Summary
שיטה זו מתארת את השימוש במערכת הדמיה צבע אינפרא אדום מבוסס על זיהוי של H1N1 בנוזל bronchioalveolar (BAL) שטיפה של עכברים נגועים על רגישות גבוהה. מתודולוגיה זו ניתן לבצע 96 - או 384 גם צלחת, דורש <10 נפח μl של חומר הבדיקה יש פוטנציאל הקרנה בו זמנית של פתוגנים רבים.
Abstract
נגיף השפעת הוא פתוגן הנשימה הגורמת רמה גבוהה של כל שנה תחלואה ותמותה בחלקים רבים של העולם. לכן, לאבחון המדויק של זן הדבקה ההקרנה המהירה תפוקה גבוהה של מספר רב של דוגמאות קליניות הוא בעל חשיבות עליונה כדי לשלוט על התפשטות זיהומים מגיפה. אבחנות קליניות נוכחיות של דלקות שפעת מבוססים על בדיקה סרולוגית, תגובת שרשרת פולימרז, immunofluorescence הדגימה ישירה ותרבות 1,2 התא.
כאן אנו מדווחים על פיתוח של טכניקה אבחון חדשנית המשמשים לאיתור נגיפי שפעת חיים. השתמשנו העכבר מותאם האדם A/PR/8/34 (PR8, H1N1) וירוס 3 כדי לבחון את היעילות של טכניקה זו באמצעות תאים MDCK 4. תאים MDCK (10 4 או 5 X 10 3 לכל טוב) היה מתורבת 96 - או 384 צלחות טוב, נגועים PR8 וחלבונים נגיפיים התגלו באמצעות אנטי M2 ואחריו IR צבען מצומדות שניותondary נוגדנים. M2 5 ו hemagglutinin 1 הם שני חלבונים סמן העיקריים המשמשים רבים מבחני אבחון שונים. המעסיקים IR-צבען מצומדות נוגדנים משניים ממוזער autofluorescence קשור צבעי ניאון אחרים. השימוש נוגדן אנטי-M2 אפשרה לנו להשתמש בעוצמה אנטיגן ספציפי הקרינה כמו מדד ישירה של כמות ויראלי. למנות את עוצמת הקרינה, השתמשנו LI-COR אודיסיאה מבוסס סורק אינפרא אדום. מערכת זו עושה שימוש בשני לייזר מבוססי ערוץ לתגליות אינפרא אדום כדי לזהות fluorophores ולהבחין בינם לבין רעשי רקע. ערוץ 1 מרגש ב 680 ננומטר ופולט ב -700 ננומטר לסייע לכמת את הרקע. ערוץ 2 מגלה fluorophores שמרגשים ב 780 ננומטר פולטים ב 800 ננומטר. סריקה של PR8 נגועים בתאי MDCK בתוך סורק אינפרא אדום עולה הקרינה ויראלי כייל תלויים בהיר. מתאם חיובי של עוצמת הקרינה על כייל הנגיף החל מ -10 10 2 5 PFU יכול להיות קוןצפו sistently. חיוב מינימלי אך לגילוי לראות באופן עקבי עם 10 -10 2 3 PFU PR8 titers ויראלי הוכיח רגישות גבוהה של קרוב אינפרא אדום צבעים. יחס אות לרעש נקבע על ידי השוואת מעושה נגועים או isotype נוגדנים שטופלו בתאים MDCK.
שימוש בעוצמות הקרינה מ 96 - או תבניות צלחת 384 טוב, בנינו עקומות טיטרציה סטנדרטיים. בחישובים אלה, המשתנה הראשון הוא כייל הנגיף תוך המשתנה השני הוא עוצמת הקרינה. לכן, השתמשנו את ההתפלגות המעריכית כדי ליצור עקומת-לנכון לקבוע את הקשר בין פולינום titers ויראלי ועוצמות הקרינה. ביחד, אנו מגיעים למסקנה כי IR צבע המבוסס על מערכת זיהוי חלבון יכול לעזור לאבחן הדבקה של זנים נגיפיים דווקא למנות titer מגורמי המחלה מדביק.
Protocol
1. התרבות תאים MDCK
- 5 מיליון התרבות תאים MDCK לינה בקבוק T-75 ס"מ 2 ב 20 מ"ל של מדיום RPMI1640 להשלים עם 10% FBS, 100 U / ml פניצילין, 100 מיקרוגרם / מ"ל סטרפטומיצין, 1 נתרן פירובט מ"מ, 5% של סודיום ביקרבונט 7.5% פתרון 0.001% β-mercaptoethanol ב 37 ° C חממה רווי 5.2% CO 2.
2. PR8 זיהום אוסף נוזל BAL
- האתגר C57BL / 6 עכברים intranasally עם PFU 5000 של וירוס PR8 ב PBS סטרילית בנפח כולל של 30 μl דרך נחיר אחד. ביצוע זיהומים מדומים באמצעות PBS סטרילי רק בלי הווירוס.
- להרדים עכברים 0, 2, 4 ו - 7 ימים לאחר ההדבקה וחותכים את חלל בית החזה לפתוח ולעשות חתך 1 ס"מ במקביל קנה הנשימה דרך הפרווה של העכבר כדי לחשוף אותו.
- לעשות חתך לאורך קו האמצע של הפן הפרוקסימלי של קנה הנשימה.
