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Neuroscience

Neuronal morphogenesis के अध्ययन के लिए तरीके: doi: 10.3791/3621 Published: May 18, 2012

Summary

प्रमस्तिष्क प्रांतस्था के विकास में जीन के समारोह की एक तेजी से मूल्यांकन आचरण करने के लिए, हम शामिल विधियों का वर्णन

Abstract

प्रमस्तिष्क प्रांतस्था उच्च संज्ञानात्मक कार्यों का निर्देशन. यह छह स्तरित संरचना एक के अंदर पहले, बाहर पिछले तरीके, जिसमें पहले जन्म न्यूरॉन्स निलय के करीब रहते हुए पिछले जन्म न्यूरॉन्स 1 मस्तिष्क की सतह की दिशा में पहला जन्म न्यूरॉन्स अतीत की ओर पलायन में उत्पन्न होता है. Neuronal 2 प्रवास के अलावा, सामान्य cortical समारोह के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया neuronal 3 morphogenesis के विनियमन है. जबकि neuronal morphogenesis प्राथमिक संस्कृतियों में इन विट्रो में अध्ययन किया जा सकता है, वहाँ कैसे इन प्रक्रियाओं ऊतक वातावरण में विनियमित रहे हैं से सीखा जा के लिए बहुत कुछ है.

हम तकनीक का वर्णन neuronal प्रवास और / या के मस्तिष्क प्रांतस्था 4,6 organotypic स्लाइस में morphogenesis का विश्लेषण. एक pSilencer संशोधित वेक्टर प्रयोग किया जाता है जो दोनों एक U6 प्रमोटर है कि डबल असहाय बाल के लिये कांटा शाही सेना ड्राइव और एक अलग अभिव्यक्ति कैसेट कि GFP प्रोटीन encodes ख संचालित होता हैया सीएमवी 7-9 प्रमोटर. हमारा दृष्टिकोण उम्मीदवार जीनों की विशिष्ट पछाड़ना पर neurite परिणाम में दोषों के तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है और सफलतापूर्वक neurite 8 परिणाम के नियामकों के लिए एक स्क्रीन में इस्तेमाल किया गया है. क्योंकि केवल कोशिकाओं के एक सबसेट आरएनएआई constructs व्यक्त करेंगे, organotypic स्लाइस संभावित phenotypes की एक मोज़ेक विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं. इसके अलावा, क्योंकि यह विश्लेषण vivo वातावरण में एक के पास सन्निकटन में किया जाता है, यह एक कम लागत प्रदान करता है और अज्ञात cortical समारोह के जीन के लिए ट्रांसजेनिक या पीटा जानवरों की पीढ़ी के लिए तेजी से वैकल्पिक है. अंत में, vivo electroporation प्रौद्योगिकी के साथ तुलना में, पूर्व vivo electroporation प्रयोगों की सफलता कुशल सर्जरी कौशल विकास पर निर्भर नहीं है और एक छोटा प्रशिक्षण समय और कौशल के साथ प्रदर्शन किया जा सकता है.

Protocol

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1. संस्कृति समाधान और मीडिया (वीडियो में नहीं) की तैयारी

