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Bioengineering

幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築

Published: June 1, 2012 doi: 10.3791/3624
* These authors contributed equally

Summary

現在の幹細胞治療の主要なハードルは、ホスト組織にこれらの細胞を提供するための最も効果的な方法を決定しています。ここでは、その多能性を維持するために、脂肪由来幹細胞を可能にしながら、アプローチの効率的かつ単純であるキトサンベースの配信方法について説明します。

Abstract

多能性幹細胞は再生医療1-3の分野で非常に有用であることが示されている。しかし、組織再生に効果的にこれらの細胞を使用するためには、変数の数を考慮する必要があります。これらの変数が含まれます:総体積と移植部位の表面積、組織の機械的性質および血管新生の量と細胞外マトリックスのコンポーネントが含まれています。組織の微小環境を、。宿主組織を模倣した機械的強度を維持しながら、したがって、これらの細胞を提供するために使用される材料は、定義された化学組成を持つ生体適合性でなければなりません。これらの材料はまた、酸素と栄養細胞が付着し、増殖するための有利な微小環境を提供するために透過性でなければなりません。キトサン、優れた生体適合性を有するカチオン性多糖類は、容易に化学的に修飾されたおよび in vivo Mac と結合する高親和性を持つことができますromolecules 4-5。キトサンは、細胞接着、遊走および増殖のための基質として機能できるように、細胞外マトリックスのグリコサミノグリカン部分を模倣しています。本研究では、三次元足場6ベースのコラーゲンに脂肪由来幹細胞(ASC)を提供するミクロスフェアの形でキトサンを利用しています。理想的な細胞へのミクロス比はインキュベーション時間とロードすることができましたセルの最大数を達成するために、細胞密度を基準にして決定した。 ASCは、キトサンマイクロスフェア(CSM)に播種されると、それらはコラーゲン足場に埋め込まれており、長期間の培養で維持することができます。要約すると、この研究では、正確に三次元生体材料足場内で幹細胞を提供するメソッドを提供します。

Protocol

1。の単離脂肪由来幹細胞(ASC)

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. ラット腎周囲および副睾丸脂肪を分離し、前述の6、1%ウシ胎児血清(FBS)を含有する滅菌ハンクス緩衝塩溶液(HBSS)で洗浄する。
  2. 組織をミンチし、室温で8分間500グラムで50 mLのチューブと遠心分離機に1%FBSを含むHBSS 25 mLに1〜2グラムを転送します。
  3. 浮遊脂肪組織の層と125 mLの三角フラスコへの転送を収集し、37℃で45分間HBSSでコラゲナーゼII型(200 U / mL)を25 mLで扱う°オービタルシェーカー(125 rpm)でのC。
  4. 慎重に液体画分(油と脂肪層の下)を削除し、100μmと70μmのナイロンメッシュフィルターを順次フィルタリングします。室温で10分間500gで濾液を遠心し、supernatanを吸引tと25 mLのHBSSでペレットを2回洗浄する。
  5. MesenPRO RS成長サプリメントを添加した増殖培地50 mLの細胞ペレット(MesenPRO RS基礎培地)、抗生物質抗真菌剤(ペニシリンG、100μg/ mLの硫酸ストレプトマイシン、および0.25μg/ mLのアムホテリシンBの100 U / mL)を懸濁し、2 mM L-グルタミンとピペットセル2 T75フラスコ(25 / mLのフラスコ)に変換します。
  6. 文化37°C(ASCは、すべての実験に使用されているパッセージ2-4)で5%CO 2の加湿インキュベーター中でASC。