- להחדיר את קנה הנשימה עם 0.5 מ"ל של BSA PBS-1% ו לשאוב תואר ראשוןל נוזל. נוזלים של באל ניתן לאחסן במקפיא -20 ° C עד בשימוש.
3. וירוס דלקת זיהוי של חלבון מטריקס ויראלי (M2) עם אודיסיאה LI-COR
- כדי לכמת את titers ויראלי באמצעות אינפרא אדום צבען מצומדות נוגדנים, למסוק את התאים MDCK של T-75 ו 2 צלוחיות ס"מ צלחת אותם אופטי התחתון שחור שטוח 96-היטב (10,000 תאים בכל טוב) או 384-5000 (גם תאים בכל טוב ) צלחות. התרבות התאים MDCK את הלילה על 37 מעלות צלזיוס במדיום RPMI1640 מלאה ולשטוף פעמיים עם סרום ללא DMEM המכיל BSA (0.2%, משקל / נפח), פניצילין (100 U / ml), סטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל), נתרן פירובט (1 מ"מ), סודיום ביקרבונט פתרון (5% של 7.5%) ו - β-mercaptoethanol (0.001%).
- דגירה התאים MDCK עם נוזל BAL (50 μl על הצלחת 96-היטב או 10 μl על צלחת 384 טוב) או PR8 וירוס עם titers ידועים היטב לכל בעלי נפח זהה (50 μl על הצלחת 96-היטב או 10 μl של 384 - גם צלחת) של המדיום DMEM,המכיל L-1-tosylamido-2-phenylethyl קטון chloromethyl (TPCK), טיפול טריפסין (0.2 מיקרוגרם / מ"ל).
- בעקבות H 1 של זיהום, הוסף 100 μl (96, גם צלחת) או 20 μl (384 גם צלחת) של 10% FBS המכילים RPMI1640 בינוני מלא כל טוב.
- המשך תאים culturing MDCK עבור H 16 אחר של זיהום, לשטוף את התאים MDCK פעמיים עם μl 100 (96, גם צלחת) או 20 μl (384 גם צלחת) של פתרון-PBS 1 BSA% ולתקן עם μl 100 (96, גם צלחת) או 20 μl (384 גם צלחת) של paraformaldehyde 1% עבור 5 דקות.
- בעקבות תיקון, דגירה התאים MDCK נוספת למשך 30 דקות עם 100 μl (96 גם צלחת) או 20 μl (384 גם צלחת) של BSA PBS-1% לחסימת.
- לאחר חסימת דגירה התאים MDCK עבור H 1 עם נוגדן ראשוני נגד החלבון M2 (1:1000, מדולל PBS-1 BSA%). השתמש 50 μl לכל μl היטב 20 של נוגדנים המדולל היטב היטב או 96-384-גם צלחות, בהתאמה.
- לשטוף את התאים MDCK שלוש פעמים עם 100 μl (96 גם צלחת) או 20 μl (384 גם צלחת) של PBS, המכיל 1% BSA ו דגירה של 1 ש 'עם 50 μl (96, גם צלחת) או 20 μl (384 גם צלחת) נגד העכבר עז IRDye @ 800 נוגדנים משני ( דילול 1:200).
- לשטוף את התאים MDCK שלוש פעמים עם 100 μl של BSA-PBS המכיל 1%. מניחים את הצלחות מוכתמים על פלטפורמת קריאה כוס סורק LI-COR אודיסיאה IR ולהגדיר את הקורא על 96 - או קריאה צלחת 384 גם כן.
- ריקים בארות בקרה שליליים ניתן להגדיר באמצעות התוכנה LI-COR אודיסיאה. לכמת את הצלחת כולה או בארות נבחרים בתוך צלחת באמצעות LI-COR תוכנה אודיסיאה.
- שימוש בכלי צורה אוטומטית, לצייר את גבולות אזור היעד (ROI) באמצע המבחן גם של 96 - או 384 גם הצלחות. יצירת החזר השקעה התוכנה מאפשרת להשוות בין בארות רקע שהוגדרו על דגימות וירוסים טיטרציה.
- כדי לקבוע את ערך הבסיס assay כולו, השתמש ROI רקע. להציג את שני הכוונת מנוגדים המסופקים על ידי מערכת אודיסיאה בתוך ROI כדי measuמחדש את עוצמת הקרינה על פני הבאר.
- סרוק צלחות באמצעות ערוץ 780 ננומטר עבור איתור 680 ננומטר כמו אורך הגל התייחסות סורק LI-COR אודיסיאה IR.
- ברגע הפקודה "קרא" מופעל, עוצמות את ניאון במרווחים אחידים של ההחזר על ההשקעה יהיה נמדד הנתונים שנאספו לנקודות משולבת. מכפיל סטיית התקן יקבע את רמת האות על בסיס הכלול קביעת ההחזר על ההשקעה.
- הקרינה רקע יהיה לכמת מ נוגדנים מעושה נגוע או משנית בלבד שולט וישמש להעריך את העוצמה המשולבת של בארות.
- בחרו 'עוצמת משולב "לביצוע חישובים, כי הוא מייצג פיקסל נפח נטו על מקום הפרט מוגדר אינו תלוי בגודל תכונה. השתמש עקומת תקן מן titers ויראליים ידועים כדי לחשב את titers ויראלי של דגימות לא ידועות. השתמש עקומת אינטרפולציה רב בדיוק לחשב את titers ויראלי. חשב את Vtiters iral בדגימות הבדיקה על ידי השוואת עוצמות של דגימות הבדיקה עם עקומת סטנדרטיים.