  1. पूरा हांक संतुलित नमक (HbSS) समाधान, 1x HbSS, 2.5 मिमी Hepes (pH7.4), 30 मिमी डी ग्लूकोज, 1 मिमी 2 CaCl, 1 मिमी 4 MgSO और 4 मिमी 3 NaHCO युक्त 1 लीटर तैयार. दोहरा आसुत जल (DDH 2 हे) जोड़ें. एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर और 4 बजे दुकान डिग्री सेल्सियस के साथ बाँझ फ़िल्टर
  2. टुकड़ा संस्कृति मध्यम बेसल मध्यम ईगल मीडिया के 35 एमएल का उपयोग पूरी HbSS 12.9 एमएल 20 मिमी D ग्लूकोज (1 एम समाधान के 1.35 एमएल), 1 मिमी Glutamax है (एक 200 मिमी समाधान के 0.25 एमएल), पेनिसिलीन के 0.5 मिलीग्राम तैयार स्ट्रेप्टोमाइसिन-100x स्टॉक. 0.2 माइक्रोन फिल्टर के साथ बाँझ फ़िल्टर, तो गर्मी निष्क्रिय 5% की एक अंतिम एकाग्रता सीरम घोड़ा जोड़ें.
  3. 1 मिलीग्राम / एमएल laminin स्टॉक समाधान बाँझ आसुत विआयनीकृत पानी के साथ बनाने laminin काम कर समाधान तैयार. 0.5 एमएल Eppendorf ट्यूबों में 100 μL aliquots तैयार और -80 पर स्थिर डिग्री सेल्सियस
  4. पाली - एल Lysine काम इतना तैयारपाली एल Lysine 5 मिलीग्राम बाँझ एच 2 हे 5 एमएल जोड़ने के लिए 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान बनाने के द्वारा lution. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 एमएल aliquots और फ्रीज की तैयारी
  5. बाँझ पानी के साथ 12 एमएल की अंतिम मात्रा करने के लिए पाली एल Lysine 1 एमएल और laminin की 100 μL गिराए द्वारा कोटिंग समाधान तैयार. हर बार नए सिरे से इस समाधान करें.

2. Organotypic स्लाइस आवेषण (वीडियो में) की तैयारी

  1. एक संस्कृति के प्रति डालने बाँझ संदंश का उपयोग कर के साथ दो छह अच्छी तरह प्लेटें तैयार करते हैं. संस्कृति आवेषण नीचे 2 एमएल बाँझ DDH 2 हे जोड़ें.
  2. देखभाल झिल्ली लेने पंचर झिल्ली के शीर्ष पर कोटिंग समाधान के 1 एमएल जोड़ें. 37 में एक humidified इनक्यूबेटर में रातोंरात सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
  3. कोटिंग मीडिया निकालें और बाँझ एच 2 0 तीन बार के साथ झिल्ली धोना. शुष्क आवेषण के उपयोग करने से पहले करते हैं. टुकड़ा संस्कृति और 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में मध्यम जगह की 1.8 एमएल जोड़ें. Parafilm साथ अप्रयुक्त प्लेटें लपेटेंऔर डिग्री सेल्सियस 4 में 4 सप्ताह तक के लिए दुकान.

3. Electroporation के लिए तैयार नहीं है (वीडियो में)

  1. आरएनएआई constructs electroporation के लिए तैयार करते हैं. डबल किनारा शाही सेना बाल के लिये कांटा आवेषण एक pSilencer वेक्टर में क्लोन किया गया. प्लाज्मिड शामिल हैं: 1) एक U6 प्रमोटर है कि डबल किनारा शाही सेना पीढ़ी ड्राइव, और 2) एक GFP अभिव्यक्ति कैसेट सीएमवी 8,9 प्रमोटर द्वारा संचालित. यह प्लाज्मिड पहले Konishi और उनके सहयोगियों ने 9 और 7,8 दूसरों के द्वारा वर्णित किया गया है. प्लास्मिड क्विएज़न मैक्सी - प्रस्तुत करने का किट का उपयोग कर शुद्ध कर रहे हैं, और 1 मिलीग्राम / एमएल की एकाग्रता में इस्तेमाल किया.
  2. आदेश में डीएनए कल्पना करने के लिए जबकि यह इंजेक्शन, एक 0.5% तेजी से हरे रंग के समाधान तैयार है और 1:20 पर (आमतौर पर तेजी से हरे रंग की 1 μL के साथ 20 μL) डीएनए के इंजेक्शन जा डीएनए के साथ उपयोग. डीएनए पर वाम तेजी से हरे रंग के मिश्रण के लिए एक सप्ताह के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है.
  3. साफ़ विच्छेदन क्षेत्र, dissecti कीएनजी उपकरण और 70% इथेनॉल के साथ vibratome पोत. पूर्ण HbSS चिल इतना है कि यह बर्फ ठंडा है. सर्द यह चारों ओर बर्फ के vibratome अंदर कुछ पानी के साथ तेजी से ठंडा करने के लिए पैकिंग के के द्वारा vibratome पोत. 3% कम पिघल बिंदु agarose तैयार पूरा HbSS का उपयोग. 1 मिनट के लिए माइक्रोवेव. उबलते अधिक से बचें. का उपयोग करें जब तक एक 42 डिग्री सेल्सियस waterbath में रखें.
  4. Electroporation पैरामीटर के रूप में स्थापित कर रहे हैं. एक E15 भ्रूण का उपयोग 35 वी के लिए, 5 दालों, 100 एमएस लंबाई, 900 दालों के बीच अंतराल एमएस. बड़े जानवरों के लिए, electroporation सुनिश्चित करने के लिए, उच्च वोल्टेज का उपयोग 50 वी या दालों की संख्या बढ़ाने के 8 दालों. छोटे जानवरों में ऊतकों को नुकसान पहुँचाए को रोकने के लिए, या तो कम या करने के लिए 2 दालों दालों और कम वोल्टेज का उपयोग 25 तक वी. इन मानकों और विविध empirically पशु की उम्र पर निर्भर करता है निर्धारित किया जा सकता है.

