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Neuroscience

तंत्रिका शिखा प्रवासन और भेदभाव के पार प्रजातियों प्रत्यारोपण द्वारा विश्लेषण

Published: February 7, 2012 doi: 10.3791/3622
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biochemistry and Cell Biology, Rice University

Summary

माइग्रेशन और एवियन बटेर लड़की chimeric भ्रूण में तंत्रिका शिखा कोशिकाओं के अंतिम भाग्य का विश्लेषण करने के लिए एक दृष्टिकोण वर्णित है. इस विधि के प्रवास और भेदभाव के दौरान तंत्रिका शिखा कोशिकाओं है कि अन्यथा मुश्किल एक unmanipulated लड़की भ्रूण के भीतर अलग कर रहे हैं पता लगाने के लिए एक सरल और सरल तकनीक है.

Protocol

1. अंडों पर बैठना लड़की और वांछित चरण के लिए बटेर अंडे

HH9 भ्रूण के लिए ठेठ ऊष्मायन समय 29-33 घंटे से लेकर 38 ° 63 सी.

  1. गुनगुना पानी के साथ अंडे से किसी भी मलबे से धो लें.
  2. ट्रे पर चिकन अंडे क्षैतिज व्यवस्था करो. पेंसिल के साथ सामना करना पड़ ओर मार्क, इस क्षेत्र है जहां भ्रूण स्थानीयकृत जाएगा के अनुरूप होगा. बटेर अंडे कुंद अंत सेते हैं.
  3. 38 में जगह डिग्री सेल्सियस humidified इनक्यूबेटर. समारोह का घोड़ा पर बारी.