4. נציג תוצאות
סטנדרטיזציה של IR צבע המבוסס על מערכת זיהוי נגיפי גבוה התפוקה
PR8 הנגיף יכול להדביק תאים MDCK, ולכן השתמשנו תאים אלה כדי לפתח את assay. מדדנו את titers ויראלי באמצעות נוגדן ראשוני נגד חלבון נגיפי שפעת מטריקס (M2). לעומת שיטות אחרות, השתמשנו נוגדנים משני הוא מצומדות כדי לצבוע כמעט IR. שיטה זו מספקת פשוט, אוטומטי PR8 כייל הנגיף באמצעות קביעת עוצמת הקרינה שנוצר תוך גילוי חלבון M2. לאחר ההדבקה בנגיף שפעת, חלבון M2 מתורגם, מועבר ומצטברים התא המארח, כולל פני התא. לפיכך, כמות החלבון M2 מהווה פרמטר מדידה כדי לקבוע את כמות הנגיף. השוואת עוצמות מדגימות הבדיקה עם עקומת סטנדרט מספק מדידה מדויקת של titers ויראלי.
כדי לקבוע את יעילות השיטה הקרינה מבוסס, אנו תרבותי 10 4 תאים MDCK / גם בתא מחליק בין לילה. PR8 מניות ויראלי של titers ידועים נוספו לשכפל בארות עם יחידות שונות פלאק (יוצרי PFU) ו מותר לספוג על התאים למשך שעה אחת. התאים היו מודגרות עבור H 16 כדי לאפשר להפיץ וירוס. לאחר מכן, התאים MDCK ב השקופיות קאמרית נקבעו עם paraformaldehyde 1%, רחוץ מוכתם נוגדן אנטי-M2 של 1 ש ', ואחריו AlexaFluor 488-מצומדות נוגדנים משני H 1 נוסף. ניתוחים מיקרוסקופיים confocal של תאים נגועים MDCK הפגינו monolayer חסיד היה שלם ברובו ואת החלבון PR8 הנגזרות M2 נכח בשפע בתוך התאים הנגועים MDCK (איור 1 א). תאים fluorescing ניתן היה לזהות זיהומים נגיפיים עם titers נמוך כמו 10 2
לכן, כדי ליצור שיטה מדויקת להערכת ויראלי אנחנו עובדים גילוי IR צבע המבוסס על מערכת כימות. תאים MDCK (10 4 / טוב) היה מתורבת 96 צלחות טוב, נגועים PR8 וחלבונים נגיפיים התגלו באמצעות אנטי M2 ואחריו נוגדן צבען מצומדות IR משני. השימוש נוגדן אנטי-M2 אפשרה לנו להשתמש בעוצמה אנטיגן ספציפי הקרינה כמו מדד ישירה של כמות ויראלי. למנות את עוצמת הקרינה, השתמשנו LI-COR אודיסיאה מבוסס סורק אינפרא אדום. מערכת זו משתמשת בשני ערוצים לייזר basאד לתגליות אינפרא אדום כדי לזהות fluorophores ולהבחין בינם לבין רעשי רקע. ערוץ 1 מרגש ב 680 ננומטר ופולט ב -700 ננומטר לסייע לכמת את הרקע. ערוץ 2 מגלה fluorophores שמרגשים ב 780 ננומטר פולטים ב 800 ננומטר. סריקה של PR8 נגועים בתאי MDCK ב אודיסיאה LI-COR ציין הקרינה ויראלי כייל תלויים בהיר (איור 1 ב). תאים מסוג M2 חיוביות MDCK ניאון נראו בבירור בתוך בארות (1B איור). המתאם החיובי של עוצמת הקרינה על כייל הנגיף החל מ -10 10 2 5 PFU יכול להיבחן באופן עקבי. PR8 titrations ויראלי גבוה יותר מאשר עופרת 10 PFU 6 עד מוות של תאים, אשר קובע גבול עליון הרגישות של assay. חיוב מינימלי אך לגילוי לראות באופן עקבי עם 10 -10 2 3 PFU PR8 titers ויראלי הוכיח רגישות גבוהה של קרוב אינפרא אדום צבעים. יחס אות לרעש נקבע על ידי השוואת MOCK-נגוע או isotype נוגדנים שטופלו בתאים MDCK. שני פקדים אלה הביאו לרמות זניחות או לגילוי של הקרינה (1B איור).