4. विच्छेदन और electroporation (वीडियो में)

  1. एक गर्भवती महिला euthanizing के बाद, भ्रूण ठंड बर्फ पूरी HbSS में काटना. केउनके व्यक्तिगत अपरा थैलियों में प्रत्येक भ्रूण Ep.
  2. भ्रूण काटना और पहली पृष्ठवंश के बाद सिर काट दिया. बर्फ ठंड पूरा HbSS में रखें.
  3. इंजेक्शन के लिए, एक पेट्री डिश के ऊपर पर Parafilm के एक टुकड़े पर सिर जगह है. तीसरे निलय के माध्यम से तेजी से हरे रंग मिश्रण क्रम में cortical में vesicles दोनों पार्श्व ventricles में भरने: कस्टम हैमिल्टन सिरिंज का प्रयोग (टेबल मैं देखें) डीएनए के बारे में 6 से 8 μL इंजेक्षन बनाया है. वैकल्पिक रूप से, प्रत्येक पार्श्व निलय में इंजेक्शन सीधे किया जा सकता है.
  4. पूर्व vivo electroporation के लिए, BTX चिमटी से नोचना प्लैटिनम इलेक्ट्रोड का उपयोग करें. आप के पृष्ठीय प्रांतस्था के लिए सिर की यानी शीर्ष electroporate के प्रांतस्था की तरफ सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखें.
  5. Electroporation के बाद, विदारक पहले कम से कम 5 मिनट के लिए बर्फ पर सिर सेते हैं.
  6. बर्फ के ठंडे HBSSby सिर के किनारे पर एक छोटा सा चीरा बनाने और सिर के पक्ष बंद त्वचा छीलने में दिमाग काटना. अगला, साथठीक धीरे छील दूर संदंश मस्तिष्क से पिया. खोपड़ी से बरकरार मस्तिष्क निकालें, देखभाल करने के लिए प्रांतस्था नुकसान नहीं है.

5. एम्बेड और Electroporated cortices की सेक्शनिंग (वीडियो में)