2. गवाक्षन और विच्छेदन के लिए अंडे तैयार

  1. इनक्यूबेटर से अंडे निकालें, और 70% इथेनॉल के साथ सबसे ऊपर है बाँझ. यह सबसे अच्छा है के लिए इथेनॉल पर स्प्रे और यह पोंछ दूर जल्दी से एक कागज तौलिया या Kimwipe खोल के माध्यम से इथेनॉल के किसी भी अवशोषण से बचने के साथ.
  2. एक व्यक्ति अंडे धारक (हम जोड़ कागज तौलिये के साथ लाइन में खड़ा एक पेट्री डिश, उदाहरण के लिए, "Kimwipes" का उपयोग) पर जगह चिकन अंडे. ए.ए. संदंश का उपयोग, एक छोटे से hol नलबताया अंत में अंडे के खोल की ऊपरी सतह में ई.
  3. साढ़े 18 जी चमड़े के नीचे सुई और 5 एमएल सिरिंज के साथ चिकन अंडे से albumin प्रकाश की 1.5 3ml निकालें. यह सबसे अच्छा है के लिए सुई खड़ी छेद में बेवल अंडा (2A चित्रा) की नुकीले अंत का सामना करना पड़ के साथ सम्मिलित करने के लिए,. इस तरह, जब albumin वापस ले लिया है, वहाँ गलती से चूषण के माध्यम से की जर्दी को नुकसान पहुँचाए के कम जोखिम है. Albumin त्यागें. इस कदम की जर्दी और अंडे के भीतर भ्रूण को कम करने के लिए एक खिड़की खोल में खोला जा के लिए अनुमति देगा.
  4. 70% इथेनॉल के साथ छेद के रूप में ऊपर वर्णित है और यह स्कॉच टेप के साथ सील साफ कर लें. यह महत्वपूर्ण है कि छेद आसपास eggshell का पूरी तरह से रहित albumin और शुष्क है या चिपकने वाला नहीं सील होगा.
  5. ए.ए. संदंश के साथ शीर्ष पर काफी नहीं क्षैतिज अंडे के रूप में चिह्नित ऊपरी सतह में एक और छेद, नल. ध्यान रखना नहीं संदंश खोल के माध्यम से बहुत दूर जाना है जर्दी या भ्रूण को नुकसान पहुँचाए से बचने के.
  6. मेंअंडे खोल छेद समानांतर में एक घुमावदार परितारिका संदंश के पक्ष SERT. खोल पर नीचे बन्द रखो, एक ~ चिकन अंडे खोल में 2 सेमी व्यास खिड़की में तोड़ने के लिए एक परिपत्र गति में काम कर रहे है. हटा खोल त्यागें. वैकल्पिक रूप से, टेप पैकिंग के साथ अंडे की ऊपरी सतह को कवर और खिड़की से बाहर काट कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें. यह eggshell अंडे में गिरने मलबे का मौका minimizes. भ्रूण जर्दी के शीर्ष पर एक अपारदर्शी डिस्क के रूप में प्रकट होना चाहिए. त्यागें कोई unfertilized अंडे जर्दी की सतह पर छोटे सफेद स्थान, या निषिक्त की अनुपस्थिति द्वारा की पहचान की.
  7. . लिए भ्रूण मंचन के साथ सहायता के निषिक्त नीचे: भारत स्याही की एक छोटी राशि (अंतिम एकाग्रता 100 μg / एमएल पेनिसिलिन और 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन बाँझ घंटी "पेन / Strep युक्त समाधान में 1:10 पतला एंटीबायोटिक) सुई वैकल्पिक रूप से, एक माँ, एक 1 एमएल सिरिंज और 26 आधा जी चमड़े के नीचे सुई, सुई के आधार पर एक 45 ° कोण में तुला बेवल साथ ऊपर का सामना करना पड़y एक खींच लिया कांच पाश्चर pipet और मुँह pipetting उपकरण (नेत्र संरक्षण पहनने जब चमड़े के नीचे सुई झुकने या कांच सुई तोड़) का उपयोग करें. बीच में रोकना निषिक्त की परिधि के बाहर की जर्दी झिल्ली और भ्रूण के नीचे सुई की नोक स्लाइड, जर्दी की सतह के करीब है लेकिन भ्रूण परतों में (चित्र 2B). सिर्फ पर्याप्त स्याही इंजेक्षन करने के लिए भ्रूण रूपरेखा है, तो ध्यान से सुई (चित्र -2) वापस ले. बहुत स्याही इंजेक्शन भ्रूण की मौत के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह महत्वपूर्ण है भ्रूण नीचे किसी भी हवाई बुलबुले नहीं इंजेक्षन, के रूप में इस संक्रमण के लिए एक स्रोत हो सकता है. नायब: सभी घंटी इस प्रक्रिया में इस्तेमाल समाधान निष्फल और पेन / ऊपर Strep के रूप में परिभाषित होता है. बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) भी इस प्रोटोकॉल के सभी चरणों में घंटी के समाधान के लिए एक स्वीकार्य विकल्प है.
  8. हैम्बर्गर और 63 हैमिल्टन के अनुसार भ्रूण चरण और स्थायी स्याही या पेंसिल में खोल मंच पर रिकॉर्ड. चरणों सबसे अच्छा Stere के तहत मूल्यांकन कर रहे हैंomicroscopy, फाइबर ऑप्टिक "gooseneck" प्रकाश स्रोतों जो एक सीमित गर्मी लोड के साथ.
  9. 2-3 लागू करें गर्म बाँझ है घंटी समाधान भ्रूण की सतह के लिए निर्जलीकरण और प्रदूषण को रोकने के लिए चला जाता है. अस्थायी रूप से खिड़की सील साथ parafilm अंडे की सतह पर फैला.
  10. दोहराएँ प्रत्यारोपण के प्रयोगों की शुरुआत से पहले सभी लड़की अंडे के साथ 2.2-2.9 कदम.
  11. चूंकि बटेर भ्रूण केवल दाता ऊतकों के लिए उपयोग किया जाता है, ओवो चरणों में 2.2-2.9 से हटाया जा सकता है. दाता भ्रूण के पूर्व ओवो तैयारी के लिए, बटेर अंडे कुंद पक्ष incubated हैं ऊपर और घुमावदार संदंश के साथ इस क्षेत्र में खोला भ्रूण का पता चलता है. विदारक कैंची का प्रयोग, चार पीतक झिल्ली और भ्रूण बाहर निषिक्त (सुनिश्चित करें कि सभी कटौती को पूरा करते हैं) के माध्यम से एक वर्ग के आकार में कटौती कर सकते हैं. एक घुमावदार परितारिका संदंश का प्रयोग, धीरे कटौती बढ़त समझ और अंडे से भ्रूण उठा और एक पेट्री डिश में Ringers समाधान करने के लिए स्थानांतरण. वैकल्पिक रूप से, एक वक्र का उपयोग कर सकते हैंघ परितारिका नीचे, या एक भ्रूण चम्मच या प्लास्टिक हस्तांतरण सिलेंडर के व्यापक हिस्से के माध्यम से कटौती विंदुक से excised भ्रूण उठा, अंडे की भ्रूण हस्तांतरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है संदंश. # 5 संदंश के साथ धीरे पीतक झिल्ली को हटा दें. इसके बाद के संस्करण के रूप में शेष बटेर भ्रूण ले लीजिए, और उन्हें विदारक खुर्दबीन के तहत मंच.