כדי לשפר עוד יותר את הרגישות כדי להפחית את נפח מדגם הבדיקה דרישות, אנחנו נגועים 5 × 10 3 תאים MDCK / גם ב 384 גם הצלחות. PFUs שונים של PR8 נבדקו כמו אחד דילולים סדרתי יומן (איור 1 ג). רגישות זיהוי מצלחות 384 גם היה דומה לזה של 96-גם מבחני צלחת. שניהם 10 1 ו 10 2 PFU עבד באופן עקבי טוב יותר את הצלחות, גם 384 לעומת 96, גם הצלחות. שימוש בעוצמות הקרינה מ 96 - או תבניות צלחת 384 טוב, בנינו עקומות טיטרציה סטנדרטיים (1D איור). בחישובים אלה, המשתנה הראשון הוא כייל הנגיף תוך המשתנה השני הוא עוצמת הקרינה. לכן, השתמשנו את ההתפלגות המעריכית כדי ליצור עקומת-לנכון determine את הקשר בין פולינום titers ויראלי ועוצמות הקרינה. יש לנו אימות גם התצפיות שלנו באמצעות נוגדן אחר, כי הוא נגד nucleoprotein (NP) של נגיף PR8 (מידע לא מוצג). מקורות שונים של PR8 זנים שימשו גם להדביק תאים MDCK שנבדקו עם אנטי-NP או אנטי-M2 נוגדנים (מידע לא מוצג). ביחד, אנו מגיעים למסקנה כי IR צבע המבוסס על מערכת זיהוי חלבון יכול לעזור לאבחן הדבקה של זנים נגיפיים דווקא למנות titer מגורמי המחלה מדביק.
שיקולים מתמטיים לחישוב titers ויראלי
החישובים המתמטיים של עוצמת הקרינה לבין קביעות titer נעשים כמתואר להלן. בהמשך להליך מכתים, צלחת או כל בארות נבחרים בתוך צלחת הם לכמת באמצעות LI-COR תוכנה אודיסיאה. שימוש בכלי צורה אוטומטית, גבולות אזור היעד (ROI) צויר באמצע את בארות של 96 - או 384 אנחנוצלחות ל"ל (איור 2 א 'וב'). יצירת החזר השקעה התוכנה מאפשרת להשוות בין בארות רקע שהוגדרו על דגימות וירוסים טיטרציה. ההחזר על ההשקעה ברקע שימש כדי לקבוע את הערך הבסיסי של assay כולו. שני הכוונת מנוגדים (לבן) הוכנסו בתוך ההחזר על ההשקעה על מנת למדוד את עוצמת הקרינה על פני הבאר (איור 2 ג). Curves לצד ימין ומתחת בארות נציג איור 2 ג לייצג את העוצמה של הפיקסלים הללו לאורך הכוונת. עוצמות את ניאון במרווחים אחידים של ההחזר על ההשקעה נמדדו ואת נקודות נתונים שנאספו שולבו. מכפיל סטיית התקן נקבע ברמה של אות מעל לקו הבסיס, כי נכלל בקביעת ההחזר על ההשקעה. רקע הקרינה היה לכמת מ נוגדנים לבד שולטת מעושה נגוע או משנית ומשמשת להעריך את העוצמה המשולבת של בארות. בחרנו עוצמת משולב חישובים כי זה represנפח המציג פיקסל נטו על מקום הפרט מוגדר אינו תלוי בגודל תכונה. בנוסף, עוצמת משולבת אינה תלויה באופן משמעותי של רזולוציה. עוצמת פיקסל הכל / (I) מתאים עוצמת האות הנובעים נבחר גם באזור פיקסל (האם) בתוספת האות הנובעים מרקע של האזור פיקסל (ב). לכן, עבור פיקסל "אני":
אני אני אני = s i + b i
נפח פיקסל מייצג גם את גודל האות ואת האזור שבו הוא מופץ. אזור אות קשורה בחלוקת מדגם זה הוא יצירת האות. נפח פיקסל שווה האות הכולל נמדד פיקסל 'i' במקום (א) של פיקסל פי גובהו (אני). אז פיקסל "אני":
vi = אני אני
נפח פיקסל הכולל הוא הסיכום של האות הכולל מהאזור כולו כך:
| ; | n | n | |
| V = | אני Σv | = | אני aΣI |
| i = 1 | i = 1 |
עוצמת משולב הוא סכום הערכים של כל הפיקסלים בעוצמה מוקפים תכונה, כפול שטח המעגל / מלבן (מ"מ מספר 2). לכן, עוצמת משולב =
(ΣI אני - ב)
כאן, ב מייצג את עוצמת הרקע הממוצע פיקסל. נוסחה זו מחשבת את עוצמת אות משולב של שליטה או בארות ניסיוניות ובכך קובע עקומת סטנדרטי. Titers נגיפיים בדגימות הבדיקה חושבו באמצעות עקומת סטנדרטי. ריכוז (של העוצמה) מוגדרת כמות הקרינה הנוכחי של ההחזר על ההשקעה מוגדר. הריכוזים בדגימות הבדיקה החישוביםטד ביחס ריכוזים מוגדרים של הסטנדרטים באותה תמונה. כדי לחשב את titers ויראלי מדויקים, בעוצמה של תקן זה הוא ריכוז זממו מצויד עקומת אינטרפולציה רב. הריכוזים של דגימות הבדיקה מחושבים על ידי השוואת עוצמת אזור בתוך העקומה סטנדרטי.