  1. बर्फ पर रखा एक बड़े मोल्ड में 3% कम पिघल बिंदु agarose स्थानांतरण. आचारण के नीचे करने के लिए तेजी से जो आचारण के नीचे करने के लिए नीचे डूब से दिमाग को रोकने जाएगा जमना शुरू कर देंगे. धीरे ठीक अतिरिक्त बफर एक Kimwipe या फिल्टर पेपर के साथ हटाने के बाद से एक संदंश के साथ दिमाग हस्तांतरण. मोल्ड के अंदर दिमाग ज़ुल्फ़ के लिए एक 10 μL pipet टिप का उपयोग करें के agarose और मस्तिष्क के ऊतकों के बीच अधिकतम इंटरफ़ेस सुनिश्चित करने के लिए.
  2. ओरिएंट सब दिमाग सुनिश्चित दिमाग एक ही उन्मुखीकरण में और के बारे में agarose में एक ही स्तर पर हैं. Agarose के बारे में 5 मिनट के लिए जमना. Agarose ब्लॉक ताकि घ्राण बल्ब खड़े कर रहे हैं संलग्न संबंध चिपकने वाला पागल गोंद का उपयोग करें. एक बार ब्लॉक जुड़े होते हैं, मैं तुरंत जोड़CE के ठंड HbSS और ट्रिम करने के लिए सुनिश्चित करें कि व्यक्तिगत स्लाइस बनाना agarose प्रत्येक मस्तिष्क के लिए प्राप्त कर रहे हैं.
  3. ब्लॉक टुकड़ा, एक कम गति (आधा अधिकतम के बारे में) vibratome वेग सेट और उच्चतम सेटिंग में ब्लेड कंपन आवृत्ति सेट. 250 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक स्लाइस उत्पन्न करता है. एक तुला ठीक रंग का उपयोग स्लाइसें निकालें और उन्हें ऊतक कुओं के लिए एक ठीक ब्रश या संदंश के साथ हस्तांतरण.
  4. टिशू कल्चर हुड में, लेपित आवेषण में स्लाइस हस्तांतरण. प्रत्येक डालने के लिए टुकड़ा संस्कृति मीडिया की 500 μL जोड़ें करने के लिए स्थानांतरण को आसान बनाने के लिए. 5 स्लाइसें डालने के प्रति रखा जा सकता है. स्लाइस के ऊपर से अधिक मीडिया निकालें और 37 डिग्री humidified इनक्यूबेटर में सी सेते हैं.

6. संस्कृति और Organotypic स्लाइस की विश्लेषण (वीडियो में)

  1. आदेश में स्वस्थ स्लाइस को बनाए रखने के लिए, ताजा मीडिया हर बार मीडिया के आधे की जगह द्वारा झिल्ली के नीचे कम से कम हर दूसरे दिन किया जाना चाहिए.
  2. आदेश में घ के बाद स्लाइस का विश्लेषण करने के लिएसंस्कृति में esired दिनों झिल्ली में स्लाइस को ठीक करें. 37 में के 1x फॉस्फेट खारा बफर (पीबीएस) के साथ 10 मिनट प्रत्येक समय के लिए डिग्री सेल्सियस तीन बार धो लें. अगले, 4% Paraformaldehyde की (पीएफए) के साथ रात को ठीक डिग्री सेल्सियस 4 पर या कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए.
  3. स्लाइस अलग सेलुलर मार्कर के साथ विश्लेषण किया जा सकता है या Hoechst साथ अकेला दाग लिए electroporated और गैर electroporated के कोशिकाओं कल्पना. Permeabilize और 10% बकरी सीरम, कोमल मिलाते के साथ 1x पीबीएस में 0.1% नरमीन के साथ कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए स्लाइस ब्लॉक.
  4. Hoechst के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए दाग, कोमल मिलाते हुए साथ 1x पीबीएस 10 मिनट के साथ 3 बार हर बार धो लो.
  5. माउंट करने के लिए स्लाइस एक स्केलपेल के साथ झिल्ली में कटौती, और एक ठीक संदंश का उपयोग करने के लिए एक पाले सेओढ़ लिया गिलास युक्त झिल्ली स्लाइस हस्तांतरण पानी कक्ष में स्लाइड. तक 5 स्लाइसें प्रति गिलास स्लाइड रखा जा सकता है. अतिरिक्त पानी निकालने के लिए, और प्रत्येक मस्तिष्क टुकड़ा Flourmount समाधान की एक बूंद जोड़ें. धीरे मस्तिष्क स्लाइसें के शीर्ष पर एक coverslip जगह और एक हटाने केवाई हवा बुलबुले. एक confocal सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर स्लाइस का विश्लेषण.

