Summary
Bir roman floresans
Abstract
Floresan in situ hibridizasyon (FISH), spesifik DNA dizilerinin hücre çekirdekleri 1 metafaz veya interfaz kromozomlar üzerinde tespit edilmesini sağlayan bir tekniktir. Tekniği, tüm kromozom ya da belirli kromozomal bölgeler melezler eşsiz dizileri ile DNA probları kullanır ve klasik sitogenetik güçlü bir yardımcı olarak hizmet vermektedir. Örneğin, çok daha önceki çalışmalarda, klasik sitogenetik analiz 2 kullanılarak, benzen maruz kalma, benzen zehirlenmesi hasta ve benzen maruz sağlıklı işçi ile ilgili lösemi hastalarında artmış kromozom anormallikleri sık algılama bildirdi. BALIK kullanarak, lösemi-spesifik kromozomal değişiklikler, benzen kaynaklı lökomogenezisin cytogentic değişikliklerin kritik rolleri belirten, benzen 3-6 maruz görünüşte sağlıklı işçiler yükselmiş olduğu gözlenmiştir.
Genellikle olarak,,, bir tek bir bir FISH assay inceliyor,, yalnızca birini ya da, bir birkaç bir tamamını chromosomes ileveya slayt başına belirli lokusları, birden çok hibridizasyonları birden çok slayt insan kromozomlarının tümünü kapsayacak şekilde yürütülmesi gerekir. Spektral karyotip (SKY), aynı anda tüm genom görselleştirme, ancak özel bir yazılım ve donanım limitlerini uygulama 7 için gereksinimi sağlar. Burada, bir roman FISH testi, kromozom çapında anöploidi çalışma olarak insan çalışmaları, bir slayt tüm 24 insan kromozomlarının eşzamanlı analizi (CWAS) olarak tanımlayan Chromosomics için, uygulanabilir OctoChrome-BALIK, tarif 8. ,,,,, Chromoprobe Multiprobe System olarak Cytocell kullanıcısı tarafından pazarlanan yöntemini,, of temelinde,,,,,,,, üç farklı bir bir tamamını chromosome painting probları (Figure sık kullanılan 1) taşır her biri hangi 8 küçük kareler, içine bölünmüş edilir, bir OctoChrome bir aygıt konumundadır. Her üç probları doğrudan farklı bir renkli florofor yeşil (FITC), kırmızı (Texas Kırmızı) ve mavi (KUMARİN) ile etiketlenmiştir. Kromozom kombinasyonlarının OctoChrom düzenleme,,, t (15,; 17), t (8; 21 e-aygıt;,, örneğine t (22 9,) için,,,, en çok,, ortak bir lösemilerin ve lenfomalarin in bulundu non-rasgele bir bir bir,,, yapısal chromosome değişikler (translakosyon belirlenmiş) of olduğunda kimlik tespitinin kolaylaştırılması için olarak tasarlanmış olmuştur ), t (14; 18) 9 izlediği görülmüştür. Ayrıca, kromozomlardaki sayısal değişiklikleri (anöploidi) aynı anda tespit edilebilir. The karşılık gelen bir şablon slaydın,, aynı zamanda, 8 küçük kareler içine metafaz spreadler bağlıdırlar (Figure 2), ve,, OctoChrome bir aygıt üzerinden konumlandırılmış edilir hangi üzerine: bölünmüş edilir. Prob ve hedef DNA yüksek sıcaklık ve nemli bir odasında melezleşmiştir denatüre olup, daha sonra 24 insan kromozomlarının aynı anda görüntülenebilmekte.
OctoChrome BALIK lösemi ve lenfoma klinik teşhis ve bütün kromozomlarda anöploidiler tespit için gelecek vaat eden bir tekniktir. Biz, benzen maruz kalan Çinli işçilerin 8,10 CWAS çalışmada bu yeni kromozomal yaklaşım uyguladık.