3. भ्रष्टाचार प्राप्त मेजबान भ्रूण तैयार

  1. (लड़की) मेजबान भ्रूण से parafilm निकालें और एक तेज टंगस्टन सुई या # 5 संदंश का उपयोग करने के लिए, न्यूरल ट्यूब (चित्रा 3A) के वांछित क्षेत्र के पर पीतक झिल्ली में छोटे छेद के आंसू.
  2. घंटी भ्रूण के लिए समाधान की एक बूंद जोड़ें. देखभाल करने के लिए घंटी के समाधान में पूरा करने के लिए ऊतक के निर्जलीकरण को रोकने की प्रक्रिया के दौरान पूरी तरह से जलमग्न भ्रूण रखने के लिए. यदि आवश्यक हस्तांतरण विंदुक के माध्यम से भ्रूण की सतह घंटी समाधान की बूँदें जोड़ने रखें.
  3. खींच गिलास सुई का प्रयोग, ध्यान से विजय - स्तम्भ और क्षमताओंमोरूमी ज़मीन पर कब्जे का हक अनुप्रस्थ और पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब में ब्याज की लंबाई क्षेत्र के लिए इसी चीरों. (खींच गिलास सुई सिलिकॉन गिलास केशिका ट्यूब जो एक सुई खींच उपकरण के साथ किया गया है गर्मी के तहत खींच से उत्पन्न होते हैं.) एकतरफा grafts के लिए चीरों केवल पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब के लुमेन के लिए विस्तार करना चाहिए और द्विपक्षीय grafts करने के लिए, भर में चीरों पूरे पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब. तो के पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब और paraxial mesoderm के बीच द्विपक्षीय कटौती.
  4. न्यूरल ट्यूब से ध्यान से excised explant अलग तो एक गिलास micropipette (3B चित्र) में aspirating भ्रूण से इसे हटाने.