קביעת titers ויראלי מנוזל BAL של עכברים נגועים שפעת
גילוי של חלקיקי נגיף שפעת חי בדגימות קליניות במעבדה הוא בעל חשיבות קריטית. לכן, אנחנו הבא לבחון האם אנו יכולים לנצל בשיטה זו כדי לקבוע את titers נגיפיים בדגימות מעבדה. נוזלים של באל נאספו עכברים שאינם שחוסנו ומשובץ כמות ידועה של וירוס PR8. נוזלים של באל ממוסמר היו טיטרציה באופן ליניארי על ספירת titers ויראלי. Aliquots של נוזלים של באל מחודדות שימשו להדביק תאים MDCK ב 96 צלחות טוב, קבוע מוכתם secondar צבען מצומדות נגד M2 ו IRנוגדנים-y. התוצאות המוצגות באיור 3 א להוכיח את titers ויראלי בנוזל BAL המחודד היו לגילוי ו בקורלציה עם PR8 titers בעקומת סטנדרטי. באמצעות עקומת סטנדרטי, מספרים מדויקים ויראלי בנוזל BAL קוצני טיטרציה היה לכמת. מעריכי בכושר חישובים עקומת סיפק מידה כדי לחשב את titers ויראלי בנוזל BAL המחודד (איור 3 ב). באמצעות שיטה זו השגנו קשרים מצוינים בין titers ויראלי מחושב זינק, אימות גישה זו (איור 3 ג).
לאחר מכן, ניתחנו את נוזל BAL מ PR8 נגועים עכברים. PR8 נעשה בה שימוש נרחב במודלים Murine להבין חסינות האדם 3 פתולוגיה אנטי ויראלית. קבוצות של עכברים נדבקו intranasally עם PFU 5000 של PR8. העכברים היו במעקב לירידה במשקל, המראה של גיבנת, פרווה מסולסלת ותסמינים קליניים אחרים. בימים 0, 2, 4, 7 ו 10 של זיהום הודעה,העכברים הוקרבו ונוזלים של באל נאספו. כדי לנצל את דגימות מעבדה, תאים MDCK היו מודגרות עם דילולים סדרתי של נוזל BAL בנפח סופי של μl 50 עבור H 17 ב 96-גם הצלחות. בארות בקרה של תאים נגועים MDCK titers ידועים של הנגיף PR8 המניות שימש להפקת עקומת סטנדרט. לאחר ההדבקה, תאים נשטפו, קבוע מוכתם נוגדן אנטי-M2 העיקרי ואחריו נוגדנים צבען מצומדות כמעט IR משני. תאים MDCK שהיו מעושה נגוע או מטופל עם פקדים isotype לאחר ההדבקה סיפק את עוצמות הקרינה רקע לחישובים titer.
ניתוח של נוזל BAL הראו כי PR8 וירוס הדגימה במעבדה ניתן לזהות באמצעות מערכת IR צבע מבוסס assay. עלייה משמעותית של העומס הנגיפי בנוזל BAL נצפתה בימים 2 ו 4 זיהום פוסט (תרשים 4 א). החישובים של עוצמת משולב ציינו כי הנוזלים של באל מימי 2 ו -4 לפרסם אניnfection הכילו רמות משמעותיות של הנגיף PR8 (איור 4B). התוצאות שלנו מראות ירידה במשקל הדרגתית אך משמעותית בשלב מוקדם של זיהום PR8, הוכחת את חומרת המחלה. אף על פי כן, רוב העכברים החלו להתאושש תסמיני המחלה ואת במשקל 7 ימים זיהום הודעה (איור 4C). עכברים על זיהום 10 יום שלאחר חסר כל PR8 לגילוי המציין את שחרור של הנגיף, אשר מתואמים גם עם העלייה במשקל הגוף, הפחתת ניכרים את תסמיני המחלה.
כדי להרחיב עוד יותר את היישום של assay זה, בדקנו 2009 שפעת (H1N1) אדם לבודד עם מערכת אינפרא אדום צבע מבוסס זיהוי נוגדנים, והשוו אותו עם assay PCR בזמן אמת. מדגם זה היה קליני מבודד משטח האף והלוע / הגרון המשולב המתקבל החולה החשוד. לבודד היה מופצות בתור תא MDCK על הבריאות מילווקי המחלקה מעבדה. תוצאות הבדיקה היו compaאדום כדי לבדוק את הרגישות של השיטה צבע מבוסס IR בזמן אמת מבחני PCR (תרשים 5). תוצאות המחקר מראות כי זיהוי צבע IR מערכת מבוססת נוגדנים יש פוטנציאל לזהות עומס נגיפי נמוך כמו 10 3 TCID 50 / מ"ל, אשר ניתן להשוות assay PCR מבוסס (10 TCID 50 / מ"ל) ונפילה בתוך רלוונטיות קלינית מגוון של דוגמאות המטופל ביותר. תוצאות אלו מספקים ראיות חזקות שמערכת IR צבע מבוסס assay יש רגישות מספקת פוטנציאל להיות מיושם על ספירה כייל הנגיף במעבדה למחקר במסגרות קליניות.
באיור 1. IR צבע המבוסס על זיהוי החיסונית של נגיף השפעת. (א ') ניתוח מיקרוסקופיים confocal של שפעת נגועים בתאי MDCK ב 8-גם שקופיות קאמריים. ניתוחים מיקרוסקופיים immunofluorescence להפגין monolayer MDCK חסיד הוא תמים במידה רבה, עמוסה וירוס הנגזרות M2 חלבונים. (לפני הספירה) כימות titers נגיפיים המבוססים על צבע IR ו LI-COR מערכת אודיסיאה. (ד) דור של עקומות סטנדרטיות מעריכי עיקול בכושר פרופילים. הנתונים המובאים לספירה מייצגים חמישה ניסויים בלתי תלויים.