Protocol
1. Örnek slayt hazırlama
- OctoChrome FISH,,,, de dahil olmak üzere,, insan hücreleri, of metafaz spreadler in chromosomal değişiklikleri incelemek etmek olarak tasarlanmış, ancak,, kültürlü periferik kan hücreleri,, stem / progenitor hücreleri, ve hücre hatları etmek sınırlıdır değil edilir. Örnekleri hazırlanan metafaz 3,11-13 hasat için standart bir prosedür takip edilmelidir: hücreleri şişmeye metafaz, hipotonik tedavi hücreleri tutuklamak için colcemid tedavi istihdam ederek ve yaklaşık 0.5-1 x 10 6 hücre süspansiyon hücreleri gidermek için Carnoy Kullanıcı sabitleştirici ml başına.
- 2 dakika süreyle saf etanol içine daldırma: 8-kare slayt (PMP 803, Cytocell Ltd, Cambridge, İngiltere, Şekil 2 OctoChrome Takımı, Katalog # sağlanan) temizleyin.
- ,, Numune slaydın yaptıktan etmeden önce,,, hücre yoğunluğu, ogrenmek etmek en az,,, bir slayt üzerine hücreleri of, bir küçük bir bir miktarını düşürmeyin. ,, Hücre yoğunluğu,,, yüksek çok (çok olarak pek çok üst üste binen hücreleri) konumundadır varsa,, taze fixative,, ile birlikte süspansiyon seyreltmeyin. Hücre dansiteli, çok (çok az sayıda hücre çok, düşük konumundadır ayarlanmıştır ederse,,Slaytta ler), hücreleri aşağı spin ve taze fixative daha küçük bir hacim yeniden askıya. ,,,: Şablon slaydın:,, - 2/8 - 3/5 - 4/6 küçük kareler 1/7 alternan of, bir sekansı in of 8 alanlarda of her biri üzerine hücre süspansiyon of Pipette 5-10 mikrolitre. ,, Olanlar önce iki adet küçük kareler air-kurutulmuş sahiptir Once,,,, İçerikler aynı bir tarzda in geriye kalan küçük kareler belirleyilme. Bu, işlem,,,, engellemesini ile birlikte her biri, diğer, from hücre spreadler önlemek edecektir.
- Kurutulmuş bir slaydın,, göre daha daha büyük bir hybridization daha önce 5 yaşından için,,,, nitrojen gaz atmosferinde in -20 ° C at depolanan uygulanmaz edebilirsiniz.
2. Bir otomasyon sistemi kullanılarak metafaz lokalizasyonu
- ,,, The slide of her biri yarım of center etmek olarak, 4 of 20, mikrolitre ',6-diokso-diamidino-2-fenilindol (0,2 ug / ml' '), Apply (Uygula) ve sonra da, bir coverslip ile birlikte kapsamaz.
- Metafaz hücreleri Metafer yazılım, (MetaSystems, Altlussheim, Almanya) kullanılarak yerelleştirilmesine örnek slayt otomatik bir tarama gerçekleştirin. Bu, tüm metafaz ve gelecekteki tüm cep görüntülerin yeniden değerlendirme yerini kolaylaştırır.
- Elle tarama sonuçları ve non-metafaz eserler silin.
3. Melezleme
- Hazırlanması, örnek slayt ve OctoChrome cihaz
- , DAPI kadar uzak: yıkamak etmek 30, min, için: numune slaydın:,, oda sıcaklığında at internetin türü 2x SSC buffer ile in daldırınız.
- Etanol yıkar (2% 70 dakika, her biri% 85 ve% 100 etanol) bir dizi örnek slayt kurutmak, kuru ve 5 dakika 37 ° C ocak yerleştirmek için izin verir.
- ,,,, Bir (37) ° C su bath: in Chromoprobe Multiprobe: Hibridizasyon kullanılan kullanılan Chamber (OctoChrome bir Kit in sağlanan.) Yerleştirin ve Bir olmak üzere 37 dengelenmeye etmek bu izin vermek.. ° C (, + / - 1 ° C).