4. दाता भ्रष्टाचार ऊतक तैयार

  1. एक मंच से मिलान बटेर भ्रूण चुनें. भ्रूण ए.ए. संदंश के साथ नीचे पकड़, पीतक झिल्ली को हटा दें और आबकारी न्यूरल ट्यूब के समान आकार के क्षेत्र के रूप में ऊपर वर्णित (3.3-3.4) (चित्रा '3A' बी). अपने प्रयोग की जरूरतों पर निर्भर करता है, इस क्षेत्र हो सकता हैमेजबान (लड़की) न्यूरल ट्यूब या पूरक समास में प्रयुक्त रूप से दुम का अक्ष के साथ एक अलग क्षेत्र से क्षेत्र. (नायब: बड़ा पूरा न्यूरल ट्यूब grafts के सहित क्षेत्रीय grafts के, के लिए, शोधकर्ताओं ने इस कदम पर एक protease पाचन जोड़ने दाता ऊतक प्रत्यारोपण करने से पहले से किसी भी पक्षपाती mesenchymal ऊतक निकालने हालांकि इच्छा हो सकती है, प्रारंभिक अवस्था में छोटे पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब grafts के लिए. , के रूप में यहाँ विस्तृत है, protease पाचन के लिए आवश्यक के रूप में न्यूरल ट्यूब आसानी से सख्ती से शल्य चिकित्सा तकनीक द्वारा आसन्न mesenchyme से अलग नहीं है.)

5. भ्रष्टाचार ऊतक

  1. एक गिलास घंटी समाधान युक्त micropipette दाता explant में महाप्राण (व्यंजन). विंदुक में किसी भी बुलबुले परिचय नहीं सावधान रहो.
  2. लड़की मेजबान के excised क्षेत्र के निकट explant स्थानांतरण. खींच लिया गिलास सुई का प्रयोग, पूरबी और धीरे ablated (चित्रा -3 सी) क्षेत्र में मार्गदर्शन explant.
  3. ध्यान से घंटी समाधान की कुछ बूँदें जोड़नेभ्रूण के लिए निर्जलीकरण को रोकने के लिए. देखभाल करने के लिए तरल सीधे भ्रष्टाचार साइट पर इस भ्रष्टाचार के रूप में जगह देना हो सकता है छोड़ने से बचने के.
  4. सील टेप पैकिंग के साथ खिड़की. सुनिश्चित करें कि टेप विंडोड अंडे के पूरे क्षेत्र जवानों. यह बाद में ऊष्मायन के दौरान निर्जलीकरण और भ्रूण के संक्रमण से बचाता है.
  5. इनक्यूबेटर में वांछित चरण तक अंडे लौटें. सुनिश्चित करें कि "कमाल" समारोह बंद कर दिया है, जबकि chimeras incubating के. अंडे धीरे दो बार एक दिन के रूप में यह उनकी व्यवहार्यता बढ़ाने अगर विकास के बाद के चरणों को लक्षित कर रहे हैं हो सकता है हाथ से दिया जा सकता है.

6. प्रोटोकॉल के लिए chimeric भ्रूण तैयार

  1. प्रयोगात्मक endpoint में दूर ठीक कैंची का उपयोग कर खिड़की को कवर टेप में कटौती.
  2. घुमावदार परितारिका संदंश (दाँतेदार सुझावों के साथ आसान करने के लिए है) के साथ निषिक्त के किनारे समझ है, तो भ्रूण दूर 4 निषिक्त की सीमाओं के बाहर बड़ी कटौती के साथ की जर्दी से कटौती. घंटी समाधान युक्त एक पेट्री डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण. ध्यान रखना हवा के भ्रूण के जोखिम को कम करने में ऊतक के निर्जलीकरण से बचने के लिए.
  3. Stereomicroscopy के तहत, धीरे पीतक झिल्ली 5 # संदंश का उपयोग कर निषिक्त से अलग हैं.
  4. पकवान में ध्यान से भ्रूण ताकि भ्रूण की व्यवस्था एक ही ओरिएंटेशन में है के रूप में यह अंडे में आसपास के बाहर रखी फ्लैट झिल्ली के साथ,.
  5. टंगस्टन तारों 64 से सफाई से भ्रूण से तार टंगस्टन डिश के तल के समानांतर की लंबाई के साथ भ्रूण और extraembryonic ऊतकों की सीमा पर सुई, व्यवस्था से आसपास के निषिक्त हटाने सुइयों विदारक का प्रयोग करें. एक कोमल काटने का कार्य गति का उपयोग करने के लिए ऊतकों के माध्यम से कटौती.
  6. # 5 संदंश के साथ सावधानी से भ्रूणावरण हटा दें. इस बिंदु पर, आप या तो चाहते हैं कि अपने हित के आगे क्षेत्र काटना, या भ्रूण पूरे छोड़ सकता है.
  7. बर्फ के ठंडे 4% paraf की भ्रूण स्थानांतरणऔर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर रॉक ormaldehyde
  8. नमूने तैयार और क्रायो या पैराफिन प्रोटोकॉल के लिए एम्बेड.