איור 2. המתודולוגיה של קביעת titers ויראלי באמצעות צבעים IR. (A) מדידות משולב עוצמת הקרינה. אזור מוגדר בתוך בארות (ROI) סומן למדוד את עוצמות הקרינה. באמצעות צורת כלי אוטומטי, גבולות ההחזר על ההשקעה נמשכו באמצע את בארות של 96 - או 384 צלחות היטב. הקרינה נמדדה כמו פיקסלים בודדים (פיקסל = n) בתוך ההחזר על ההשקעה. עוצמת משולב הוא סכום הערכים של כל הפיקסלים בעוצמה מוקפים תכונה, כפול שטח המעגל / מלבן (מ"מ מספר 2). (ב) קביעת עוצמות הקרינה משולבים בבארות assay. יצירת החזר השקעהמותר סורק LI-COR להשוות את בארות רקע שהוגדרו על דגימות וירוסים טיטרציה. רקע הקרינה היה לכמת מ נוגדנים לבד שולטת מעושה נגוע או משנית ומשמשת להעריך את העוצמה המשולבת של בארות. (ג) אוסף של נקודות נתונים בתוך ההחזר על ההשקעה. שני הכוונת מנוגדים (לבן) הוכנסו בתוך ההחזר על ההשקעה על מנת למדוד את עוצמת הקרינה על פני הבאר. Curves לצד ימין ומתחת בארות נציג לייצג את העוצמה של הפיקסלים הללו לאורך הכוונת.
איור 3. איתור וכימות של titers מווירוסים ב PR8 נוזלים של באל חדים. (א) תאים MDCK היה מתורבת 96-גם צלחות לילה נוסף עם נוזל PR8-BAL המחודד. צלחות נקראו במערכת LI-COR אודיסיאה. (ב) Exogenously נוזל BAL ממוסמר הושווה עם עקומות סטנדרטיות. (ג) השוואה בין vir כדי לחשב צפוי באל titers. ראוי עקומה מעריכית בתנאי y = 9.4784e 0.0014x. הנתונים המובאים AC מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים.
באיור 4. איתור וכימות של נגיף השפעת בנוזלי של באל PR8 של עכברים נגועים. (א ') קבוצות של עכברים נדבקו intranasally עם PFU 5000 של PR8. תאים MDCK היו מודגרות עם דילולים סדרתי של נוזל BAL בנפח סופי של μl 50 עבור H 17 ב 96-גם הצלחות. לאחר ההדבקה, תאים נשטפו, קבוע מוכתם נוגדן אנטי-M2 העיקרי ואחריו נוגדנים צבען מצומדות IR משני. הפאנל הימני ביותר מייצג את עקומת סטנדרטי. (ב) כימות titers ויראלי בנוזל BAL של עכברים נגועים. (ג) אובדן משקל של עכברים במהלך זיהום PR8 בקורלציה עם עומס נגיפי. הנתונים המובאים AC מייצגים שלושה ניסויים בלתי תלויים.
מחדש 5 "src =" / files/ftp_upload/3623/3623fig5.jpg "/>
איור 5. איתור וכימות של 2009 (H1N1) שפעת (PDM) שפעת לבודד מחולה אנוש. () IR צבע פלואורסצנטי מערכת מבוססת נוגדנים גילוי טיטרציה חצי קיפול השורה התא הנגוע MDCK. תוצאות הקרינה עולה assay יש פוטנציאל לזהות עומס נגיפי נמוך כמו 10 מ"ל TCID 3/50. (ב) חומצות גרעין שחולצו מן התרבות לבודד יחד עם פי עשרה דילולים סדרתי של כמה H1N1 titered הידועים לבודד נותחו עם assay בזמן אמת PCR-CDC 12. גבול גילוי בזמן אמת PCR היה 10 TCID 50 / מ"ל.
Discussion
ההתפרצות האחרונה של מגפת שפעת העופות בדרום מזרח אסיה הפחד העולמי של מגיפת שפעת החזירים להטיל חששות עצומים לבריאות ובטיחות הציבור. מוקד קריטי הוקדשו לייצר חיסונים עבור זנים קיימים יותר של נגיף השפעת. הזמינות של תפוקה גבוהה טכנולוגיות מהירות לגילוי מדויק מדויק חישובים titer ויראלי יהיה מאוד לשפר את הטיפול. הטכניקות הנפוצות ביותר המועסקים לחשב כייל הנגיף כוללים להרכיב שפעת פלאק מבחני hemagglutination. Assay פלאק ויוצרים פותח לראשונה להעריך titers bacteriophage ואומצה על ידי רנאטו Dulbecco לחשב titers נגיפי בעלי חיים 4. כדי לבצע assay, של פי 10 דילולים של המניה שפעת או דגימות מן החי כמו נוזל BAL ערוכים 0.1 aliquots מ"ל הם מחוסן על monolayer של תאים MDCK ב 6 גם הצלחות. וירוס מותר לספוג אל התאים MDCK ואחריו למודעהdition של המדיום מאוזנת של מזון agarose. במהלך הדגירה, התאים הנגועים המקוריים לשחרר את הצאצאים ויראלי שהתפשט רק על תאים שכנים. אפקט cytopathogenic של זיהום נגיפי שפעת מייצרת אזור מעגלי של תאים נגועים בשם פלאק. רובד זה הוא נוצר ככל הנראה לאחר ההדבקה של תא יחיד עם חלקיק וירוס אחד ואחריו שכפול הנגיף. הניגוד בין תאים חיים לבין פלאק ניתן לשלב צבעים כגון: סגול קריסטל. החיסרון העיקרי של assay זה חוסר שחזור ווריאציות ענק בתוך ניסויים. עוד assay לקביעת כייל שפעת נגיפית היא assay hemagglutination. כיום חלבון hemagglutinin על פני השטח של נגיף השפעת ביעילות נקשר N-acetylneuraminic חומצה המכילים חלבונים על יונקים העופות כדוריות דם אדומות 1. זו האינטראקציה בין נגיף השפעת לבין אריתרוציטים מוביל הצטמדות בצורה של סריג. אניאיול של הצטמדות משמש לאמוד את כייל של וירוס שפעת דגימות הבדיקה. Assay הצטמדות כדורית אדומה משמש רק כדי לקבוע את טיטרציה של וירוס ידוע ולא ניתן להשתמש בו למטרות זיהוי זן. מאז assay זה אין הבדל בין חיים לבין וירוסים מתים, קשה לקבל חישוב מדויק של titers ויראלי.