- 37 ° C pipetleme ve Tekrarlayan OctoChrome cihaz başına ön-sıcak 25 ul tablet bir hibridizasyon çözüm (OctoChrome Kit) karıştırın.
- Ön sıcak her OctoChrome bir cihaz 37 ° C cihaz etiket tarafı aşağı bir ocak koyarak (OctoChrome Kit sağlanan bkz. Şekil 2). T dokunmayın VERMEYİNkabartma yüzeyler o OctoChrome cihazın probları içerdiği gibi.
- OctoChrome cihaz üzerinden örnek slayt Konumlandırma (Şekil 2)
- It, 37 adresindeki - retmekte iken,,,, pre-ılındırılmış bir bir OctoChrome aygıt on sekiz adet alanlarda of her biri etmek,,, pre-ılındırılmış bir hybridization bir çözüm of 2 mikrolitre ekle ° C..
- Şimdi baş aşağı 1 numara, OctoChrome cihazın sağ üst el alan üzerinde bulunan böyle OctoChrome cihaz üzerinden şablon slayt dikkatlice ters çevirin. Kare 1 bulmalarına yardımcı olmak için, cihazın konumunu Orange işaretlendi.
- Şablon slayt dikkatlice OctoChrome cihaz eşleşen alanları ile uyumlu olduğundan emin olun. , Hibridizasyon çözüm damla slayt temas yapmak o kadar dikkatle OctoChrome cihaz üzerinden slayt indirin. Nazik bir Uygula'yı,, hatta,,,, hybridization bir çözüm,,,,, OctoChrome bir aygıt on raised alanlarda of her biri of kenarlarını etmek yayıldı edilir olduğunu, yürütülmesini sağlamak etmek zorlamak.
- Asansörslayt / OctoChrome, cam slayt dikkatlice buzlu ucunu tutarak ve slayt OctoChrome cihazın altında olduğunu bu nedenle ters. Bu, problar çapraz kontaminasyona neden olabilir cihaz şablon slaytta smear değil emin olun.
- , Bir (37) on Yer. ° C (+ / - 1. ° C),, 10 dakikada bir için ocak gözünün.
- Denatürasyon
- Özellikle dikkat çekici bir seviyede tutmanıza ocak için örnek slayt / OctoChrome cihaza aktarın. Örnek slayt eşit ocak gözü rehber olun.
- ,, 75 at ocak gözünün on denatüre. ° C (, + / - 1 ° C.),, 5 dakika öncesinden için.
- Melezleme
- Chromoprobe Multiprobe Hibridizasyon Odası Yeri örnek slayt / OctoChrome cihaz.
- Kapağını değiştirin ve 37 odası float ° C (+ / - 1 ° C) su banyosunda (karıştırma) gece. Lütfen dikkat: hibridizasyon odasında kapak mühür YAPMAYIN; kapağı su banyosu mühür YAPMAYIN; bir melezleşme VERMEYİNinkübatör. Bu adımlar, nem kontrolü için kritik öneme sahiptir.
- Post-hibridizasyon yıkar
- , Wash çözümleri of Hazırlanışı
Çözüm 1:, 0.4x SSC içeren bir Coplin / Hellendahl kavanoz hazırlayın. Ile 72 dengelenmeye. ° C (+ / - 1 ° C ile),, bir su bath in ve, 7.0 'ye pH değeri ayarlamak görüntüle.
Çözüm 2: 2x SSC ve% 0.05 Tween 20 içeren bir Coplin / Hellendahl kavanoz hazırlayın. Oda sıcaklığında bekletin. - , Slayt dikkatle OctoChrome bir cihaz çıkarın ve 2 dakika Çözüm 1 slayt yerleştirin.
- Çözüm 2 30 saniye boyunca slayt yerleştirin.
4. Montaj ve sonuçların görselleştirme
- ,, The slide of her biri yarım of center etmek,, 20, mikrolitre of DAPI, Apply (Uygula) ve, bir coverslip uyguladıktan tıklayın.
- ,,, Floresans mikroskopi kullanıcısı tarafından inceleyen ziyaretçilerin etmeden önce,, (azından 10) room sıcaklık dakika için koyu renk in inkübe edin.