मेजबान भ्रूण ऊतक के भीतर grafted ट्रेस. वहाँ एक लड़की सहित भ्रूण बटेर nucleoli hematoxylin धुंधला द्वारा पता लगाने (बटेर नाभिक बहुत बड़े, काले लड़की नाभिक से धुंधला inclusions के), प्रतिक्रिया Feulgen - Rossenbeck, acridine नारंगी या बिज़ benzamide दाग, बटेर ऊतक के भीतर की पहचान करने के लिए कई तकनीकें हैं इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, बटेर विशेष 3,47,65,66 प्रतिजनों के लिए या immunolabeling के साथ संयुक्त है. यहाँ हम QCPN प्रतिजन और मानक पूरे माउंट या अनुभाग immunofluorescence तकनीक का उपयोग बटेर लड़की chimeras (चित्रा 4) में बटेर तंत्रिका शिखा कोशिकाओं की पहचान. इस तकनीक प्रयोगात्मक डिजाइन में सबसे अधिक लचीलापन प्रदान करता है, के रूप में QCPN immunofluorescence भी अन्य एंटीबॉडी के साथ संयुक्त किया जा सकता है विभेदित दाता ऊतक (बटेर) से ली गई कोशिकाओं की पहचान है. Standa का प्रयोग करेंपूरे आरोह तीसरी या अनुभाग immunofluorescence तकनीक लिए chimeras में बटेर व्युत्पन्न कोशिकाओं लेबल.

7. प्रतिनिधि परिणाम

6 फिर से ऊष्मायन के बाद न्यूरल ट्यूब की grafted क्षेत्र के प्रतिनिधि छवि (HH11) निगमन (लड़की) मेजबान तंत्रिका ट्यूब (4A चित्रा) में grafted दाता ऊतक (बटेर) की उम्मीद से पता चलता है. भ्रूण reincubation के बाद भ्रष्टाचार का अधूरा एकीकरण, या असममित कपालीय क्षेत्र या somites के के विकास दिखा खारिज किया जाना चाहिए.

Grafted क्षेत्र के माध्यम से HH11 शो HNK-1 laterally न्यूरल ट्यूब से दूर पलायन के साथ लेबल एनसीसीएस अनुभाग पार. बटेर एनसीसी प्रवासी स्ट्रीम करने के लिए योगदान है, और न्यूरल ट्यूब कोशिकाओं है, स्पष्ट रूप से QCPN (4B चित्र) के साथ लेबल रहे हैं.

बाद के चरणों में, बटेर एनसीसी व्युत्पन्न कोशिकाओं के अपने अंतिम लक्ष्य के ऊतकों को पता लगाया जा सकता है. QCPN लेबल की कोशिकाओं लड़की भ्रूण mesenchyme भीतर interspersed हैंE5 (चित्र 4C) में दाढ़ की हड्डी का प्रक्रिया की.

QCPN प्रतिरक्षी अन्य एंटीबॉडी के साथ आसानी से जोड़ा जा सकता है के लिए मेजबान वातावरण में बटेर व्युत्पन्न एनसीसीएस का भेदभाव की जांच. बटेर एनसीसी व्युत्पन्न त्रिपृष्ठी संवेदी न्यूरॉन्स QCPN हैं और Tuj1 एंटीबॉडी (चित्रा 4D) द्वारा चिह्नित कर रहे हैं.

