Summary
Att utföra en snabb utvärdering av funktionen hos gener i utvecklingen av cerebral cortex, beskriver vi förfaranden som involverar
Abstract
Hjärnbarken leder högre kognitiva funktioner. Denna sex skiktad struktur genereras i en inre-first, utanför och sista sätt på vilket den förstfödde nervceller kvar närmare kammaren medan de sista födda neuronerna vandrar förbi de födda första neuronerna mot hjärnans yta 1. Förutom neuronala migration 2, är en viktig process för normal kortikal funktion regleringen av neuronala morfogenes 3. Medan neuronala morfogenes kan studeras in vitro i primära kulturer, det finns mycket att lära av hur dessa processer regleras i vävnad miljöer.
Vi beskriver tekniker för att analysera neuronal migrering och / eller morfogenes i organotypiska skivor av hjärnbarken 4,6. En pSilencer modifierade vektorn användes, som innehåller både en U6 promotor som driver de dubbelsträngade hårnåls-RNA och en separat expressionskassett, som kodar GFP-proteinet drivs bya CMV-promotor 7-9. Vårt tillvägagångssätt möjliggör snabb bedömning av defekter i neuritutväxt på särskild knockdown av gener och har med framgång använts i en skärm för tillsynsmyndigheter av neuritutväxt 8. Eftersom endast en delmängd av celler uttrycker RNAi konstruktionerna, de organotypiska skivor möjliggöra en mosaik analys av de potentiella fenotyper. Dessutom, eftersom denna analys görs i en nära approximation av in vivo-miljö, ger det en låg kostnad och snabbt alternativ till alstring av transgena eller knockout djur för gener med okänd funktion kortikal. Slutligen, i jämförelse med in vivo elektroporering teknik, är en framgångsrik ex försök vivo elektroporation inte beroende av skickliga operation kompetensutveckling och kan utföras med kortare utbildningstid och skicklighet.
Protocol
1. Förbereda Kultur Solutions och media (inte i video)
- Framställ 1 liter komplett Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande 1 x HBSS, 2,5 mM HEPES (pH 7,4), 30 mM D-glukos, 1 mM CaCl2, 1 mM MgSO 4 och 4 mM NaHCOs 3. Tillsätt dubbeldestillerat vatten (2 ddHaO O). Filtersterilisera med en 0,2 ^ m filter och lagra vid 4 ° C.
- Framställa mediet skiva kultur med användning av 35 ml Basal Medium Eagle-medium, 12,9 ml komplett HBSS, 20 mM D-glukos (1,35 ml av 1 M lösning), 1 mM GlutaMax (0,25 ml av en 200 mM lösning), 0,5 ml penicillin -streptomycin 100x lager. Filtersterilisera med en 0,2 ^ m filter och därefter tillföra värme-inaktiverat hästserum till en slutlig koncentration av 5%.
- Framställ Laminin arbetslösningen genom att göra en 1 mg / ml laminin stamlösning med sterilt destillerat avjoniserat vatten. Framställ 100 | il alikvoter i 0,5 ml Eppendorf-rör och frysa vid -80 ° C.
- Förbered Poly-L-lysin jobbar såföroreningarna genom tillsats av 5 ml sterilt H2O till 5 mg av poly-L-lysin för att ge en 1 mg / ml stamlösning. Framställ 1 ml alikvoter och frys vid -20 ° C.
- Framställa beläggningslösningen genom att späda 1 ml av poly-L-lysin och 100 | il av laminin till en slutlig volym av 12 ml med sterilt vatten. Gör denna lösning nytt varje gång.
2. Förbereda Organotypiska Slice Infogar (ej i video)
- Framställa två sex-brunnars plattor med en odlingsinsatsen per brunn med användning av steril pincett. Tillsätt 2 ml steril ddHaO 2 O nedanför kultur insatserna.
- Tillsätt 1 ml av beläggningslösningen på toppen av membranet noga med att inte punktera membranet. Inkubera över natten i en fuktad inkubator vid 37 ° C och 5% CO2.
- Ta bort beläggning media och tvätta membran med sterila H 2 0 tre gånger. Låt insatser torra före användning. Tillsätt 1,8 ml av skiva odlingsmedium och placera i 37 ° C inkubator. Linda de oanvända plattorna med Parafilmoch förvara vid 4 ° C under upp till 4 veckor.