7. Organotypic स्लाइस की वैकल्पिक आयल एम्बेडिंग (वीडियो में नहीं)

  1. Organotypic स्लाइस को भी एक बेहतर morphological विश्लेषण के लिए तेल के लिए एम्बेडेड कर सकते हैं यह अंत करने के लिए, जा organotypic झिल्ली युक्त स्लाइस 4% पीएफए ​​के रूप में ऊपर वर्णित में तय किया जा सकता है.
  2. निश्चित स्लाइस 1% agarose (37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व - गरम) में एम्बेडेड रहे हैं, और 30 मिनट के लिए बर्फ में जम. agarose ब्लॉक पीएफए ​​में 4% तो बाद तय किया जा सकता है 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए.
  3. agarose organotypic टुकड़ा युक्त ब्लॉक तो पैराफिन में एम्बेडेड हो जाएगा और immunofluorescence के लिए कार्रवाई के रूप में पहले 10 में वर्णित है.

8. प्रतिनिधि परिणाम

Murine और organotypic स्लाइस के प्रांतस्था संस्कृति की electroporation की एक ढांचे के रूप में प्रतिनिधित्व चित्र 1 में दिखाया जाता है. इस विधि rapi के लिए एक उपयोगी रणनीति हैneuronal 11 विकास में शामिल जीन के समारोह के मूल्यांकन. डीएनए electroporated की मात्रा और electroporation में भ्रूण अवस्था पर निर्भर करता है, अभिकर्मक दक्षता अलग अलग होंगे. GFP व्यक्त स्लाइस कम से कम 8 घंटे के बाद electroporation और कोशिकाओं संस्कृति (प्रसार, प्रवास, और जल्दी neuronal भेदभाव) में तंत्रिकाजन्य घटनाओं के सामान्य अनुक्रम से गुजरना होगा शुरू चित्रा 2 एक electroporated मस्तिष्क टुकड़ा है कि एक नियंत्रण व्यक्त है pSilencer GFP से पता चलता है. वेक्टर और एक neuronal progenitors, पलायन न्यूरॉन्स और टुकड़ा में विभेदित न्यूरॉन्स का पालन कर सकते हैं. Organotypic स्लाइस लंबे समय के रूप में उनके आकारिकी रखने के रूप में वे झिल्ली पर एक अच्छा इंटरफ़ेस मीडिया हवा में रखा जाता है और संस्कृति में कम से कम 5 दिनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

चित्रा 1
आकृति 1. पूर्व vivo electroporation और organotypic टुकड़ा है के चित्रणसंस्कृति परख E14.5. भ्रूण विच्छेदित कर रहे हैं, और व्यक्तिगत रूप से तेजी से हरे रंग के साथ मिश्रित डीएनए के साथ इंजेक्शन के क्रम में इंजेक्शन साइट कल्पना. डीएनए दोनों पार्श्व ventricles में इंजेक्शन जा सकता है के रूप में चित्र में या तीसरे निलय में दर्शाया क्रम में पार्श्व ventricles को भरने है. इंजेक्शन के बाद दिमाग एक वर्ग लहर electroporator के साथ electroporated कर रहे हैं, मस्तिष्क के वांछित पक्ष पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखने. दिमाग 3% कम पिघल बिंदु agarose और एक vibratome का उपयोग sectioned में एम्बेडेड हैं. 250 माइक्रोन मस्तिष्क स्लाइसें 0.4 माइक्रोन आवेषण पर रखा जाता है और एक सप्ताह के लिए सुसंस्कृत. GFP 8 घंटे के बाद अभिकर्मक के बाद देखा जा सकता है.

चित्रा 2
चित्रा 2. विश्लेषण Electroporated electroporated मस्तिष्क स्लाइसें के मस्तिष्क स्लाइसें. Hoescht के लिए दाग रहे थे. पृष्ठीय प्रांतस्था निलय क्षेत्र (VZ) के पर electroporated neuronal progenitors से पता चलता है. Corti में न्यूरॉन्सकैलोरी प्लेट (वाणिज्यिक पत्र) सीमांत क्षेत्र (MZ) द्वारा सीमांकित हैं. सफेद तीर पलायन न्यूरॉन्स दिखा. इस मामले में, दिमाग E15.5 में अंतःक्षिप्त थे और एक pSilencer GFP नियंत्रण वेक्टर साथ electroporated है. वर्गों electroporation के बाद 4 दिन cortical explants का प्रतिनिधित्व करते हैं. स्केल बार 100 माइक्रोन.

