientene, og friske arbeidstakere eksponert for benzen, ved hjelp av klassisk cytogenetisk analyse 2. Ved hjelp av FISH har leukemi-spesifikke kromosomale endringer er observert å være forhøyet i tilsynelatende friske arbeidere eksponert for benzen 3-6, indikerer de kritiske roller cytogentic endringer i benzen-indusert leukemogenesis.

Vanligvis undersøker et enkelt FISH analysen bare én eller noen få hele kromosomereller bestemte loci per lysbilde, så flere hybridizations må gjennomføres på flere lysbilder for å dekke alle de menneskelige kromosomer. Spectral karyotyping (SKY) tillater visualisering av hele genomet samtidig, men kravet for spesiell programvare og utstyr grenser sin søknad 7. Her beskriver vi en roman FISH analyse, OctoChrome-fisk, som kan brukes for Chromosomics, som vi definerer her som samtidig analyse av alle de 24 menneskelige kromosomer på ett lysbilde i humane studier, for eksempel kromosom-wide Aneuploidy studie (CWAS) 8. Grunnlaget for metoden, markedsført av Cytocell som Chromoprobe Multiprobe System, er en OctoChrome enhet som er delt inn i 8 ruter, som hver bærer tre forskjellige hele kromosom maleri prober (figur 1). Hver av de tre sonder er direkte merket med en annen farget fluoroforen, grønn (FITC), rød (Texas Red) og blått (kumarin). Ordningen av kromosom kombinasjoner på OctoChrome-enheten er utviklet for å lette identifiseringen av de ikke-tilfeldige strukturelle kromosomfeil endringer (translokasjoner) funnet i de vanligste leukemier og lymfomer, for eksempel t (9; 22), t (15; 17), t (8; 21 ), t (14; 18) 9. Videre kan numeriske endringer (Aneuploidy) i kromosomene bli oppdaget samtidig. Den tilsvarende mal slide er også delt inn i 8 ruter på som metafase spreads er bundet (Figur 2), og er plassert over OctoChrome enheten. De prober og target DNA er denaturert ved høy temperatur og hybridisert i en fuktig kammer, og deretter alle de 24 menneskelige kromosomer kan bli visualisert samtidig.

OctoChrome FISH er en lovende teknikk for den kliniske diagnosen leukemi og lymfom og for påvisning av aneuploidies i alle kromosomene. Vi har søkt denne nye Chromosomic tilnærmingen i en CWAS studie av benzen-eksponerte kinesiske arbeidere 8,10.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Eksempel lysbilde forberedelse

  • OctoChrome FISH er laget for å undersøke kromosomale endringer i metafase spreads av menneskelige celler, inkludert men ikke begrenset til dyrkede perifere blodceller, stamceller / stamceller og cellelinjer. Prøvene bør være forberedt etter standard prosedyre for innhøsting metafaser 3,11-13: ved å ansette colcemid behandling for å arrestere celler i metafase, hypoton behandling for å hovne opp celler, og Carnoy sin fikseringsmiddel for å fikse celler i suspensjon på ca 0,5 til 1 x 10 6 celler per ml.
  • Rengjør 8-plassen lysbilde (gitt i OctoChrome Kit, Katalog #: 803 PMP, Cytocell Ltd, Cambridge, Storbritannia, figur 2) ved å stikke hånden ned ren etanol i 2 min.
  • Før du gjør prøven lysbildet, droppe en liten mengde celler på et lysbilde for å sjekke celle tetthet. Hvis cellen tettheten er for høyt (for mange overlappende celler), fortynn fjæringen med frisk fiksativ. Hvis cellen tettheten er for lav (for få celles på lysbildet), spinn ned cellene og re-suspendere i et mindre volum av fersk bindemiddel. Pipetter 5-10 mL av cellesuspensjon på hver av 8 områder i malen lysbilde i en sekvens av vekslende firkanter 1/7 - 2/8 - 3/5 - 4/6. Når de to første rutene har lufttørket, spot de resterende rutene på samme måte. Dette vil hindre at cellen sprer seg fra å forstyrre hverandre.
  • Den tørkede lysbilde kan oppbevares ved -20 ° C i nitrogen atmosfære i mer enn 5 år før hybridisering.