3. Förberedelser för Elektroporation (inte i video)
- Förbered RNAi konstruktioner för elektroporering. Dubbelsträngade RNA hårnåls skär klonades in i en vektor pSilencer. Plasmiden innehåller: 1) en U6 promotor som driver den dubbelsträng-RNA generering och 2) en GFP-expressionskassett driven av CMV-promotorn 8,9. Denna plasmid har beskrivits tidigare av Konishi och kollegor 9 och andra 7,8. Plasmider renas med användning av en Qiagen Maxi-prep-kit, och användes vid en koncentration av 1 mg / ml.
- För att visualisera DNA medan injicera det, framställa en 0,5% snabb grönt färgämne-lösning och använda det på 1:20 med det DNA som skall injiceras (ofta 20 | il av DNA med 1 | il av snabb grönt). Kvar DNA-snabbt kan gröna färgblandningen förvaras vid -20 ° C i upp till en vecka.
- Ren dissektion område, dissecting verktyg och vibratom fartyg med 70% etanol. Chill kompletta HBSS så att det är iskallt. Chill vibratom fartyget genom att packa isen runt inne i vibratom med lite vatten för snabb kylning. Framställ 3% agaros med låg smältpunkt med användning av fullständiga HBSS. Mikrovågsugn i 1 min. Undvik över kokande. Hålla en 42 ° C vattenbad tills användning.
- Elektroporering parametrar ställs in enligt följande. För en E15 embryo användning 35 V, 5 pulser, 100 ms längd, 900 ms intervall mellan pulserna. För äldre djur, för att säkerställa elektroporering, använda högre spänning på upp till 50 V eller öka antalet pulser upp till 8 pulser. För att förhindra att skada vävnaden i yngre djur, antingen använda färre pulser eller upp till 2 pulser och lägre spänning upp till 25 V. Dessa parametrar kan varieras och bestämmas empiriskt beroende på djurets ålder.
4. Dissektion och elektroporation (i video)
- Efter euthanizing en gravid kvinna, dissekera embryon ut i iskalla fullständiga HBSS. Keep varje embryo i sina individuella moderkakan säckar.
- Dissekera embryo ut och skär av huvudet efter den första kotan. Kom iskalla kompletta HBSS.
- För injektion, placera huvudet på en bit parafilm ovanpå en petriskål. Användning skräddarsydd Hamilton-spruta (se tabell I) injicera ca 6 till 8 | il av DNA: snabb grönt färgämne blandning genom den tredje ventrikeln för att fylla i de båda laterala ventriklama i de kortikala vesiklar. Alternativt kan injektion göras direkt i varje lateral ventrikel.
- För ex vivo elektroporering, använd BTX-pincett platinaelektroder. Placera den positiva elektroden mot den sida av cortex man vill att elektroporera dvs toppen av huvudet för dorsala cortex.
- Efter elektroporering, inkubera huvudena på is under åtminstone 5 min före dissekera.
- Dissekera hjärnor i iskall HBSSby göra ett litet snitt på den sida av huvudet och avskalning av huden från sidorna av huvudet. Därefter, medfin pincett försiktigt dra bort pia från hjärnan. Ta bort intakta hjärnan från skallen, noga med att inte skada cortex.
5. Inbäddning och Sektionering av Elektroporerade cortex (i video)
- Överföra 3% agaros med låg smältpunkt i en stor gjutform placeras på is. Botten av gjutformen kommer börja stelna snabbare vilket kommer att förhindra hjärnor från att sjunka ned till botten av formen. Försiktigt, överföra hjärnor med fina pincett en efter en efter en bort överflödig buffert med en Kimwipe eller filtrerpapper. Använda en 10 | il pipettspets att virvla hjärnorna inuti formen för att säkerställa maximal kontaktyta mellan agarosen och hjärnvävnad.
- Orient hjärnan att säkerställa att alla hjärnor är i samma orientering och på ungefär samma nivå i agarosen. Låt agaros stelna under ca 5 minuter. Använd bindning lim (galen lim) för att fästa agarosblock så att lukt lamporna står upp. När blocken är fästa, omedelbart lägga ice kall HBSS och trimma agarosen för att försäkra enskilda skivor erhålls för varje hjärna.
- Att skära blocken, ställ vibratom s hastighet till en låg hastighet (ca hälften av den maximala) och ställ in klingan vibrationsfrekvens på högsta inställningen. Generera 250-im tjocka coronal skivor. Hämta skivor med hjälp av en böjd fint spatel och överföra dem till vävnad brunnar med en fin borste eller pincett.
- I vävnadskultur huv, överföra skivor i belagda skären. Tillsätt 500 pl av media skiva kultur till varje insats för att göra överföringen enkelt. Upp till 5 skivor kan placeras per skär. Avlägsna en del material från den övre delen av skivorna och inkubera vid 37 ° C i fuktad inkubator.