समस्या निवारण:

  1. कम अभिकर्मक दक्षता: डीएनए की एकाग्रता कम से कम 1 μg / μL के लिए इस्तेमाल किया समायोजित करें. हमेशा एक मैक्सी प्रस्तुत करने से बहुत साफ डीएनए का उपयोग यदि आवश्यक उपयोग एंडो - मुक्त Quiagen किट डीएनए को शुद्ध करने के लिए.
  2. एक वांछित की तुलना में एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र में ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं: सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोड सही ढंग से electroporated जा मस्तिष्क के पक्ष की ओर सकारात्मक इलेक्ट्रोड स्थिति के साथ तैनात कर रहे हैं.
  3. बदलें मीडिया हर दिन और यह सुनिश्चित स्लाइस मीडिया में नहीं चल रहे हैं: organotypic स्लाइस आकारिकी खोना
  4. स्लाइसें agarose उतर आते हैं के रूप में वे छह में कटौती कर रहे हैं किया जा रहा हैbratome: सुनिश्चित करें कि एक अच्छा इंटरफ़ेस जब कम पिघल बिंदु agarose में दिमाग एम्बेड किया जाता है.

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Discussion

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इन तरीकों डबल असहाय आरएनए 8 hairpins और organotypic स्लाइस 4 कई विशिष्ट लाभ प्रदान की संस्कृति कूटबन्धन plasmids के पूर्व vivo electroporation शामिल. सबसे पहले, इन तरीकों के आरएनएआई व्युत्पन्न phenotypes की एक तेजी से मूल्यांकन के लिए अनुमति देते हैं. वही pSilencer वेक्टर कि U6 प्रमोटर है कि डबल असहाय शाही सेना बाल के लिये कांटा ड्राइव में एक अभिव्यक्ति कैसेट एन्कोडिंग GFP के शामिल किए जाने के एक तेजी से पहचान और आरएनएआई वेक्टर साथ electroporated कोशिकाओं के लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देता है. समय दक्षता के अलावा, इन तरीकों अत्यधिक कई पीटा लाइनों की पीढ़ी की तुलना में लागत प्रभावी है. दूसरे, अस्तित्व electroporation प्रौद्योगिकी 12 कि अब प्रशिक्षण और कौशल विकास के लिए पशु और electroporation की सफलता के अस्तित्व को सुनिश्चित करने की आवश्यकता है के साथ तुलना में, तरीके यहाँ वर्णित एक छोटी प्रशिक्षण समय और कौशल के साथ किया जा सकता है. vivo में अस्तित्व मेंurgeries भी एक आधारभूत असफलता की दर (माँ और पिल्ला) पशु रुग्णता के साथ जुड़ा हो सकता है के द्वारा फंस गई हैं. इन जानवरों अक्सर काफी कुशल कर्मचारियों और / या पशु सुविधा से पशु चिकित्सकों द्वारा मूल्यांकन किया जा आवश्यकता होगी. तीसरा, क्योंकि वे इन विट्रो में 5 या अधिक दिनों के लिए सभ्य हैं, वे हमें को neuronal प्रसार, सेल भाग्य दृढ़ संकल्प, neuronal प्रवास और neuronal परिपक्वता के प्रारंभिक दौर (neurite परिणाम) से संबंधित सवालों की एक विस्तृत सरणी का पता करने के लिए अनुमति देते हैं. चौथा, क्योंकि हम संस्कृति में काम कर रहे हैं, हम भी को exogenous कारकों को जोड़ने के लिए neurodevelopmental वर्णित तंत्र में वृद्धि कारक है और दवा एजेंटों की भूमिका की जांच करने में सक्षम हैं. पांचवां, electroporation दृष्टिकोण पूर्व vivo में एक जीन बंदूक दृष्टिकोण करने के लिए बेहतर है क्योंकि यह ठीक इलेक्ट्रोड उन्मुख दिमाग के विशिष्ट क्षेत्रों को लक्षित की अनुमति देता है. अंत में, के organotypic स्लाइस के वायरल पारगमन की तुलना electroporation दृष्टिकोण एक उच्च टीआरए के लिए अनुमति देता हैप्राथमिक कोशिकाओं nsfection दक्षता.