2. Lokalisering av metafaser bruke et automatisert system

  • Påfør 20 mL av 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (0,2 mikrogram / ml) til sentrum av hver halvdel av lysbildet, og deretter dekke med en dekkglass.
  • Utfør en automatisert skanning av utvalget lysbildet å lokalisere de metafase celler ved hjelp Metafer programvare (MetaSystems, Altlussheim, Tyskland). Dette muliggjør plasseringen av alle metafaser og fremtidige re-evaluering av alle celle bilder.
  • Vis skanning resultatene manuelt og slette ikke-metafase gjenstander.

3. Hybridisering

  1. Tilberedning av prøven raset og OctoChrome enhet
    • Dypp prøven raset i 2x SSC buffer ved romtemperatur i 30 min for å vaske vekk DAPI.
    • Uttørrende prøven skyv gjennom en serie av etanol vask (2 minutter hver i 70%, 85% og 100% etanol), la tørke og sett på en 37 ° C kokeplate i 5 minutter.
    • Plasser Chromoprobe Multiprobe Hybridisering Chamber (forutsatt i OctoChrome Kit) i en 37 ° C vannbad og la til stabilisering til 37 ° C (+ / - 1 ° C).
    • Bland hybridisering løsning (forutsatt i OctoChrome Kit) ved gjentatt pipettering og forvarme en 25 mL delmengde per OctoChrome enhet til 37 ° C.
    • Forvarm hver OctoChrome enhet (forutsatt i OctoChrome Kit, se figur 2) til 37 ° C ved å plassere enheten etikettsiden ned på en kokeplate. IKKE berør than pregede overflater OctoChrome enheten som de inneholder sondene.
  2. Plassering av utvalget gli over den OctoChrome enheten (figur 2)
    • Tilsett 2 mL av forvarmes hybridisering løsning til hver av de åtte områdene på forvarmes OctoChrome enheten mens den fortsatt på 37 ° C.
    • Nøye invertere malen gli over den OctoChrome enheten slik at tallet 1, som nå er opp ned, ligger over øvre høyre side av OctoChrome enheten. For å hjelpe finne rute 1, har sin posisjon på enheten er merket i Orange.
    • Pass på at malen lysbildet er nøye justert med matchende områdene på OctoChrome enheten. Senk gli over den OctoChrome enheten slik at dråper hybridisering løsning få kontakt med raset. Bruk milde, jevnt trykk for å sikre at hybridisering løsningen er spredt ut til kantene av hver av de hevede områdene på OctoChrome enheten.
    • Løftraset / OctoChrome, forsiktig holder frostet slutten av glass-slide, og invertere slik at lysbildet er under OctoChrome enheten. Kontroller at enheten ikke smøre hele malen lysbildet som dette kan føre til krysskontaminering av sonder.
    • Plasser på en 37 ° C (+ / - 1 ° C) kokeplate i 10 minutter.
  3. Denaturering
    • Overfør prøven lysbildet / OctoChrome enheten til kokeplaten ta særlig hensyn til å holde det nivået. Sørg for at prøven slide jevnt kontakter kokeplaten.
    • Denaturerer på kokeplaten ved 75 ° C (+ / - 1 ° C) i 5 minutter.
  4. Hybridisering
    • Plasser prøven lysbilde / OctoChrome enhet i Chromoprobe Multiprobe Hybridisering Chamber.
    • Sett på lokket og flyte kammeret i 37 ° C (+ / - 1 ° C) vannbad (ikke - røring) over natten. Vennligst merk: IKKE forsegle lokket på hybridisering kammeret; Ikke steng lokket på vannbad, IKKE hybridize i eninkubator. Disse trinnene er kritiske til å kontrollere fuktighet.
  5. Post-hybridisering vask
    • Utarbeidelse av vaske-løsninger
      Løsning 1: Forbered en Coplin / Hellendahl krukke inneholder 0.4x SSC. Likevekt til 72 ° C (+ / - 1 ° C) i et vannbad og justere pH til 7,0.
      Løsning 2: Forbered en Coplin / Hellendahl krukke inneholder 2x SSC og 0,05% Tween 20. La det stå i romtemperatur.
    • Fjern OctoChrome enheten forsiktig fra raset og plasser raset i Løsning 1 i 2 minutter.
    • Plasser raset i Løsning 2 i 30 sekunder.

4. Montering og visualisering av resultater

  • Påfør 20 mL av DAPI til sentrum av hver halvdel av lysbildet og bruke en dekkglass.
  • Inkuber i mørke i 10 minutter ved romtemperatur før visning av fluorescens mikroskopi.