6. Kultur och analys av Organotypiska Skivor (i video)
- För att bibehålla friska skivor bör färskt medium tillsättas åtminstone varannan dag under membranet genom att ersätta hälften av mediet var gång.
- För att analysera skivor efter desired dagar i odling, fixera skivorna i membranet. Tvätta med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) vid 37 ° C tre gånger under 10 min varje gång. Därefter fäst med 4% paraformaldehyd (PFA) över natten vid 4 ° C eller under 1 timme vid rumstemperatur.
- Skivor kan analyseras med olika cellulära markörer eller färgades med Hoechst enbart för att visualisera elektroporerade och icke-elektroporerade cellerna. Permeabilisera och blockera skivor under 2 timmar vid rumstemperatur med 10% getserum, 0,1% Triton i 1 x PBS under försiktig skakning.
- Färgas med Hoechst under 1 h vid rumstemperatur, tvätta 3 gånger med 1 x PBS 10 min varje gång med försiktig skakning.
- För att montera skivor skära membranet med en skalpell, och använda en fin pincett för att överföra membran som innehåller skivor till ett frostat glas glider i en vattenbehållare. Upp till 5 skivor kan placeras per glasskiva. Avlägsna överflödigt vatten och tillsätt en droppe Flourmount lösning till varje hjärna skiva. Försiktigt placera ett täckglas ovanpå hjärnsnitt och avlägsna eny luftbubblor. Analysera segment med ett konfokalt mikroskop.
7. Alternativ paraffininbäddning i Organotypiska Skivor (inte i video)
- Organotypiska skivor kan också bäddas för paraffin för ett finare morfologisk analys, i detta syfte membranet innehåller organotypiska skivor kan fixeras i 4% PFA som beskrivs ovan.
- De fasta skivorna är inbäddade i 1% agaros (förvärmd till 37 ° C) och fick stelna i is under 30 minuter. De agarosblock kan sedan efterfixerades i 4% PFA vid 4 ° C under 30 minuter.
- Agarosen block som innehåller den organotypiska skiva kommer sedan bäddas in i paraffin och bearbetades för immunofluorescens såsom beskrivits tidigare 10.
8. Representativa resultat
En schematisk representation av elektroporering av murin kortex och odling av organotypiska skivor visas i figur 1. Denna metod är en användbar strategi för rapid bedömning av funktionen hos gener som är involverade i neuronal utveckling 11. Beroende på mängden DNA elektroporerades och den embryonala stadiet vid elektroporering, kommer transfektionseffektiviteten varierar. Skivor kommer att börja uttrycka GFP minst 8 timmar efter elektroporation och celler kommer att genomgå den normala sekvensen av neurogena händelser (proliferation, migration och tidig neuronal differentiering) i kultur. Figur 2 visar ett elektro-hjärna segment som uttrycker en kontroll pSilencer-GFP vektor och man kan observera neuronala stamceller, migrera neuroner och differentierade neuroner i segmentet. Organotypiska skivor kommer att hålla deras morfologi så länge de hålls i ett bra media-luft-gränssnitt på membranen och kan användas upp till minst 5 dagar i kultur.
Figur 1. Illustration av ex vivo elektroporation och organotypisk skivakultur analysbetingelser. E14.5 embryon dissekerades ut, och för sig injicerades med DNA blandades med snabb grönt färgämne, för att visualisera injektionsstället. DNA kan injiceras i båda de laterala ventriklama, såsom visas i illustrationen eller i den tredje ventrikeln för att fylla i de laterala ventriklama. Efter injektion, hjärnorna elektroporerades med en fyrkantvåg elektroporator, placera den positiva elektroden på den önskade sidan av hjärnan. Hjärnor är inbäddade i 3% agaros med låg smältpunkt och sektionerades med användning av en vibratom. 250 | im hjärnsnitt är placerade på 0,4 | im skär och odlades upp till en vecka. GFP kan observeras efter 8 timmar efter transfektion.
Figur 2. Analys av elektroporerade hjärnan skivor. Elektroporerade hjärna skivor färgades för Hoescht. Dorsal cortex visar elektroporerade neuronala stamceller vid ventrikulära zonen (VZ). Neuroner i det kortiskacal plattan (cp) avgränsas av marginella zonen (mz). Vita pilar visar migrerar neuroner. I detta fall var hjärnor injicerades vid E15.5 och elektroporerades med en pSilencer GFP-kontrollvektorn. Sektionerna representerar kortikala explantaten 4 dagar efter elektroporering. Skalstrecket 100 | im.
Felsökning:
- Låg transfektionseffektivitet: Justera koncentrationen av DNA används för att åtminstone 1 ng / | il. Använd alltid mycket rena DNA från en Maxi prep använd om nödvändigt en endo-fri Quiagen kit för att rena DNA.