इन तरीकों में कुछ सीमाएँ है. जब तक टुकड़ा तकनीक अब संस्कृति अवधि को बनाए रखने के संशोधित किया गया है, इन विधियों है कि बाद में होते synaptogenesis या विकास की घटनाओं का आकलन करने के लिए आदर्श नहीं हो सकता. एक अतिरिक्त सीमा हो सकता है कि परिणामों के reproducibility इलेक्ट्रोड नियुक्ति पर अत्यधिक निर्भर है. कुछ अभ्यास के लिए एक ही मस्तिष्क क्षेत्र है जो बढ़ जाती है के परिणामों के reproducibility की electroporation सुनिश्चित करने की आवश्यकता है. अंत में, इंटरफ़ेस / हवा तरल के रखरखाव के लिए भी महत्वपूर्ण है सुनिश्चित करने के लिए स्वस्थ स्लाइस. जैसा कि ऊपर वर्णित है, हम आशा करते हैं कि इन कौशल जौव पाठकों द्वारा आसानी से हासिल किया जा सकता है, और है कि इन विधियों की ताकत बहुत उपयुक्त आवेदन दिया सीमाओं पल्ला झुकना. सारांश में, हड्डीवाला सक्षम के चिकित्सकों के जीन की एक बड़ी संख्या के द्वारा नियंत्रित किया जाता है. विशेष रूप में neuronal morphogenesis एक बहुत ही रोचक और महत्वपूर्ण विषय है. इस दृष्टिकोण की अनुमति देता हैसक्षम के चिकित्सकों के दौरान स्क्रीनिंग जीन समारोह के लिए एक बेहद कारगर तरीका के लिए और प्रयोगात्मक प्रयोजनों के एक बहुत व्यापक रेंज सेवा कर सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम डॉ. शिरीन Bonni pSil GFP का निर्माण, चित्रा 1 के चित्रण के लिए डा. Alper, Uzun, और confocal माइक्रोस्कोपी के लिए Leduc Bioimaging सुविधा प्रदान करने के लिए धन्यवाद. ईएमएम Burroughs Wellcome कोष, एक NARSAD युवा जांचकर्ता पुरस्कार, और NIH NCRR Cobre RR018728-01 P20 से चिकित्सा विज्ञान के लिए कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है. SBL NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 द्वारा समर्थित है, और एनआरएसए 5T32MH019118-20 PHS से समर्थन प्राप्त हुआ है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hamilton syringe Hamilton Co 80008 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume
Platinum tweezertrodes BTX Technologies 45-0489 5mm size
ECM830 electroporator BTX Technologies 45-0002
BTX Footswitch BTX Technologies 45-0208 For use with ECM830 electroporator
Vibrating blade microtome Leica Microsystems VT1000 S
6- well dish to use with inserts Falcon BD 353502 Contains notches to fit inserts
Tissue culture inserts Falcon BD 353090 0.4 micrometer
Fast Green Sigma-Aldrich F7252
Low Melting Agarose Fisher Scientific BP165-25 DNA grade
Laminin Sigma-Aldrich L2020
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P5899
Basal Medium Eagle Sigma-Aldrich B-1522
HBSS 10x without Ca and Mg GIBCO, by Life Technologies 14180-046
HEPES-free acid Sigma-Aldrich H4034

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References

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Neuronal morphogenesis के अध्ययन के लिए तरीके:<em&gt; पूर्व vivo</em&gt; भ्रूण murine प्रमस्तिष्क प्रांतस्था में आरएनएआई electroporation
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Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621, doi:10.3791/3621 (2012).More

Lizarraga, S. B., Coser, K. R., Sabbagh, M., Morrow, E. M. Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex. J. Vis. Exp. (63), e3621, doi:10.3791/3621 (2012).

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