5. Temsilcisi Sonuçlar
Figure 3A için,,,, Meydanı'na 2 in, bir tarafindan: Normal bir bir bir metafaz hücre gösterir. (1) - (3):, Kromozomlar 8, 21 ve 12 kırmızı, yeşil ve mavi boyalı, ve sırasıyla Texas Kırmızı, FITC ve Deac filtre ile görüntülenir; (4): / DAPI / FITC ile Görselleştirme Texas Red üçlü filtre. Genellikle, mavi ile boyanmış kromozom üçlü filtre ile net değil ve özel Deac altında filtre izlenmesi gerekir.
Şekil 3B, lösemi-spesifik kromozomal translokasyon ve anöploidi temsili anormal hücreler gösterir. (1): t (8; 21), akut myeloid lösemi sık görülen bir kromozom translokasyonu; (2): Trizomi 21, 21 kromozom, lösemi ortak bir anöploidi üç nüsha.
Şekil 1. kromozom kombinasyonları OctoChrome cihaz ve beklenen kromozomal boyama sonuçları Düzenlenmesi.
Şekil 2 OctoChrome cihaz üzerinden örnek slayt Konumlandırma.
Figure 3.: Temsilcisi sonuçlarOctoChrome BALIK (Kare 2) elde edilmiştir.
Bir Figure 3A için bu alanı kullanabilirsiniz. Meydanı'na 2 'in boyalı 12,, 21 chromosomes 8, ile ile birlikte A tarafindan: Normal bir bir bir hücre.
Şekil 3B Meydanı 2 lösemi-spesifik kromozomal translokasyon ve anöploidi Temsilcisi anormal hücreler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu roman OctoChrome-FISH testi, aynı anda tek bir slayt tek bir hibridizasyon Tüm 24 insan kromozomlarını incelemek için olanak sağlar. ,, 8 küçük kareler on chromosome kombinasyonları of aranjman,,,,,,, en çok,, ortak bir lösemilerin ve lenfomalarin in non bir-rasgele bir bir bir chromosome Çevrilmeler of tanımlama kolaylaştırmak etmek olarak tasarlanmış> edilmiştir> gelmiştir. Böylece, deney aynı zamanda sayısal (anöploidi) yanı sıra yapısal (translokasyonlar) kromozom değişiklikleri algılayabilir.
,,, Bu assay in en çok kritik bir bir adım,,,,,, su bath in kayan bir odacık in bir gecede bir bir hybridization sırasında bir nem oranı kontrolünde edilir. Nem oranı düşük ise FISH probları ve hibridizasyon tamponu kolayca kurumasına ya da nem oranı yüksek ise çok çok fazla nem emici tarafından sulandırmak haline. Ya sonuç olumsuz sonuçları etkileyebilir. Bu zorluğun üstesinden gelmek için olası bir değişiklik bant ile OctoChrome bir cihaz ve örnek slayt mühür ve 37 ° melezleşmeKaranlık gecede C ocak.
,, Çok fazla yaşları arasındaki> edilmiştir> adres Sample slaytları değerler,,,, doğrudan doğruya, bu assay in kullanımını için elverişsiz olabilir olabilir. Pepsin ile bu tür numunelerin sindirerek azot atmosferi -20 Hazırlanan örnek slaytlarını depolamak, melezleme artıracak ° C güçlü bir yaşlanma en aza indirmek için tavsiye edilir.
OctoChrome-FISH, lösemi ve lenfoma klinik tanısı için umut vaat eden bir tekniktir. Ayrıca maruz kalan potansiyel leukemogens ve lymphomagens toplumlarda ve bir kromozom geniş bir şekilde kimyasal anöploidi uyaran etkilerini araştırmak için insan lösemi ve lenfoma ile ilgili en özel kromozomların yeniden düzenlemeleri incelemek için çok yararlıdır. Bu tekniği kullanarak önceki CWAS çalışmada belirli kromozomlarda benzen 8,10, bir ilköğretim endüstriyel kimyasal ve insan lösemi 14 neden olan bir yerde çevre kirletici maruz diğerlerine göre daha fazla etkilenmiş olabileceğini göstermiştir., "Seçici anöploidisi" Bu fenomen diğer kimyasal maddelere CWAS kullanılarak araştırılmalıdır olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa şey var.