אבחנות קליניות נוכחיות של דלקות שפעת מבוססים על בדיקה סרולוגית, תגובת שרשרת פולימרז, immunofluorescence הדגימה ישיר תרבית תאים 1,6. השיטה החדשה המתוארת כאן יש גם פוטנציאל אבחון קליני במעבדה. גילוי שפעת ערכות Directigen שפעת (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה) ו BinaxNow (Binax, Inc, Scarborough, ME) immunochromatography assay להשתמש כדי לזהות אנטיגן ויראלי כגון nucleoprotein 7. באמצעות ערכות אלו, זיהוי של וירוס יכולה להיות מושגת בתוך 15 דקות, עם זאת, כל הדוגמאות השליליות צריך להיות של עודcreened בשיטת תרבית תאים. מחקרים שונים דיווחו גם רגישות נמוכה של ערכות אלה, במיוחד, כאשר הזיהום היתה קלה או נמוכה 8. בשיטה שלנו, אנחנו באופן עקבי לזהות נמוך כמו 100 PFU של הנגיף. הדבר מצביע על הטכניקה שלנו היא שימושית באיתור הנגיף H1N1 בדגימות קליניות, גם אם הזיהום הוא קל. שיטת הקרינה מבוסס לזהות אנטיגנים נגיפיים דווחה, שם בין אם דגימות aspirate האף והלוע נותחו באופן ישיר או היו מחוסן על monolayer של תאים רגישים לכפל וירוס ניתוחים שלאחר מכן 9. עם זאת, שיטות אלו מוגבלים למטרות אבחון אינם מתאימים חישובים כייל הנגיף. Q-PCR מסייעת לזהות את נוכחותו של RNA ויראלי ולא מעריכים infectivity של וירוסים חיים. לעומת אלה מבחני, IR צבע מערכת מבוססת assay יסייע באיתור ספירה כייל הנגיף בדגימות קליניות במעבדה. במקרה של התפרצות שפעת, זהקריטי לאבחן אלפי דגימות בפרק זמן קצר. השיטה שלנו מבוססת על מגש של כסף 384, גם וסורק IR יכול לסרוק 6 לוחיות בכל פעם (> 2,000 דגימות), ולכן מציע יתרון גדול על פני שיטות אחרות ניאון ישירות. הכדאיות של עיבוד מהיר של אלפי דגימות קליניות יכול להפחית השתנות הבדיקה, משך הזמן assay ועלויות. השימוש נוגדן ספציפי M2 מציעה את היתרון של להיות עצמאית של הבדלים המתח חלבונים H ו N. חלבון M2-נשמרת יחסית זני שפעת רוב מדביק בני אדם. אם נוגדנים ספציפיים כתמים במחזור משולבים עם המערכת שלנו ניתן למדוד הן את כייל הנגיף ולזהות את המתח. עם זאת, מאז M2 הוא יעד עבור Amantadine כמו סמים, יכול להיווצר מוטציות שעשויות לשנות את אתר הקישור של MAB משמש כאן. זה מהווה מגבלה פוטנציאל מערכת זו אצל אנשים מטופלים על ידי תרופות אלו.