2。キトサンマイクロスフェア(CSM)を準備

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. CSMは、当社の以前のプロトコル6を使用してイオンコアセルベーション技術とともに油中水型乳化プロセスによって調製される。大豆から成る油相混合液100 mLにキトサンの水溶液(0.5 M酢酸の3%(w / v)のキトサンの6 mL)を乳化油、n-オクタノール(1:2 v / v)で、5%ソルビタンモノオレエート(スパン80)、乳化剤、反対方向に、オーバーヘッド(1700 rpm)と同時に磁気攪拌(1000回転)を使用します。初期の架橋が発生する前に上に形成されたミセル溶液中に残っていると底に沈殿することはできませんミ​​キシングを保証し、この二重の方法。さらに、デ集約ミセル形成とrigidization中にキトサンをで磁気攪拌棒を支援します。
  2. 混合物を連続的に安定した油中水型エマルションが得られるまで約1時間撹拌する。イオン架橋は4時間(24 mLの合計)のn-オクタノール15分毎に1%(w / v)の水酸化カリウムを1.5 mLの添加で開始されます。
  3. 架橋反応の完了後、徐々に混合物を含むCSMの油相をデカントし、直ちにアセトン100mLに球を追加します。油相が完全に除去されるまで、アセトンで球を洗浄します。
  4. 真空デシケーターと肛門に回復した球体を乾燥させさらなる処理なしyze。平均CSMの粒径、ミリグラム当たりの表面積と単位体積は、粒子サイズアナライザーを用いて決定した。
  5. その後の実験では、残留塩を除去し、無水アルコールで滅菌する滅菌水でCSM 3回洗浄します。

3。 CSMの遊離アミノ基の数を決定する

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. BubinsとOfner 7トリニトロベンゼン(TNBS)酸アッセイを用いてイオン架橋後のCSMに存在する遊離アミノ基の数を決定します。 40°Cで4時間、50 mLのガラス管に0.5%TNBS溶液1mLをマイクロスフェアの5mgをインキュベートすると2h、60℃で6N塩酸3 mLを加えて加水分解する。
  2. 室温にサンプルを冷却し、脱イオン水5mLを追加することによって、自由にTNBSを抽出し、酢酸エチル10 mLのエーテル。
  3. ℃で15分間水浴中で室温まで冷却し、残留エーテルを蒸発させ、水15 mLで希釈して40に水相5 mLを温める。
  4. ブランクとキトサンのアミノ基の合計数を決定するためにCSMの準備のために使用されるキトサンなく、TNBS溶液を用いて、分光光度計で345 nmの吸光度を測定します。キトサンへの相対的なCSMの遊離アミノ基の数を推定する。

4。 CSMの読み込みASC

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. 一晩滅菌HBSSでセクション2.5から滅菌CSMの5mgを平衡化し、8μmの細孔径の膜培養プレートインサート(24ウェルプレート)に追加します。
  2. CSMはメンブレンに定住した後、慎重にHBSSを吸引し、目に増殖培地の挿入、700μLの内部に増殖培地300μLを追加インサートの外側の電子。
  3. 培養プレートのインサート内部CSM上の成長培地と種子の200μLの適切な濃度で再懸濁し、ASC(1×10 4から4×10 4)。カルチャーインサート内の培地の最終量は、播種後、500μLです。
  4. 37℃5%CO 2の加湿インキュベーター内で24時間CSM上でASCシードをインキュベート℃に

5。 CSMでのASCの読み込みと細胞生存率の割合を決定する

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. インキュベーション後、インサート膜に移行した細胞を乱すことなく滅菌1.5 mlのマイクロ遠心チューブにASCにロードされたCSMを収集します。
  2. 残留培地を除去し、チューブに新鮮な増殖培地250μLを追加します。
  3. 各チューブに[3 - (4,5 - dimethylthiozole -2 - イル)-2,5 - ジフェニルテトラゾリウムブロマイド]を25μLMTTを追加する溶液(5 mg / ml)と37℃5%CO 2の加湿インキュベーター中で4時間インキュベート℃、
  4. インキュベーション後、培地を除去し、ジメチルスルホキシドの250μLを追加し、ホルマザンの複合体を可溶化するために2から5分間ボルテックス混合物を。
  5. 5分間2700×gでCSMを遠心し、その基準として630 nmを用いて570 nmで測定した上清の吸光度を決定します。
  6. 実行可​​能なASCの知られている番号から得られた吸光度値からの相対CSMに関連付けられている細胞数を決定します。