चित्रा 1
आकृति 1. प्रयोगात्मक प्रक्रिया और आवश्यक उपकरणों का अवलोकन ए) (लड़की) मेजबान और दाता भ्रूण (बटेर). चरण मिलान होना चाहिए. एनसीसी धारा कि त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि और maxillo जबड़े क्षेत्र के लिए योगदान देता है लेबल, HH9 आदर्श है. HH9 पर, न्यूरल ट्यूब विजय - स्तम्भ क्षेत्र में बंद की शुरुआत है, लेकिन पूरी तरह अभी तक सील नहीं. चित्र में ग्रे लाइन समापन तंत्रिका ट्यूब के midline का प्रतिनिधित्व करता है. उन्हें बिंदीदार सफेद लाइनों मेजबान और दाता से न्यूरल ट्यूब के दाईं ओर के एक मध्यमस्तिष्क क्षेत्र excising के लिए कट लाइनों से संकेत मिलता हैbryos. मेजबान भ्रूण के excised क्षेत्र त्याग और दाता ऊतक में प्रतिरोपित लिए chimeric भ्रूण उत्पन्न. 18) 5ml सिरिंज साढ़े जी चमड़े के नीचे सुई, ख) एक 26 के साथ एमएल सिरिंज साढ़े 45 कोण, ग) ° भारत स्याही में जी चमड़े के नीचे सुई तुला, घ) स्पष्ट पैकिंग टेप, ई) मुँह pipetting के साथ कांच विंदुक: बी) के लिए आवश्यक उपकरणों में शामिल हैं तंत्र, च) 60 मिमी पेट्री डिश, छ) ए.ए. संदंश, घंटे) दाँतेदार युक्तियाँ, मैं साथ घुमावदार परितारिका संदंश) # 5 संदंश, जे) ठीक कैंची, कश्मीर) टंगस्टन तार तेज, एल) कांच सुई, मीटर) parafilm के खींच लिया वर्गों.

चित्रा 2
चित्रा 2. अंडे और भ्रूण की तैयारी.) अंडे के क्रॉस अनुभागीय आरेख, 18 के आदर्श सम्मिलन बिंदु सहित आधा जी albumin प्रकाश की वापसी के लिए चमड़े के नीचे सुई. बी) प्रकाश albumin की ~ 3ml वापस लेने के बाद, अंडा भीतर की जर्दी और भ्रूण को कम करती है, शोधकर्ताओं टी में एक "खिड़की" (तीर) में कटौती करने के लिए अनुमति देता हैवह भ्रूण का उपयोग eggshell. भारत स्याही, बाँझ घंटी समाधान में जलमिश्रित 1:10, तो निषिक्त नीचे अंतःक्षिप्त किया जा सकता है भ्रूण की आसान मंचन के लिए विपरीत प्रदान. सी) भनक के बाद चिकी भ्रूण.