מרובהמבחני משמשים למנות titers שפעת בדגימות הבדיקה. כדי לחשב titer וירוס, 50% תרביות רקמה מנה זיהומיות (TCID 50) וביצה allantoic נוזל על בסיס מבחני נמצאים בשימוש נרחב 1,10. עם זאת, דרישות של מספר ימים לבצע שיטות אלו פחות אמינים. יתר על כן, שיטות אלה חישובים המבוססים על שינוי של 50% במספר לוחות לספק titrations ויראלי תיאורטיים, אבל לא מדויק. רובד להרכיב מבחני יכול להתבצע בתוך 96 שעות, אולם חוסר שחזור היא הדאגה העיקרית בחישובים titer ויראלי. הטכניקה הנוכחי המתואר כאן יש מספר יתרונות בולטים. ראשית, היא טכניקה לשחזור ביותר עם תוצאות עקביות. שנית, החישובים titer ויראלי מבוססים על כימות פשוט של עוצמות הקרינה, כי הן בהשוואה מול עקומות סטנדרטיות מוגדרות. שלישית, שניים או יותר נוגדנים ראשוניים ניתן לאבחן קפסיד מספר במדגם נתון. כמו כן, IR צבען מצומדות נוגדנים יש מיניםאל autofluorescence ו שימשו במשך תא הדמיה 11. UV או חזותי (300-600 ננומטר) הקרינה גורמת autofluorescence הסלולר גבוהה בשל נוכחותם של גבוהים fluorophores הקוונטים אנדוגניים מניבים. אלה כוללים חומצות אמינו ארומטיות, השאיבה למוצרי פיגמנטים, נוקליאוטידים pyridinic (NADPH), אלסטין, קולגן ו coenzymes לפלבין. מאפיין מהותי של התאים מקשה לנצל את מקורות קרינה כמו בדיקות לכמת את הביטוי של חלבונים ספציפיים. לעומת זאת, כמעט אינפרא אדום צבעים לרגש פולטים בין 670-1000 ננומטר. מולקולות רבות המארחות הסלולר ופחמימנים polyaromatic לא מרגשת באורך גל זה, עקב פיזור אור מופחת, פולטים הקרינה רקע נמוך ביותר. יתר על כן, חלון בין הרקע זיהוי ספציפי הוא השתפר בהרבה בשל מקדם הכחדה גבוהה של קרוב אינפרא אדום fluorophores. Photostability, יחס מעולה האות לרעש, רלוונטי מאוד כימות של titers ויראלי. השימוש microflחדרי uidic יהיה להפוך את תהליך המיון באמצעות הבקרה רובוטיות, ויכול לאפשר לנו לבחון דגימות קליניות מדבק מאוד בקלות. לפיכך, ניצול כמעט אינפרא אדום צבעים בשיטות אלה הוא אידיאלי ואמין מאוד למנות titers נגיפיים בדגימות רקמה.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה בחלקה NIH מענקים R01 A1064826-01, U19 AI062627-01, No1-HHSN26600500032C (ל SM). אנו מודים לחברי המעבדה שלנו לעזרה דיון טכני, טינה הייל לבדיקה ביקורתית של כתב היד. אנו רוצים להודות דוד בינה, מילווקי מחלקת הבריאות המעבדה התרבות נגיף ו-PCR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bovine serum albumin | Atlanta Biologicals | S11750 | |
| PR8 virus | From Dr Thomas M Moran | ||
| Goat anti-mouse IRDye@800 | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 1:200 dilution |
| LI-COR Odyssey IR scanner | LI-COR Biosciences | 9201-01 | |
| 384-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 164730 | |
| 96-wells flat bottom plate | Nalge Nunc international | 165305 | |
| DMEM medium | Invitrogen | 11965126 | |
| RPMI medium | Invitrogen | 11875135 | |
| Sodium bicarbonate | Invitrogen | 25080 | |
| L-glutamine 100x | Invitrogen | 25030 | |
| Trypson-EDTA | Invitrogen | R001100 | |
| Sodium Pyruvate | Invitrogen | 11360070 | |
| Anti-M-2 antibody | From Dr Thomas M Moran | ||
| Anti-NP mAb | CDC | V2S2208 | Obtained with an MTA |
References
- Hirst, G. K. The agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus. Science. 94, 22-23 (1941).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Kalter, S. S. Hemagglutinating Behavior of Mouse and Egg-adapted Type A (PR8) Influenza Virus. Science. 110, 184-184 (1949).
- Dulbecco, R. Production of Plaques in Monolayer Tissue Cultures by Single Particles of an Animal Virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 38, 747-752 (1952).
- Deyde, V. M., Nguyen, T., Bright, R. A., Balish, A., Shu, B., Lindstrom, S., Klimov, A. I., Gubareva, L. V. Detection of molecular markers of antiviral resistance in influenza A (H5N1) viruses using a pyrosequencing method. Antimicrob. Agents Chemother. 53, 1039-1047 (2009).
- Jonsson, N., Gullberg, M., Lindberg, A. M. Real-time polymerase chain reaction as a rapid and efficient alternative to estimation of picornavirus titers by tissue culture infectious dose 50% or plaque forming units. Microbiol. Immunol. 53, 149-154 (2009).
- Rahman, M., Kieke, B. A., Vandermause, M. F., Mitchell, P. D., Greenlee, R. T., Belongia, E. A. Performance of Directigen flu A+B enzyme immunoassay and direct fluorescent assay for detection of influenza infection during the 2004-2005 season. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease. 58, 413-418 (2007).
- Landry, M. L., Ferguson, D. Suboptimal detection of influenza virus in adults by the Directigen Flu A+B enzyme immunoassay and correlation of results with the number of antigen-positive cells detected by cytospin immunofluorescence. J. Clin. Microbiol. 41, 3407-3409 (2003).
- Herrmann, B., Larsson, C., Zweygberg, B. W. Simultaneous detection and typing of influenza viruses A and B by a nested reverse transcription-PCR: comparison to virus isolation and antigen detection by immunofluorescence and optical immunoassay (FLU OIA). J. Clin. Microbiol. 39, 134-138 (2001).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Epidemiol. 27, 493-497 (1938).
- Doerr, A. Fluorescent proteins: into the infrared. Nat. Meth. 6, 482-483 (2009).
- Shu, B., Wu, K. H., Emery, S., Villanueva, J., Johnson, R., Guthrie, E., Berman, L., Warnes, C., Barnes, N., Klimov, A., Lindstrom, S. Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus. J. Clin. Microbiol. 49, 2614-2619 (2011).