6。 ASC-CSM-組み込みコラーゲンゲルを特徴付ける

注:特に断りのない限り、すべての手順は室温で行った。

  1. 2 N NaOHを用いて6.8にpHを調整した後、Bornstein 8とフィブリル化の方法に従って、ラットの尾の腱から抽出された1型コラーゲン(7.5 mg / ml)と混合ASCにロードされたCSM(5 mgを≈2×10 4細胞を含む)。 12ウェルプレートにフィブリル化コラーゲン-ASC-CSM混合物を追加し、37℃5%CO 2の加湿インキュベーター中で30分間インキュベート℃、
  2. 完全に心房細動の後、37℃で最大5%CO 2の加湿インキュベーター内で14日間のためにコラーゲン-ASC-CSMゲルをインキュベート
  3. ゲルにCSMからの細胞の放出と移行は、標準的な顕微鏡技術を用いて観察した。

7。代表的な結果

本研究では、コラーゲンゲル足場にキトサンミクロスフェア(CSM)から幹細胞を提供するためにin vitroでの戦略を開発しました。均一な大きさ(直径175から225μm)と組成の多孔CSMは、細胞のキャリア( 図2)として調製し使用しました。 CSMとASCをインキュベートすると、細胞は、CSMの2×10 4 cells/5mgの濃度で接続されている。糸状仮足を延長しながら細胞は、マイクロスフェアを介して拡散することができましたミクロスフェア( 図3)の多孔質の隙間に。セルにロードされたCSMは、コラーゲンゲルと混合した後、細胞はすぐにゲル( 図4)に移行し始めました。

表1に
表1。幹細胞デリバリーシステムのキトサンとコラーゲンの使用のための生物学的利点があります。

図1
図1回路図は、ASC-CSMロードされたコラーゲンの足場の二重使用のための全体的な戦略を描いた。 図2、3、4、画像解釈を支援するための回路図内で注釈が付けられています。

図2
図2の模式図では、キトサンミクロスフェアに幹細胞を播種の過程を描いた。 PROCμmの孔径の膜培養プレートインサート - ESSは8 CSMと共培養ASCが含まれます。 24時間後、微小球は、挿入から削除され、生体マトリックス中に埋め込むための準備が整いました。

図3
図3。ASCとCSM-ロードされた形態学的特性。パネルBは共焦点蛍光顕微鏡によって得られた画像を重ね合わせたビューの同じフィールドを示しているパネルは、ASCにロードされたのCSMの光顕微鏡写真を示しています。 ASCは、カルセインAM(緑色)がプリロードされた。パネルDは、ミクロスフェア(アスタリスク)にロードされた細胞を示しているパネルCは、無負荷時のマイクロスフェアのSEM像のイメージを示しています。パネルEのTEMイメージがアンロードされたミクロスフェアの断面を示しています。毛穴や割れ目の多数は、フェア全体に配置されています。パネルFは、細胞とのクロス切片ミクロスフェア(矢印)を接続し、CREに糸状仮足を延長を示しています。悪徳。オリジナル倍率:A&B = 70X、C = 500分の1、D = 2,000×、E&F = 2,500 X。

図4
図4三次元コラーゲンスキャフォールドにCSMからASCの移行。パネルAおよびBは、細胞が離れてミクロスフェアからの移行で、3日目にコラーゲンマトリックス(矢印)にCSMを描いています。パネルBは、12日後に同様の文化を示しています。透過型電子顕微鏡(TEM)画像は、ミクロスフェア(矢印)からの移行細胞とのクロス切片であったミクロスフェアを表示CとDにC、D、およびEアスタリスクで示されている。パネルDの高倍率は、パネルEに示すように、コラーゲン線維(挿入図)に接続されているセルの糸状仮足を示しています。オリジナル倍率:A&B = 100倍、C&D = 6,000 X; E = 20,000、はめ込み= 150,000 X。