चित्रा 3
चित्रा 3. योजनाबद्ध और कलम बांधने का काम प्रक्रिया के प्रत्येक चरण के में एचएच चरण 9 दाता और मेजबान भ्रूण के उदाहरण एक) चिकी मेजबान भ्रूण. चित्र में धराशायी लाइनों से संकेत मिलता है जहां पीतक झिल्ली कलम बांधने का काम के लिए कपाल क्षेत्र का उपयोग करने के लिए फट जाना चाहिए. एक बार पीतक झिल्ली के फटे त्रिकोणीय प्रालंब दुमदारी से खुली किया जाना चाहिए. छवि बॉक्स में (ईसा पूर्व) में इस्तेमाल किया इनसेट इंगित करता है. ए) बटेर दाता भ्रूण. छवि दाता भ्रूण के अंडे से excised और भ्रष्टाचार ऊतक के विच्छेदन के लिए पेट्री डिश में रखा है. छवि बॉक्स में इनसेट इंगित करता है में प्रयोग किया जाता है (बी). योजनाबद्ध आरेख में धराशायी लाइनों (एक) का संकेत मिलता है जहां पीतक और जर्दी झिल्ली क्रम में टी को दूर करने के लिए कटौती की जानी चाहिएवह अंडे से भ्रूण. बी) तंत्रिका ट्यूब excised भ्रष्टाचार (सफेद तीर) का इंतजार कर के एकतरफा मध्यमस्तिष्क क्षेत्र के साथ होस्ट को भ्रूण. योजनाबद्ध आरेख में बिंदीदार रेखा इंगित करता है जहाँ कटौती मध्यमस्तिष्क क्षेत्र में आबकारी न्यूरल ट्यूब बनाया जाना चाहिए. Excised 'बी) पृष्ठीय न्यूरल ट्यूब भ्रष्टाचार ऊतक के साथ दाता भ्रूण (भ्रष्टाचार ऊतक काला तीर द्वारा संकेत). आरेख में डॉटेड रेखा इंगित करता है जहां कटौती न्यूरल ट्यूब मध्यमस्तिष्क क्षेत्र की कलम बांधने का काम एकतरफा उत्पाद दाता ऊतक बटेर भ्रूण में किया जाना चाहिए. सी) बटेर पृष्ठीय तंत्रिका ट्यूब explant के को लड़की मध्यमस्तिष्क क्षेत्र में कलम बांधने का काम के बाद chimeric भ्रूण.

चित्रा 4
चित्रा 4. Immunofluorescence बटेर - chimeric भ्रूण में दाता व्युत्पन्न कोशिकाओं में विशिष्ट परमाणु प्रतिजन QCPN के) HH11 कल्पना (पर grafted HH9) लाल में QCPN धुंधला दिखा रहा है, और HNK-1 धुंधला (एनसीसीएस पलायन करने के एक मार्कर के पूरे माउंट छवि का पता लगाने.) मेंहरे रंग. 10X बढ़ाई, पृष्ठीय देखने के. बी) (ए) में भ्रूण के माध्यम से क्रॉस अनुभाग, न्यूरल ट्यूब और प्रवासी एनसीसी HNK 1 (हरा) के साथ सह दाग में QCPN पॉजिटिव बटेर ली गई कोशिकाओं दिखा. 40X बढ़ाई. सी) कल्पना E5 की दाढ़ की हड्डी का प्रक्रिया के माध्यम से क्रॉस अनुभाग 3 दिनों के बाद भ्रष्टाचार के लिए incubated रहे (), दिखा QCPN सकारात्मक एनसीसी व्युत्पन्न कोशिकाओं (लाल) जो न्यूरल ट्यूब की भ्रूण में अपने अंतिम स्थान पर grafted क्षेत्र से चले गए. 10X बढ़ाई. डी E5 बटेर की कल्पना दिखा योगदान त्रिपृष्ठी (लाल) TuJ1 सकारात्मक न्यूरॉन्स (हरा) में और नाड़ीग्रन्थि भेदभाव एनसीसी व्युत्पन्न के माध्यम से) की धारा. 40X बढ़ाई. *, एनसीसीएस, सांसद, दाढ़ की हड्डी का प्रक्रिया, एनटी, न्यूरल ट्यूब, टीजी, त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि.

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Discussion

मेजबान लड़की भ्रूण में बटेर न्यूरल ट्यूब की कलम बांधने का काम यहाँ वर्णित समास में प्रयुक्त रूप से दुम का 21,67-69 अक्ष के साथ विभिन्न क्षेत्रों से चलाई एनसीसीएस पलायन की विशिष्ट subpopulations अनुरेखण के लिए एक सरल और कम खर्चीली तकनीक है. इस तकनीक एवियन भ्रूण (के रूप में स्तनधारी भ्रूण की तुलना में) के लिए उपयोग में आसानी के लाभ लेता है और ऊतक पृथक, निरोधात्मक अणुओं का इंजेक्शन, या आनुवंशिक हेरफेर अभिव्यक्ति plasmids के electroporation के माध्यम से जैसे अन्य तकनीकों के साथ जोड़ा जा सकता है, प्रयोगात्मक जांच विशिष्ट प्रवासी एनसीसी आबादी के 47,69 भ्रूण के भीतर विभिन्न विकासात्मक संकेत करने के लिए प्रतिक्रिया.