Acknowledgments
Yazarların eleştirel okuma ve el yazması düzenleme için Dr. Cliona M. McHale teşekkür etmek istiyoruz. Bu çalışma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri, L Zhang Sağlığı Hibe R01ES017452 bölgesinin Enstitüsü Ulusal Enstitüsü tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| OctoChrome Kit | Cytocell Ltd. | PMP 803 | |
| phytohaemagglutinin (PHA) | Invitrogen | 10576-015 | |
| Colcemid | Invitrogen | 15212-012 | |
| Carnoy’s fixative | Methanol : glacial acetic acid = 3: 1 | ||
| Fluorescence microscope | Equipped with filters to view DAPI, Texas Red, FITC, and Coumarin spectra individually and a DAPI/FITC/Texas Red triple filter to view different colors simultaneously | ||
| Metafer software | MetaSystems, Altlussheim, Germany | Facilitate to locate all metaphases and to re-evaluate the abnormalities |
References
- Levsky, J. M., Singer, R. H. Fluorescence in situ hybridization: past, present and future. J. Cell. Sci. 116, 2833-2838 (2003).
- Zhang, L., Eastmond, D. A., Smith, M. T. The nature of chromosomal aberrations detected in humans exposed to benzene. Crit. Rev. Toxicol. 32, 1-42 (2002).
- Zhang, L. Aberrations in chromosomes associated with lymphoma and therapy-related leukemia in benzene-exposed workers. Environ. Mol. Mutagen. 48, 467-474 (2007).
- Zhang, L. Benzene increases aneuploidy in the lymphocytes of exposed workers: a comparison of data obtained by fluorescence in situ hybridization in interphase and metaphase. Environ. Mol. Mutagen. 34, 260-268 (1999).
- Zhang, L. Increased aneusomy and long arm deletion of chromosomes 5 and 7 in the lymphocytes of Chinese workers exposed to benzene. Carcinogenesis. 19, 1955-1961 (1998).
- Smith, M. T. Increased translocations and aneusomy in chromosomes 8 and 21 among workers exposed to benzene. Cancer. Res. 58, 2176-2181 (1998).
- Bayani, J., Squire, J. A. Advances in the detection of chromosomal aberrations using spectral karyotyping. Clin. Genet. 59, 65-73 (2001).
- Zhang, L. Chromosome-wide aneuploidy study (CWAS) in workers exposed to an established leukemogen, benzene. Carcinogenesis. 32, 605-612 (2011).
- Rowley, J. D. The role of chromosome translocations in leukemogenesis. Semin. Hematol. 36, 59-72 (1999).
- Zhang, L. Use of OctoChrome fluorescence in situ hybridization to detect specific aneuploidy among all 24 chromosomes in benzene-exposed workers. Chem. Biol. Interact. , 153-154 (2005).
- Barch, M. J., Lawce, H. J., Arsham, M. S. In The ACT cytogenetics laboratory. Barch, M. J. , Raven Press. 17-30 (1991).
- Zhang, L., Yang, W., Hubbard, A. E., Smith, M. T. Nonrandom aneuploidy of chromosomes 1, 5, 6, 7, 8, 9, 11, 12, and 21 induced by the benzene metabolites hydroquinone and benzenetriol. Environ. Mol. Mutagen. 45, 388-396 (2005).
- Smith, M. T. Hydroquinone, a benzene metabolite, increases the level of aneusomy of chromosomes 7 and 8 in human CD34-positive blood progenitor cells. Carcinogenesis. 21, 1485-1490 (2000).
- Smith, M. T. Advances in understanding benzene health effects and susceptibility. Annu. Rev. Public. Health. 31, 133-148 (2010).