- Celler transfekterade i en annan hjärna område än ett önskas: Se till att elektroderna är korrekt placerade med den positiva elektroden positionen mot den sida av hjärnan som ska elektroporeras.
- Organotypiska skivor förlorar morfologi: Ändra media varje dag och se skivorna inte flyter i media
- Skivor kommer från agarosen när de skärs i VIbratome: Se till att ett bra gränssnitt görs när inbäddning hjärnan i låg smältpunkt agaros.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dessa metoder omfattar ex vivo elektroporering av plasmider som kodar för dubbelsträngat RNA hårnålar 8 och kultur organotypiska skivor 4 ger flera olika fördelar. Först dessa metoder möjliggör en snabb bedömning av RNAi-härledda fenotyper. Införande av en expressionskassett som kodar för GFP i samma pSilencer vektor som innehåller den U6 promotor som driver den dubbelsträngade RNA-hårnålsstruktur möjliggör en snabb identifiering och karakterisering av celler elektroporerade med RNAi vektorn. Förutom tid effektivitet dessa metoder är mycket kostnadseffektiva jämfört med generation av flera knockout linjer. För det andra, i jämförelse med överlevnad elektroporation teknik 12 som kräver längre utbildning och kompetensutveckling för att säkerställa överlevnaden för djuret och framgång elektroporering, beskrivna metoder här kan utföras med en kortare utbildningstid och skicklighet. In vivo överlevnad surgeries också sitter fast med en baseline felfrekvens som kan vara förknippade med djur (mor och PUP) sjuklighet. Dessa djur kommer ofta att behöva bedömas av rimligt kompetent personal och / eller veterinärer från djuret anläggningen. Tredje, eftersom de odlas i upp till 5 dagar eller mer in vitro, så att vi itu med ett brett spektrum av frågor som rör neuronal proliferation, cell öde beslutsamhet, neuronal migration och de tidiga stadierna av neuronal mognad (neuritutväxt). Det fjärde, eftersom vi arbetar i kultur, kan vi också lägga till yttre faktorer för att testa rollen av tillväxtfaktorer och farmaceutiska agenter i de beskrivna nervsystemets mekanismer. För det femte är det elektroporering tillvägagångssätt ex vivo föredraget att en genkanon tillvägagångssätt, eftersom den tillåter målinriktning av specifika regioner av hjärnan genom att exakt orientera elektroderna. I jämförelse med viral transduktion av organotypiska skivor för elektroporering metoden möjliggör en högre transfection effektivitet av primära celler.
Dessa metoder har några begränsningar. Om skivan tekniken ändras för att upprätthålla längre kultur perioder kan dessa metoder inte är idealiskt att bedöma synaptogenes eller utvecklingsmässiga händelser som inträffar senare. En ytterligare begränsning kan vara att resultatens reproducerbarhet är mycket beroende av placering av elektroderna. Lite träning krävs för att säkerställa elektroporation av samma hjärnan regionen som ökar reproducerbarhet av resultaten. Slutligen är underhåll av luft / vätske gränssnittet också viktigt att se friska skivor. Som beskrivits ovan, räknar vi med att dessa färdigheter lätt kan förvärvas av Jové läsarna, och att styrkan i dessa metoder avsevärt uppväger de begränsningar som anges i lämpligt program. Sammanfattningsvis är vertebrat neuroutvecklingssjukdomar styrs av ett stort antal gener. Neuronal morfogenes i synnerhet är en mycket intressant och viktigt ämne. Detta tillvägagångssätt gör det möjligtför en effektiv metod för screening av genfunktion under neuroutvecklingssjukdomar och kan tjäna ett mycket brett spektrum av experimentella ändamål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Shirin Bonni för att tillhandahålla den pSil-GFP-konstruktionen, Dr Alper Uzun för illustrationen i figur 1, och den Leduc Bioimaging anläggning för konfokal mikroskopi. EMM stöds av Career Award för Medicinsk vetenskap från Burroughs Wellcome Fund, en NARSAD Young Investigators Award och NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01. SBL stöds av NIH NCRR Cobre P20 RR018728-01 och har fått stöd från PHS NRSA 5T32MH019118-20.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hamilton syringe | Hamilton Co | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX Technologies | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX Technologies | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX Technologies | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | Leica Microsystems | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | Falcon BD | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | Falcon BD | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7252 | |
| Low Melting Agarose | Fisher Scientific | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma-Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO, by Life Technologies | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma-Aldrich | H4034 |
References
- Angevine, J. B. Jr, Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