बटेर लड़की chimeras एनसीसी प्रवास और भेदभाव की जांच, और इस तकनीक को न्यूरल ट्यूब के अलावा अन्य ऊतकों के प्रत्यारोपण में शामिल करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हैं. लड़की भ्रूण में बटेर ऊतक की कलम बांधने का काम अच्छी तरह से स्थापित तकनीकोंई 13,21,70-76, लेकिन सबसे अच्छा दृश्य प्रदर्शन से सीखा है, के रूप में तंत्रिका ट्यूब के छोटे क्षेत्रों की microdissection बहुत ठीक मोटर कौशल की आवश्यकता होती है.

व्युत्पन्न कोशिकाओं क्योंकि बटेर विशिष्ट एंटीबॉडी बटेर QCPN साथ Immunostaining के माध्यम से आसानी से किया जा सकता है मेजबान लड़की कोशिकाओं से प्रतिष्ठित, न्यूरल ट्यूब के विशिष्ट क्षेत्रों से उत्पन्न होने वाली एनसीसीएस की विकास क्षमता प्रयोगात्मक दाता कोशिकाओं (बटेर) के भेदभाव से inferred किया जा सकता है अंत बिंदु, उदाहरण के लिए, periocular क्षेत्र और कॉर्निया में QCPN सकारात्मक कोशिकाओं की उपस्थिति, लड़की भ्रूण मध्यमस्तिष्क क्षेत्र में HH9 में बटेर न्यूरल ट्यूब कलम बांधने का काम करने के बाद इस क्षेत्र से corneal endothelium और 77 stroma को जन्म दे कि प्रवासी तंत्रिका शिखा इंगित करता है. न्यूरल ट्यूब HH9-10 grafts के त्रिपृष्ठी नाड़ीग्रन्थि और गिल चाप एनसीसी योगदान प्रकट करते हैं. इसके अलावा, बटेर व्युत्पन्न संवेदी न्यूरॉन्स एक और बटेर न्यूरॉन विशिष्ट QN () के 78,79 एंटीबॉडी का उपयोग कर पता लगाया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

लेखक पांडुलिपि की आलोचना के लिए Lwigale प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. SLG रूथ एल राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (EY02167301 F32) से Kirschstein एनआरएसए फैलोशिप द्वारा समर्थित है. PYL राष्ट्रीय नेत्र संस्थान (EY018050) द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chick eggs Various
Quail eggs Various
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC) Poultry Supply 1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated Fine Science Tools 11210-10
Scotch tape Any Supplier
Curved Iris forceps Fine Science Tools 11065-07
India ink Any Supplier
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution VWR international 101447-068
Clear Packing tape Any Supplier
Needle pulling apparatus Narishige International PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube Kimble Chase 34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾" Pasteur pipette Fisher Scientific 13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette) Sigma-Aldrich A5177-52A
Dumont #5 forceps Fine Science Tools 11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter VWR international AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder) Fine Science Tools 26018-17
QCPN antiserum Developmental Studies Hybridoma Bank QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1) Invitrogen A21125
Ringer’s Solution (2L):
  • 14.4g NaCl
  • 0.34g CaCl2
  • 0.74g KCl
  • 0.230g Na2HPO4
  • 0.04g KH2PO4
  • ddH2O to 2L
  • Filter and autoclave
 Fisher Scientific
  • 7647-14-5
  • 10043-52-4
  • 7447-40-7
  • 7558-79-4
  • 7778-77-0

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Griswold, S. L., Lwigale, P. Y.… More

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