跨物种移植神经嵴迁移和分化的分析

Summary

描述的分析禽流鹌鹑鸡嵌合胚胎的神经嵴细胞的迁移和最终命运的方法。此方法是一种简单明了的技术追踪神经嵴细胞迁移和分化的过程中，否则难以区分，在未添加鸡胚。

Abstract

鸡胚胎提供一个独特的平台，为研究许多脊椎动物发育过程中，由于蛋内的胚胎方便。嵌合胚胎禽流感，鹌鹑捐助组织移植到鸡胚大毛 ，结合由禽流胚胎提出的操纵方便了不可磨灭的细胞群的遗传标记的权力。

鹌鹑鸡嵌合体是一个追踪迁徙的神经嵴细胞（NCC）的^1-3古典的工具。 NCC的是胚胎细胞在一个短暂的迁徙人口，这源于在区域发展中的神经管⁴背。他们接受的上皮间质转化，并随后迁移到其他地区的胚胎，它们分化 ​​成各种细胞类型，包括软骨^{5-13，11,14-20}黑色素细胞，神经细胞和神经胶质^21-32。 NCC的是多向的，他们的最终命运是influenced由1）该地区的神经管中，他们沿着源自胚胎^11,33-37，2 rostro尾轴）从邻近的细胞信号作为他们迁移^38-44，和3），其最终的微胚胎内的目标^45,46。追踪从他们的起源点在神经管细胞，其最终的胚胎内的地位和命运，图案和器官的发育过程的调节提供了重要的线索。

捐助者的神经管（伦嫁接）或不同地区的捐助者的神经管（异位嫁接）互补地区移植可以揭示沿rostro尾轴^2,47 NCC的预规范的差异。这种技术可以进一步适应移植的神经管单方面车厢，一边是从供体组织取得，对侧遗体在宿主胚胎，易建联泰然自若elding ^2,47在同一样品的内部控制。它也可以适应在以后的胚胎移植脑段，HH10后，当前神经管已经关闭了^47。

在这里，我们报告通过神经管移植，允许从离散的神经管段的候鸟NCC的跟踪产生的鹌鹑鸡嵌合体的方法。具体物种的鹌鹑，的具体QCPN抗体^48-56捐助源性干细胞的标记，允许研究者区分捐助国和宿主细胞在实验终点。这种技术很简单，价格低廉，并有许多应用，包括命运的映射，细胞谱系的追踪，并确定预图案，沿rostro尾轴^45。由于易于访问禽流胚胎，鹌鹑鸡移植技术可以与其他操作相结合，包括但不限于镜头消融⁴0，注射抑制分子^57,58，或通过基因表达质粒^59-61电操纵，特别是在胚胎的发育程序的扰动NCC的迁徙流识别的响应。此外，这种嫁接技术也可能被用来产生其他如鹌鹑，鸭嵌合体间的嵌合胚胎研究华北贡献颅面形态，或鼠标鸡嵌合体小鼠遗传学的力量结合禽流胚胎操纵方便⁶²

Protocol

1。孵化小鸡和鹌鹑蛋所需的阶段

HH9胚胎，典型的孵化时间范围从29-33小时，在38°C的⁶³

1. 鸡蛋用温水洗净任何碎片。
2. 横向排列托盘上的鸡蛋。用铅笔标记面朝;这将对应的胚胎将局部区域。孵化鹌鹑蛋的钝端。
3. 在38个地点°C间湿润的孵化器。打开摇摆功能。

2。准备鸡蛋的窗口和解剖

1. 从孵化器中删除的鸡蛋，并用70％乙醇消毒的上衣。这是最好的喷乙醇和用纸巾或Kimwipe的避免任何乙醇的吸收，通过蛋壳迅速擦掉。
2. 放置到一个单独的鸡蛋持有人（我们使用培养皿内衬折叠纸巾，例如，“Kimwipes”的）鸡蛋。使用AA钳，挖掘小HOLE蛋壳的蛋尖底上表面。
3. 删除1.5 3ML 18½Ğ皮下注射针和5毫升注射器从鸡蛋白蛋白的光。这是最好的，面临的锥尖底的蛋（图2A），成孔垂直插入针。通过这种方式，被撤回白蛋白时，是通过吸蛋黄意外损坏的风险不大。丢弃的白蛋白。这一步将降低内蛋黄和胚胎，以便在蛋壳打开一个窗口。
4. 用70％乙醇擦拭孔如上所述，并用透明胶带密封。重要的是，孔周围的蛋壳是完全缺乏白蛋白和干或不密封胶粘剂。
5. 与机管局钳，点选另一个洞，不是很显着的水平鸡蛋上表面到顶点。小心，不要让镊子去太远通过蛋壳，以避免损坏蛋黄或胚胎。
6. 在沙地成孔平行鸡蛋壳的弧形光圈镊子的一侧。捏壳上，工作中的圆周运动，打破1〜2厘米直径窗口，在鸡蛋壳。丢弃删除蛋壳。另外，包括用包装带鸡蛋上表面，并用一把剪刀剪出窗口。这可以最大限度地减少落入鸡蛋的蛋壳碎片的机会。胚胎应该会出现蛋黄上的不透明光盘。丢弃任何未受精的蛋（蛋黄表面上的白色小点，或胚盘的情况下确定）。
7. 注入少量墨汁（稀释在无菌林格氏液包含“钢笔/链球菌”的解决方案1:10抗生素：终浓度为100微克/ mL青霉素和100μg/ mL链霉素）协助举办胚胎的胚下方。用1 mL注射器和26½Ğ皮下注射针，锥朝上弯曲成45°角进针的基地，另外，马y使用一把拉住玻璃巴斯德吸管口移液设备（注射器针头弯曲或打破玻璃针时戴上保护眼睛的）。穿刺外胚外围的卵黄膜和滑动针尖下的胚胎，蛋黄表面接近，但不是在胚层（图2B）。注入足够的墨水勾勒出胚胎，然后小心地撤出针（图2C）。注入墨水过多，可导致胚胎死亡。重要的是，不注入任何气泡下方的胚胎，因为这可以是一个污染源。注：在此过程中使用的所有林格氏液消毒，并包含上述定义的画笔/链球菌。无菌磷酸盐缓冲液（PBS）也是一个可接受的替代林格在解决本协议的所有步骤。
8. 根据汉堡包和汉密尔顿⁶³阶段的胚胎和记录的永久性墨水或铅笔在蛋壳上的阶段。下立方米，是最好的评估阶段omicroscopy，与光纤的“鹅颈”光源，其中有一个有限的热负荷。
9. 适用于2-3滴温暖无菌林格氏液胚胎的表面，以防止脱水和污染。暂时封住封口膜在蛋的表面伸出的窗口。
10. 重复步骤开始之前移植实验与所有鸡蛋2.2-2.9。
11. 由于鹌鹑胚胎只用于捐助者组织， 在OVO步骤2.2-2.9可以省略。为前囊胚OVO准备，鹌鹑蛋的孵化钝边，弯钳在这一地区开揭示了胚胎。用解剖剪刀，削减通过卵黄膜和胚胎外胚盘（确保所有削减满足）在一个正方形的形状。使用弯曲的虹膜钳，轻轻抓住一切缘和电梯从鸡蛋胚胎，并将其转移到林格在培养皿中的解决方案。另外，可以使用曲线ð虹膜镊子解除下，或胚胎勺或塑料移液管，通过广泛的气缸部分削减，可用于切除胚胎转移的胚胎蛋。 ＃5镊子轻轻取出卵黄膜。如上收集剩下的鹌鹑胚胎，在解剖显微镜下举行。

3。准备主机接受移植的胚胎

1. 从主机（鸡）胚胎取出封口膜，并用削尖的钨针或＃5镊子，撕裂卵黄膜的小孔，在神经管（图3A）的理想地区。
2. 加入林格氏液对胚胎的下降。注意保持完全淹没在林格在整个过程的解决方案，以防止脱水的组织的胚胎。保持胚胎的表面如果有必要通过转移移液器加入几滴林格氏液。
3. 使用拉玻璃针，仔细延髓和CAudal相应的兴趣背神经管的长度和地区的横向切口。 （拉玻璃针从硅玻璃毛细管针拉仪器已在热拉。）切口单侧移植只应延伸到背神经管的管腔，并为双边移植，使切口跨越整个背神经管。然后削减双边之间的背神经管和近轴中胚层。
4. 仔细分离切除外植体，然后从神经管从胚胎中取出吸成玻璃微（图3B）。

4。准备捐赠移植组织

1. 选择一个阶段匹配的鹌鹑胚胎。同机管局钳下来的胚胎，去除卵黄膜，消费的神经管类似大小的区域，如上所述（3.3-3.4）（图3A'-B“）。根据实验的需要，这个地区可能是一个主机（鸡）神经管或从不同地区沿rostro尾轴互补的区域。 （注：对于较大区域的移植，包括完整的神经管移植，研究人员可能希望在这一步中添加蛋白酶消化，以消除任何附着捐助组织移植前骨髓间充质组织，但对小背神经管移植，在早期阶段。蛋白酶消化，这里详述，没有必要为神经管很容易被从邻近的间质分离，严格的手术技巧。）

5。移植的组织

1. 含有林格氏液的玻璃微吸管吸成捐助外植体。要小心移液器不引入任何气泡。
2. 转让的外植体切除鸡主机地区毗邻。使用拉玻璃针，外植体的方向，轻轻地引导到消融区（图3C）。
3. 仔细林格氏液添加几滴胚胎，以防止脱水。照顾，以避免下降液体直接移植网站上，因为这可能撞出移植。
4. 包装胶带封住窗口。确保胶带密封的整个地区的窗口蛋。这可以防止脱水和污染的胚胎，在随后的培养。
5. 返回蛋的孵化器，直到所需的阶段。确保“摇摆”功能被关闭，同时孵化的嵌合体。鸡蛋可以轻轻打开手一天两次，因为这可能会增加他们的生存能力，如果以后的发展阶段有针对性。

6。准备嵌合胚胎切片

1. 在实验终点，磁带覆盖窗口使用细剪刀剪去。
2. 把握胚盘边缘的弧形光圈钳（最容易做的锯齿提示），然后切从蛋黄中的胚胎离4大幅削减外胚边界。 胚胎转移到培养皿中含有林格氏液。照顾，以尽量减少暴露在空气胚胎为了避免脱水的组织。
3. 在立体显微镜下，轻轻分开使用＃5镊子胚卵黄膜。
4. 精心安排在菜的胚胎，使胚胎在同一方向，因为它是在鸡蛋周围奠定了平膜。
5. 用解剖针从钨丝⁶⁴干净地从胚胎中取出安排在胚胎和胚外组织的边界针，钨丝平行盘底部的长度，周围的胚。使用温和的锯议案通过削减组织。
6. ＃5镊子小心取出羊膜。在这一点上，你可能会想无论是进一步剖析你感兴趣的地区，或留下的胚胎整体。
7. 胚胎转移到冰冷的4％paraformaldehyde和岩石在4°C过夜
8. 准备样品和嵌入冷冻或石蜡切片。

跟踪主机内的胚胎移植的组织 。鹌鹑组织内的鸡胚，包括苏木素染色检测鹌鹑核仁（鹌鹑核有非常大的，颜色较深的比小鸡核染色包裹），Feulgen反应Rossenbeck反应的，吖啶橙或商务苯甲酰染色确定有几个技巧结合电子显微镜，或鹌鹑特定抗原的免疫标记^{3,47,65,66。}这里我们使用QCPN的抗原和免疫技术标准的整体安装或部分，以确定鹌鹑鹌鹑鸡嵌合体（图4）神经嵴细胞。这项技术在实验设计提供了最大的灵活性，作为QCPN免疫可能也可以与其他抗体相结合，以确定来自捐助（鹌鹑）组织的分化细胞。使用standa路全安装或部分免疫荧光技术标记鹌鹑源性干细胞在嵌合体。

7。代表结果

嫁接的神经管区域的重新孵化后的6H代表形象（HH11）预计嫁接捐助（鹌鹑）到主机（鸡）神经管（图4A）组织成立。胚胎出现后reinc​​ubation的完整集成的移植，或颅地区或体节的不对称发展，应该被丢弃。

通过嫁接地区跨越标示HNK-1迁移横向距离的神经管在HH11秀NCC的部分。鹌鹑细胞，促进NCC的迁徙流，神经管，都清楚地标示与QCPN（图4B）。

在稍后阶段，鹌鹑华北源性干细胞可以追溯到他们的最终目标的组织。 QCPN穿插标记细胞内的鸡胚间质E5公司（图4C）的上颌过程。

QCPN抗体可以很容易地与其他抗体结合检查鹌鹑源性NCC的主机环境中的分化。鹌鹑华北派生三叉感觉神经元由QCPN和Tuj1抗体（图4D）的标记。

图1。概述实验程序和必要的手段。）主机（鸡）和捐助国（鹌鹑）胚胎阶段匹配。标注的NCC流，有助于三叉神经节和颌面下颌地区，HH9是理想的。在HH9，神经管开始关闭在延髓区域，但尚未完全密封。在图中的灰色线代表中线神经管闭幕。点缀的白线，表明切除脑区的神经管的右侧，从主机和捐助的切割线，EMbryos。主机胚胎切除的地区将被丢弃，产生嵌合胚胎移植的供体组织。 b）必要的手段包括：18）5毫升注射器半Ğ皮下注射针，b）1 26毫升注射器半Ğ皮下注射45°角，Ç）印度墨针弯曲，ð）透明胶带，é）玻璃口移液吸管机管局钳，仪器，F）60毫米培养皿，G）H）带锯齿的提示，我的弧形光圈钳）＃5镊子，j）的罚款剪刀，K）削尖的钨丝，L）拉玻璃针封口膜，M）正方形。

图2。鸡蛋卵子和胚胎的制备A）横断面图，其中包括理想的插入点18½G为白蛋白的光撤出注射器针头。 b）在退出〜3毫升光白蛋白，蛋黄和胚胎降低蛋内，使研究人员能够减少在T的一个“窗口”（箭头）他蛋壳访问胚胎。墨汁，在无菌林格氏液1:10稀释，然后注入胚下方提供的胚胎容易分期的对比。 c）在墨鸡胚。

图3。原理和实例农户阶段9捐助和主机胚胎移植手术的每一步。）小鸡主机胚胎。图中虚线表明卵黄膜应撕下来访问颅地区进行嫁接。一旦撕裂卵黄膜三角瓣应尾端去皮。 （BC）的使用，在图像框表示插图。 A'）的鹌鹑捐赠胚胎。图片是从卵切除移植组织解剖，并放置到培养皿的捐赠胚胎。 （B'），用于在图像框表示插图。虚线示意图（A'），表明卵黄和卵黄膜应削减，以消除ţ他从鸡蛋胚胎。 B）与主机单方面脑区神经管切除（白色箭头），等待移植的胚胎。在原理图中的虚线表示，削减应在中脑区域神经管切除。 B“），供体胚胎神经管背侧移植组织切除（移植组织是由黑色箭头表示）。图中的虚线表示削减应在鹌鹑胚胎消费的捐助组织作出单方面的脑区的神经管嫁接。 c）嵌合胚胎后鹌鹑背神经管植嫁接到鸡脑区域。

图4。鹌鹑具体捐助者源性细胞在嵌合胚胎核抗原QCPN的免疫检测 ）全安装HH11（，HH9嫁接）嵌合体显示红色QCPN的染色，染色HNK-1（迁移NCC的标志形象）在绿色。 10X的放大倍率，背视图。二）横截面在（A），通过胚胎神经管和洄游华北HNK-1（绿色）联合染色QCPN积极鹌鹑细胞。 40X放大。 c）跨节通过上颌E5公司嵌合体的过程（培养后移植3天），显示QCPN阳性华北源性干细胞（红色），嫁接地区，他们的最终位置在胚胎神经管迁移。 10X的放大倍率。 d）第通过E5公司鹌鹑嵌合体显示派生华北三叉神经节（红色）和分化成TuJ1阳性神经元（绿色）的贡献。 40X放大。 *，NCCS，上颌过程MP;新台币，神经管;（TG），三叉神经节。

Discussion

鹌鹑神经管移植到主机鸡胚这里描述的是一个简单和廉价的技术跟踪特定亚群的迁移沿rostro尾轴^21,67-69来自不同地区产生的净捐助国。这种技术易于访问禽流胚胎（如哺乳动物胚胎相比）的优势，可与其他技术相结合，如组织消融，注射抑制分子，或通过电表达质粒的基因操纵，实验研究具体华北迁徙种群的反应不同的发展线索，在胚胎^47,69。

鹌鹑，鸡嵌合体是一个强大的工具，为研究华北迁移和分化，这种技术可以适应包括神经管以外的其他组织移植。鹌鹑组织移植到鸡胚是一套行之有效的techniqu^{é13,21,70-76，}但最好是通过可视化示范了解到，作为小区域的神经管的显微需要非常精细运动技能。

因为鹌鹑源性细胞可以很容易地从主机鸡胚细胞区别与鹌鹑特异性抗体QCPN，通过免疫组化，发展潜力的特定区域的神经管所产生的净捐助国可以推断捐助（鹌鹑）细胞分化的实验终点;例如，在眼周区域和角膜QCPN阳性细胞的存在，表明HH9鹌鹑神经管嫁接后进入小鸡胚胎中脑区域迁徙的神经嵴，从本地区引起角膜内皮细胞和基质^77。 HH9-10在神经管移植揭示华北三叉神经节和鳃弓的贡献。也可以跟踪使用另一个鹌鹑神经元特异性抗体^{（QN）78,79，}鹌鹑源性感觉神经元。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chick eggs	Various
Quail eggs	Various
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC)	Poultry Supply	1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated	Fine Science Tools	11210-10
Scotch tape	Any Supplier
Curved Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07
India ink	Any Supplier
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution	VWR international	101447-068
Clear Packing tape	Any Supplier
Needle pulling apparatus	Narishige International	PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube	Kimble Chase	34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter	VWR international	AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder)	Fine Science Tools	26018-17
QCPN antiserum	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1)	Invitrogen	A21125
Ringer’s Solution (2L): 14.4g NaCl 0.34g CaCl2 0.74g KCl 0.230g Na2HPO4 0.04g KH2PO4 ddH2O to 2L Filter and autoclave	Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0