5. Representative Resultater

Figure 3A viser en normal metafase celle i Rute 2. (1) - (3): Kromosomer 8, 21 og 12 ble malt rød, grønn og blå, og er visualisert gjennom en Texas Red, FITC, og Deac filter, henholdsvis, (4): Visualisering gjennom en DAPI / FITC / Texas Red trippel filter. Vanligvis kromosomene malt med blått er ikke klart gjennom trippel filter og må sees under det aktuelle Deac filter.

Figur 3B viser representative unormale celler med leukemi-spesifikke kromosomale translokasjon og Aneuploidy. (1): t (8; 21), en vanlig kromosomal translokasjon i akutt myelogen leukemi, (2): 21 trisomi, tre kopier av kromosom 21, ett felles Aneuploidy i leukemi.

Figur 1

Figur 1. Arrangement av kromosom kombinasjoner på OctoChrome enheten og forventede kromosomale maleri resultater.

Figur 2

Figur 2. Posisjonering av prøven gli over den OctoChrome enheten.

Figur 3. Representative resultaterhentet fra OctoChrome FISH (Rute 2).

Figur 3A

Figur 3A. En normal celle med kromosomer 8, 12, 21 malt i Rute 2.

Figur 3B

Figur 3B. Representative unormale celler med leukemi-spesifikke kromosomale translokasjon og Aneuploidy i Rute 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Denne romanen OctoChrome-FISH analysen gjør det mulig å samtidig undersøke alle de 24 menneskelige kromosomer i en enkelt hybridisering på ett lysbilde. Ordningen av kromosom kombinasjoner på de 8 rutene har blitt designet for å lette identifiseringen av de ikke-tilfeldige kromosom rearrangements i de vanligste leukemier og lymfomer. Dermed kan analysen oppdage numerisk (Aneuploidy) samt strukturelle (translokasjoner) kromosomet endringer samtidig.

Den mest kritiske trinnet i denne analysen er å kontrollere fuktigheten under natten hybridisering i flytende kammer i vannbad. De FISH prober og hybridisering buffer lett tørke ut hvis luftfuktigheten er lav, eller blir for tynne ved å absorbere for mye fukt hvis luftfuktigheten er høy. Enten utfallet kunne ha negativ innvirkning på resultatene. En mulig endring overvinne denne utfordringen er å forsegle OctoChrome enheten og prøve lysbilde med tape og hybridize på en 37 °; C kokeplate i mørke natten.

Smak lysbilder som er i alderen for mye kan være uegnet for bruk i denne analysen direkte. Mens fordøye slike prøver med pepsin vil forbedre hybridisering, lagring preparerte eksempler lysbilder i en nitrogen atmosfære ved -20 ° C anbefales sterkt å minimere aldring.

OctoChrome-FISH er en lovende teknikk for den kliniske diagnosen leukemi og lymfom. Det er også svært nyttig for å undersøke mest spesifikke kromosomale rearrangements knyttet til menneskelig leukemi og lymfom i populasjoner utsatt for potensielle leukemogens og lymphomagens og for å studere Aneuploidy-induserende effekten av kjemikalier i et kromosom-bred måte. Vår forrige CWAS undersøkelse ved hjelp av denne teknikken demonstrert at enkelte kromosomer kan være mer berørt enn andre ved eksponering for 8,10 benzen, en primær industriell kjemisk og en allestedsnærværende miljøgift som fører til menneskelig leukemi 14.Dette fenomenet "selektiv Aneuploidy" kan bli undersøkt i andre kjemiske eksponeringer med CWAS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker å takke dr. Cliona M. McHale for kritisk lesing og redigering av manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av National Institute of Environmental Health Sciences, National Institute of Health stipend R01ES017452 til L Zhang.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
OctoChrome Kit Cytocell Ltd. PMP 803
phytohaemagglutinin (PHA) Invitrogen 10576-015
Colcemid Invitrogen 15212-012
Carnoy’s fixative Methanol : glacial acetic acid = 3: 1
Fluorescence microscope Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously
Metafer software MetaSystems, Altlussheim, Germany Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
  2. Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
  3. Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
  4. Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
  5. Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
  6. Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
  7. Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
  8. Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
  9. Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
  10. Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. 153-154 (2005).
  11. Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. Raven Press. 17-30 (1991).
  12. Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
  13. Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
  14. Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
Chromosomics: Påvisning av numeriske og strukturelle endringer i Alle de 24 menneskelige kromosomer samtidig ved å bruke en Novel OctoChrome FISH Assay
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay. J. Vis. Exp. (60), e3619, doi:10.3791/3619 (2012).More

Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay. J. Vis. Exp. (60), e3619, doi:10.3791/3619 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter