ניתוח של הגירה קרסט בידול עצבית ועל ידי חוצה מינים להשתלות

Summary

הגישה לניתוח הגירה גורלו הסופי של העופות לפסגה תאים עצביים שליו, חומוס עוברים chimeric מתואר. שיטה זו היא טכניקה פשוטה וישירה לאיתור תאים עצביים לפסגה במהלך הגירה והבחנה שקשה אחרת להבחין בתוך העובר גוזל unmanipulated.

Abstract

עוברי העופות לספק פלטפורמה ייחודית לחקר תהליכים התפתחותיים רבים החוליות, בשל גישה קלה של עוברים בתוך הביצה. עוברי העופות chimeric, שבו הרקמה שליו התורם הושתלו העובר חומוס ב לג'ימי, לשלב את העוצמה של תיוג גנטי של אוכלוסיות תאים בל יימחה בקלות מניפולציה שהוצגו על ידי העובר העופות.

שליו, חומוס מפלצות הם כלי קלאסי עבור מעקב אחר תאים נודדים לפסגה עצביים (NCCs) ^1-3. NCCs הם אוכלוסייה נודדות חולפות של התאים בעובר, אשר מקורם באזור הגבי של ⁴ בפיתוח בצינור העצבי. הם עוברים אפיתל המעבר mesenchymal ובהמשך נודדים לאזורים אחרים של העובר, שם הם להתמיין לסוגי תאים שונים, כולל ^5-13 סחוס, מלנוציטים ^11,14-20, הנוירונים גליה ^21-32. NCCs הם multipotent, ואת גורלם האולטימטיבי שלהם משפיעיםenced לפי אזור 1) של הצינור העצבי שבו הם נובעים לאורך ציר rostro-הזנב של העובר ^11,33-37, 2) לאותות ששיגרו התאים הסמוכים כשהם נודדים ^38-44, ו - 3) microenvironment של האולטימטיבי שלהם היעד בתוך העובר ^45,46. מעקב אחר התאים האלה מנקודת המוצא אל הצינור העצבי, למיקום הסופי וגורלו בתוך העובר, מספק תובנה חשובה לתוך התהליכים ההתפתחותיים המווסתים דפוסים ו organogenesis.

השתלת אזורים משלימים של הצינור העצבי התורם (homotopic השתלת) או באזורים שונים של הצינור העצבי התורם (heterotopic השתלת) יכול לגלות הבדלים במפרט מראש של NCCs לאורך ציר rostro-הזנב ^2,47. טכניקה זו ניתן להתאים עוד יותר להשתיל תא החד צדדית של הצינור העצבי, כך שצד אחד נגזר רקמות התורם, ואת שרידי בצד הנגדי מוטרד בעובר המארח, ייelding הבקרה הפנימית בתוך מדגם זהה ^2,47. זה גם יכול להיות מותאמים עבור השתלת קטעי מוח עוברי מאוחר יותר, לאחר HH10, כאשר בצינור העצבי הקדמי סגר ^47.

כאן אנו מדווחים על טכניקות להפקת שליו, חומוס מפלצות באמצעות השתלת בצינור העצבי, אשר מאפשרים מעקב אחר NCCs נודדים שמקורם קטע נפרד של הצינור העצבי. מינים ספציפיים תיוג של התורם הנגזרות תאים עם נוגדן ספציפי QCPN שליו ^48-56 מאפשרת לחוקר להבחין התורם תאים המארחות בנקודת סיום הניסוי. טכניקה זו היא פשוטה, זולה, ויש לה יישומים רבים, כולל מיפוי, גורל, השושלת תא מעקב, זיהוי דפוסים מראש אירועים לאורך ציר הזנב ^rostro-45. בגלל הקלות של גישה העובר העופות, הטכניקה שליו, חומוס שתל עשוי להיות משולב עם מניפולציות אחרות, כולל אך לא רק, אבלציה העדשה ⁴0, הזרקה של מולקולות מעכבות ^57,58 או מניפולציה גנטית דרך electroporation של פלסמידים הביטוי ^59-61, כדי לזהות את התגובה של זרמים נודדות מיוחדות של NCCs על הפרעות בתוכנית ההתפתחות של העובר. יתר על כן, שיטה זו השתלת יכול לשמש גם כדי לייצר אחרים עוברים interspecific chimeric כמו שליו, ברווז מפלצות ללמוד תרומה NCC כדי המורפוגנזה Craniofacial או עכבר חומוס מפלצות לשלב את כוחה של הגנטיקה העכבר בקלות מניפולציה של העובר העופות . ⁶²

Protocol

1. דגירה אפרוח וביצים שליו לשלב הרצוי

עבור HH9 עוברים, זמני דגירה טיפוסי נע בין 29-33 שעות ב 38 ° C. ⁶³

1. לשטוף את כל הפסולת מן הביצים עם מים פושרים.
2. סדר ביצי תרנגולות על מגש אופקי. סמן את הצד כלפי מעלה בעיפרון, זה יתאים לאזור שבו העובר יהיה מקומי. דגירה שליו סוף ביצים בוטה למעלה.
3. מקום 38 ° C חממה humidified. הפעל את הפונקציה מתנדנד.

2. להכין ביצים חלונאות ו לנתיחה

1. הסר ביצים מ חממה, ואת לעקר ראשי עם אתנול 70%. מומלץ לרסס על אתנול ולנגב אותו במהירות עם מגבת נייר או Kimwipe כדי למנוע ספיגת אתנול דרך קליפת הביצה.
2. עוף במקום ביצה על בעל ביצה הפרט (אנו משתמשים בצלחת פטרי מרופדת במגבות נייר מקופלות, למשל, "Kimwipes"). באמצעות מלקחיים AA, הקש חול קטןדואר אל פני השטח העליון של קליפת בסוף המחודד של הביצה.
3. הסר 1.5-3mL אור אלבומין מן הביצה עוף עם מחט המזרק 18 ½ G ו 5 מ"ל במזרק. עדיף להכניס את המחט בצורה אנכית לתוך החור, עם שפוע מול סוף המחודד של הביצה (איור 2 א). בדרך זו, כאשר אלבומין יבוטל, יש סיכון קטן של פגיעה בטעות חלמון באמצעות שאיבה. מחק אלבומין. פעולה זו תפחית את החלמון ואת העובר בתוך הביצה, כדי לאפשר לחלון להיפתח קליפת הביצה.
4. נגב את החור עם אתנול 70% כאמור לעיל ואת החותם אותו עם נייר דבק. חשוב קליפת הביצה המקיף את החור הוא נטול לחלוטין של אלבומין יבש או דבק לא לאטום.
5. עם מלקחיים AA, הקש על עוד חור לתוך השטח העליון ניכרת של ביצה האופקי, לא בדיוק בשיא. יש להיזהר לא לתת את מלקחיים להגזים דרך קליפת הביצה כדי למנוע נזק חלמון או העובר.
6. בתוךבהלבשה צד אחד של מלקחיים מעוקלים איריס לתוך במקביל חור להפגיז את הביצים. צובט על הקליפה, עבודה בתנועה סיבובית כדי לשבור כמה ~ 2 ס"מ בחלון בקוטר של פגז ביצים עוף. מחק את קליפת הביצה להסירו. לחלופין, מכסים את פני השטח העליון של הביצה עם האריזה קלטת ולהשתמש זוג מספריים כדי לגזור את החלון. זו מקטינה את הסיכוי של פסולת קליפת הביצה ליפול. העובר אמור להופיע כדיסק אטום על גבי החלמון. לבטל את כל הביצים מופרות (מזוהה על ידי כתם לבן קטן על פני השטח של חלמון, או אי קיומו של blastoderm).
7. מזריקים כמות קטנה של הודו דיו (דילול 1:10 בתמיסת רינגר של סטרילית המכילה "פן / סטרפטוקוקוס" אנטיביוטיקה: הריכוז הסופי 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 100 מיקרוגרם פניצילין / סטרפטומיצין מ"ל) מתחת blastoderm לסייע בבימוי העובר. השתמש במזרק 1 מ"ל ו 26 וחצי מחט המזרק G, התכופף לתוך זווית ° 45 בבסיס המחט, עם שיפוע כלפי מעלה, לחילופין, אחד מאy להשתמש משך זכוכית pipet פסטר pipetting הפה המנגנון (משקפי מגן בעת ​​כיפוף מחט המזרק או שבירת מחט זכוכית). לנקב את קרום החלמון מחוץ למתחם של blastoderm והחלק את קצה המחט מתחת העובר, קרוב לפני השטח של חלמון אך לא את השכבות עובריים (איור 2 ב). להזריק רק דיו דיו כדי לשרטט את העובר, ולאחר מכן לסגת בזהירות את המחט (איור 2 ג). הזרקת דיו יותר מדי יכול לגרום למוות העובר. חשוב לא להכניס שום בועות אוויר מתחת העובר, כמו זה יכול להיות מקור הזיהום. הערה: כל פתרון של רינגר להשתמש בהליך זה היא עיקור ומכיל פן / דלקת כמוגדר לעיל. פוספט סטרילית בופר סליין (PBS) גם חלופה מקובלת על פתרון של הצלצול בכל השלבים של פרוטוקול זה.
8. שלב העובר על פי המבורגר המילטון ⁶³ ולהקליט את הבמה על קליפת הביצה בדיו קבע או עיפרון. בשלבים מוערכים ביותר תחת stereomicroscopy, עם סיבים אופטיים "מתכווננת" מקורות אור בהם יש עומס חום מוגבלת.
9. החל 2-3 טיפות פתרון רינגר סטרילית של חם על פני השטח של העובר כדי למנוע התייבשות וזיהום. באופן זמני לאטום את החלון עם parafilm נמתח על פני הביצה.
10. חזור על שלבים 2.2-2.9 עם כל הביצים חומוס לפני תחילת הניסויים השתלות.
11. מאז עוברים שליו משמשים רק רקמות התורם, בצעדים לג'ימי 2.2-2.9 יכול להשמיט. להכנת לג'ימי לשעבר של עוברים התורמות, ביצי שליו מודגרת בצד בוטה ופתחתי באזור זה עם מלקחיים מעוקלים כדי לחשוף את העובר. באמצעות מספריים המבתרים, לעשות ארבעה חתכים בצורת ריבוע דרך הממברנה vitelline ו blastoderm מחוץ לעובר (לוודא כי כל קיצוץ לפגוש). באמצעות מלקחיים מעוקלים איריס, בעדינות לתפוס קצה אחד לחתוך ולהרים את העובר מן הביצה ולהעביר אותו לפתרון אצבעות בצלחת פטרי. לחלופין, ניתן להשתמש עקומתד איריס מלקחיים להרים את העובר נכרת מתחת, או כף העובר או פיפטה העברת פלסטיק לחתוך את החלק הרחב של הגליל, ניתן להשתמש כדי להעביר את העובר מתוך הביצה. הוצא בעדינות את הממברנה vitelline עם # 5 מלקחיים. לאסוף את עוברי שליו הנותרים לעיל, ושלב אותם תחת מיקרוסקופ לנתח.

3. מכינים את העובר המארח לקבל שוחד

1. הסר parafilm מן המארח (חומוס) העובר באמצעות מחט טונגסטן חידד או # 5 מלקחיים, לקרוע חור קטן בקרום vitelline על האזור הרצוי של הצינור העצבי (איור 3 א).
2. הוסף טיפה של תמיסת רינגר לעובר. לדאוג לשמור את העובר שקוע לחלוטין בפתרון של רינגר במהלך ההליך כולו על מנת למנוע התייבשות של הרקמה. המשך להוסיף טיפות של תמיסת רינגר אל פני השטח של העובר באמצעות פיפטה העברת במידת הצורך.
3. באמצעות מחט זכוכית משך בזהירות את מקורי ו CAחתכים רוחביים udal המתאימים לאורך והאזור עניין הצינור העצבי הגבי. (מחטים זכוכית משכתי נוצרות מתוך צינורות סיליקון נימי זכוכית אשר היו משך תחת חום עם מחט משיכת המנגנון.) עבור שתלי חד צדדיים החתכים צריך רק להרחיב את לומן של הצינור העצבי הגבי, ועל שתלי בין שתי המדינות, לקבל את פני חתכים הצינור העצבי כל הגב. ואז לחתוך בילטרלי בין הצינור העצבי הגבי ו והמזודרם הפרקסיאלית.
4. בזהירות להפריד explant נכרת מן הצינור העצבי ואז להסיר אותו מעובר על ידי aspirating אל micropipette זכוכית (איור 3 ב).

4. מכינים את רקמת שתל מתורם

1. בחר בשלב בהתאמה העובר שליו. להחזיק את העובר למטה עם מלקחיים AA, להסיר את הקרום vitelline, והבלו לאזור דומה בגודל של הצינור העצבי כמתואר לעיל (3.3-3.4) (איור 3A'-B "). בהתאם לצרכים של הניסוי, האזור הזה יכול להיותהאזור המשלים של צינור המארח (חומוס) עצבית או מאזור אחר לאורך ציר rostro-הזנב. (הערה: על שתלי אזוריים גדולים יותר, לרבות מלאים שתלי בצינור העצבי, החוקרים מומלץ להוסיף העיכול פרוטאז בשלב זה להסיר את כל רקמת mesenchymal חסיד של רקמות התורם לפני השתלה עם זאת, עבור הגב שתלי קטנים בצינור העצבי בשלבים המוקדמים. כפי המפורט כאן, העיכול פרוטאז אין צורך בצינור העצבי כמו מופרד בקלות על ידי טכניקות כירורגיות בלבד מ mesenchyme הסמוך.)

5. השתלת רקמות

1. Aspirate explant התורם אל micropipette כוס המכילה בתמיסת רינגר. להיזהר לא להציג את כל בועות לתוך פיפטה.
2. העברת explant סמוך לאזור נכרת של המארח חומוס. באמצעות מחט זכוכית משך, המזרח explant בעדינות להדריך אותה באזור ablated (איור 3 ג).
3. בזהירות להוסיף כמה טיפות של תמיסת רינגרלעובר על מנת למנוע התייבשות. תשמרי על עצמך כדי למנוע נשירה נוזלי ישירות באתר שתל מכיוון שהדבר עלול לעקור את השתל.
4. לאטום את החלון עם האריזה קלטת. ודא כי הקלטת חותמות האזור כולו ביצה חלונות. פעולה זו מונעת התייבשות וזיהום של העובר במהלך הדגירה לאחר מכן.
5. להחזיר את הביצה החממה עד לשלב הרצוי. ודא כי פונקציית "נדנדה" כבוי בזמן דוגרים על מפלצות. ביצים ניתן פנה בעדינות ביד פעמיים ביום כמו זה עשוי להגביר את יכולת הקיום שלהם אם בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות ממוקדות.

6. הכן עוברים chimeric עבור חתך

1. על קצה ניסיוני, לחתוך את הסרט מכסה את החלון בעזרת מספריים עדינים.
2. לתפוס את הקצה של blastoderm עם מעוקל איריס מלקחיים (הקלה ביותר לעשות עם משוננת טיפים), ואז לחתוך את העובר מן החלמון עם 4 חתכים גדולים מחוץ לגבולות blastoderm. העברת העובר לצלחת פטרי המכילה בתמיסת רינגר. תשמרי על עצמך כדי לצמצם את החשיפה של העובר לאוויר על מנת למנוע התייבשות של הרקמה.
3. תחת stereomicroscopy, להפריד בעדינות את הממברנה vitelline מ blastoderm באמצעות מספר 5 מלקחיים.
4. בזהירות להסדיר את העובר בצלחת, כך העובר הוא בכיוון זהה כפי שהיה ביצה, עם קרום מסביב פרושות.
5. השתמש לנתח מחטים העשויים טונגסטן ⁶⁴ חוטים כדי להסיר בצורה נקייה blastoderm סביב מעובר על ידי סידור מחט בגבול העובר ורקמות extraembryonic, עם אורך של תיל טונגסטן במקביל לחלק התחתון של המנה. שימוש בתנועה ניסור עדין לחתוך את הרקמות.
6. מוציאים בזהירות את amnion עם # 5 מלקחיים. בשלב זה ייתכן, אם רוצים לנתח עוד את האזור של עניין, או לעזוב את כל העובר.
7. מעבירים את העובר כדי paraf קרח קר 4%ormaldehyde ורוק לילה ב 4 ° C.
8. הכינו דגימות ולהטביע על חתך cryo-או פרפין.

עקוב אחר רקמות מורכבים בתוך העובר המארח. קיימות מספר טכניקות לזיהוי רקמות שליו בתוך העובר חומוס, כולל זיהוי של שליו nucleoli ידי מכתים hematoxylin (גרעינים שליו יש גדולים מאוד, תכלילים צביעה כהה יותר גרעינים חומוס), התגובה Feulgen-Rossenbeck, acridine כתום או biz-benzamide כתם בשילוב עם מיקרוסקופ אלקטרונים, או immunolabeling עבור שליו אנטיגנים ספציפיים ^3,47,65,66. כאן אנו משתמשים אנטיגן QCPN ו-mount סטנדרטי כולו או בסעיף טכניקות immunofluorescence לזהות תאים עצביים לפסגה שליו שליו ב-חומוס מפלצות (איור 4). טכניקה זו מספקת גמישות מרבית בתכנון הניסוי, כפי immunofluorescence QCPN ניתן גם בשילוב עם נוגדנים אחרים כדי לזהות תאים הבדיל הנגזרות רקמות התורם (שליו). השתמש standaדרך הר שלם או immunofluorescence טכניקות סעיף לתייג שליו הנגזרות תאים מפלצות.

7. נציג תוצאות

תמונה מייצגת של האזור מורכבים של הצינור העצבי לאחר 6 שעות של דגירה מחדש (כדי HH11) מציגה שילוב צפוי של רקמות התורם מורכבים (שליו) לתוך שורה (חומוס) בצינור העצבי (תרשים 4 א). עוברים מראה אינטגרציה מושלמת של השתל, או התפתחות אסימטרית של האזור או somites גולגולתי לאחר reincubation אמור להיות מושלך.

לחצות קטע דרך האזור מורכבים על HH11 NCCs מופע שכותרתו עם HNK-1 נודדות רוחבית מן הצינור העצבי. תאים שליו התורמים זרם NCC הנדידה, וכן הצינור העצבי, מסומנים בבירור עם QCPN (איור 4B).

בשלבים מאוחרים יותר, שליו NCC שמקורם בתאי ניתן לייחס את רקמת היעד הסופי. תאים QCPN שכותרתו משובצים בתוך mesenchyme העובר גוזלתהליך לסתי ב E5 (איור 4C).

נוגדנים QCPN ניתן לשלב בקלות עם נוגדנים אחרים לבחון את הבידול של שליו הנגזרות NCCs בסביבה המארח. שליו NCC הנגזרות עצב סנסורי trigeminal מסומנים על ידי QCPN ו Tuj1 נוגדנים (איור 4D).

באיור 1. סקירה כללית של הליך ניסיוני ומכשירים הנדרשים. Host) (חומוס) ו התורמות (שליו) עוברים צריך להיות השלב בהתאמה. לתייג את הזרם NCC התורם גנגליון trigeminal maxillo ו-mandibular באזור, HH9 הוא אידיאלי. ב HH9, בצינור העצבי מתחיל לסגור באזור מקורי, אבל עדיין לא אטום לחלוטין. קו אפור דיאגרמות מייצג את קו האמצע של הצינור העצבי הסגירה. הקווים הלבנים המנוקדים להצביע על קווי לחתוך עבור גוזמות באזור המוח התיכון של הצד הימני של הצינור העצבי מן המארח תורם להםbryos. האזור נכרת העובר המארח נמחק ואת רקמות התורם מושתלים כדי ליצור את העובר chimeric. ב) הכלים הדרושים, כולל: מזרק) 5 מ"ל עם 18 ½ מחט G המזרק, ב) 1 מזרק מ"ל עם 26 ½ מחט G המזרק כפופות ב 45 דיו ° בהודו זווית, ג), ד ') קלטת האריזה ברור, ה) פיפטה זכוכית בפה pipetting המנגנון, ו) 60 מ"מ-פטרי צלחת, ז) AA מלקחיים, ח) מעוגלים עם מלקחיים איריס משוננת טיפים i) # 5 מלקחיים, מספריים י) בסדר, יא) חידד תיל טונגסטן, ל ') הוציא מחט זכוכית, מ') parafilm ריבועים.

איור 2. הכנת ביצים ועוברים.) חתך דיאגרמה של הביצה, כולל נקודת הכניסה האידיאלית של 18 ½ מחט המזרק G לנסיגה של אור אלבומין. ב) לאחר נסיגה ~ 3mL של אלבומין אור, החלמון ואת העובר בתוך הביצה מוריד, ומאפשר לחוקרים לחתוך "חלון" (חיצים) ב tהוא קליפת לגשת העובר. דיו בהודו, 1:10 מדולל בתמיסה סטרילית של רינגר, אז יכול להיות מוזרק מתחת blastoderm לספק לעומת זאת על הבימוי קל של העוברים. ג) צ'יק העובר לאחר דיות.

איור 3. סכמטי ודוגמאות של hh 9 עוברים שלב התורם המארח בכל שלב של הליך השתלת. העובר) אפרוח המארח. קווים מקווקווים מציינים היכן בדיאגרמה קרום vitelline יש נקרע לגשת לאזור הגולגולת של השתלת. נקרע פעם דש משולש של קרום vitelline יש קלופים caudally. תיבת בתמונה מצביע על השיבוץ נעשה שימוש (לפני הספירה). ') העובר שליו התורם. התמונה היא של עובר התורם נכרת מן הביצה והניח לתוך צלחת פטרי לנתיחה של רקמת השתל. תיבת בתמונה מצביע על השיבוץ נעשה שימוש (ב '). קווים מקווקווים ב תרשים סכמטי (א ') מציינים היכן vitelline וקרומים חלמון יש לחתוך על מנת להסיר tהוא עובר מן הביצה. ב) מארח עובר באזור עם המוח התיכון חד צדדי של הצינור העצבי נכרת (חיצים לבנים) מחכה השתל. הקו המקווקו בדיאגרמה סכמטית מציין היכן קיצוצים צריך להיעשות כדי צינור בלו עצבית באזור המוח התיכון. ) ב 'העובר התורם עם הגב רקמות בצינור העצבי שתל נכרת (רקמת השתל מצוין באמצעות ראשי חץ שחור). קו מקווקו בתרשים מציין היכן הקיצוצים צריכים להיעשות העובר שליו לרקמות התורם הבלו על השתלת חד צדדית של אזור המוח התיכון של הצינור העצבי. ג) העובר chimeric לאחר השתלת explant של הצינור העצבי הגבי שליו לאזור המוח התיכון בחורה.

באיור 4. Immunofluorescence שליו גילוי ספציפי QCPN אנטיגן הגרעיני תורם הנגזרות התאים בעובר chimeric.) כולו הר דמותו של HH11 כימרה (מורכבים על HH9) מראה מכתים QCPN באדום, ואת HNK-1 מכתים (סמן של נודדות NCCs) בתוךירוק. הגדלה 10x, נוף הגב. ב) חתך רוחב של העובר (א '), מראה QCPN חיובי שליו תאים שמקורם בצינור העצבי ואת NCC הנדידה שיתוף מוכתם HNK-1 (בירוק). בהגדלה 40X. ג) חתך בתהליך לסתי של E5 כימרה (מודגרות עבור השתל 3 ימים הודעה), מראה QCPN חיובי NCC שמקורם בתאים (אדום) אשר היגרו מאזור מורכבים של הצינור העצבי למיקום הסופי של העובר. בהגדלה 10X. ד) סעיף באמצעות תרומה E5 מראה כימרה של שליו נגזר NCC כדי גנגליון trigeminal (אדום) והבחנה אל TuJ1 חיובי נוירונים (ירוק). בהגדלה 40X. * NCCs: MP, תהליך לסתי, NT, בצינור העצבי, גנגליון TG, trigeminal.

Discussion

השתלת של הצינור העצבי שליו לעוברי חומוס המארחות המתוארת כאן היא טכניקה פשוטה וזולה לאיתור subpopulations ספציפיות של העברת NCCs שמקורם באזורים שונים לאורך ציר הזנב ^{rostro-21,67-69.} שיטה זו מנצלת את הקלות של גישה עוברי העופות (לעומת עוברי יונקים) ו ניתן בשילוב עם טכניקות אחרות, כגון אבלציה רקמות, הזרקה של מולקולות מעכבות או מניפולציה גנטית דרך electroporation של פלסמידים הביטוי, כדי לבדוק באופן ניסויי התגובה של אוכלוסיות מסוימות נודדות NCC לאותות התפתחותיים שונים בתוך עוברים ^47,69.

שליו, חומוס מפלצות הן כלי רב עוצמה לבדיקת הגירה NCC והתמיינות, ואת הטכניקה הזאת יכולה להיות מותאם כוללים השתלה של רקמות אחרות מלבד הצינור העצבי. השתלת רקמת שליו לעובר האפרוח הוא ומבוססת techniquדואר ^13,21,70-76, אבל נלמד הטובה ביותר על ידי הפגנה ויזואלית, כמו microdissection של אזורים קטנים של צינורות עצביים דורשת מוטוריקה עדינה מאוד.

מכיוון שליו שמקורם בתאי ניתן להבחין בקלות באמצעות immunostaining עם QCPN שליו ספציפית נוגדנים מתאי חומוס המארחות, את הפוטנציאל ההתפתחותי של NCCs הנובעות אזורים ספציפיים של הצינור העצבי ניתן להסיק בידול של התורם (שליו) תאים על הניסוי נקודת הסיום, למשל, נוכחות של תאים החיוביים QCPN באזור הקרנית periocular, ואחרי השתלת בצינור העצבי לאזור שליו המוח התיכון של עוברים חומוס ב HH9 עולה כי הרכס העצבי נודדים מאזור זה להצמיח האנדותל הקרנית stroma ^77. שתלי בצינור העצבי בכל HH9-10 עולה התרומה NCC כדי גנגליון trigeminal וקשתות branchial. כמו כן, שליו הנגזרות עצב סנסורי ניתן לעקוב באמצעות אחר, שליו נוירון מסוים (qn) נוגדנים ^78,79.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chick eggs	Various
Quail eggs	Various
Egg incubator (Digital Readout 1502 Sportsman Incubator w/Humidity 110-120 Volt AC)	Poultry Supply	1502
Dumont AA forceps, Inox Epoxy-coated	Fine Science Tools	11210-10
Scotch tape	Any Supplier
Curved Iris forceps	Fine Science Tools	11065-07
India ink	Any Supplier
Pen/Strep (Penicillin, Streptomycin) Solution	VWR international	101447-068
Clear Packing tape	Any Supplier
Needle pulling apparatus	Narishige International	PE-21
Pulled glass needle, made from 1.5-1.8 x 100mm borosilicate glass capillary tube	Kimble Chase	34500 99
Pulled glass pipette, made from 5¾" Pasteur pipette	Fisher Scientific	13-678-6A
Mouth pipette apparatus (aspirator tube assembly for calibrated microcapillary pipette)	Sigma-Aldrich	A5177-52A
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11251-30
Tungsten wire, 0.1mm diameter	VWR international	AA10404-H2
Needle holders (Nickel-plated pin holder)	Fine Science Tools	26018-17
QCPN antiserum	Developmental Studies Hybridoma Bank	QCPN
Alexa Fluor secondary antibody (e.g., Alexa Fluor 594 goat anti-mouse IgG1)	Invitrogen	A21125
Ringer’s Solution (2L): 14.4g NaCl 0.34g CaCl2 0.74g KCl 0.230g Na2HPO4 0.04g KH2PO4 ddH2O to 2L Filter and autoclave	Fisher Scientific	7647-14-5 10043-52-4 7447-40-7 7558-79-4 7778-77-0