図5
図5。回路図は、再生医療とドラッグデリバリーにおけるCSMの広大な使用方法を描いた。

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Discussion

幹細胞ベースの治療の主要なハードルは、修理のために指定された領域への細胞の送達のための効率的な方法を開発しています。患者変動への患者の、組織の種類、損傷の大きさと深さのために、幹細胞を提供する方法論は、ケースバイケースで決定する必要があります。マトリックス内の幹細胞を埋め込み、創傷部位にそれらを提供する組織工学のための次の論理的なアプローチであるように見えますが、いくつかの技術的なハードルが残っています。これは、マトリックスに接続し、細胞は、添付増殖アノイキス9月10日の前に適した微小環境を再確立することができる周囲の生体適合性を提供するために埋め込 ​​まれた細胞の機能が含まれています。このプロセスは、細胞は、幹細胞の増殖、遊走、分化、所望の細胞プロセスの前に達成するために数日かかることができるプロセスを彼らのマトリックスのリモデリング機構をアップレギュレートする必要があります。これらの問題を回避するため、我々はHAVEは、損傷組織の修復するために適切な行列にそれらを埋め込む前にキトサンミクロスフェアにプリロード幹細胞への方法を開発しました。当社独自のイオン架橋ミクロスフェアを調製するためのメソッドを使用して、プロトコルは、このようにセルの優れたマイクロサイズのキャリアを生成し、直径175から225μm以内であることがミクロスフェアの> 90%を準備することができます。さらに重要なのは、架橋した後、微小球は細胞接着のための非常に助長され、正に帯電したままになります。これらのマイクロスフェアの特徴は、幹細胞がCSMに素早く取り付けることができます。一度接続され、これらの幹細胞ロードされたミクロスフェアは、傷ついた組織を模倣して、このようなコラーゲンハイドロゲルとして、安定した足場の中で空間的配置を達成することができます。要するに、このプロトコルは、CSMにASCをロードするための新しい方法を提供し、それらの幹細胞の表現型を維持しながら、微小球上の細胞が移行できることを示しています。多孔CSMが提供する説明するそれでも優秀なASC添付ファイルの微小環境とは、細胞周囲のマトリックスに移行することができます。

概要:

重要なステップ

  • 径の変化に直接微小球のミリグラム当たりの細胞接着のために利用可能な表面積に影響を与えるので、均一なサイズのミクロスフェアを使用しています。
  • CSMへの細胞の最適な均一な添付ファイルへのカルチャーインサート内のミクロスフェアの均一なベッドを準備します。
  • メディアのボリュームは、細胞培養インサートの外側のウェルに添加していることを確認するだけでなく、内側の半月板よりも高くなっています。一般的に、内側:これは、微小球に付着する細胞を容易にするように1:2の外側の体積比は、適切である。
  • 足場内で均等に微小球をロードセルを配布しています。 ASC-CSMの分布が非常に密である場合、細胞は、それらの微小球から移行されません。
  • CSMと分布所望の量のbution密度は、アプリケーションと負傷した組織領域に依存しています。

制限事項

  • このメソッドは、ミクロスフェア上で利用可能な総表面積に制限されています。高い細胞数が必要な場合は、より多くのミクロスフェアは、表面積を大きくする必要があります。
  • プロセスは、細胞が予め形成されたミクロスフェアに上に播種することができますし、細胞のカプセル化の目的のために意図されていません。
  • このプロセスで開発されたキトサンマイクロスフェアは、細胞足場依存性がない他の細胞型をサポートすることができます。
  • キトサンミクロスので、油の混合物で乳化0.5M酢酸溶液を、(大豆油:n-オクタノール)を使用して開発され、それが上記の条件に対する脆弱性の活性治療成分が許可されていない有機溶剤を使用して回復。
  • CSMは主に高速な劣化に短い持続時間(5-10日)の細胞/薬を届けることを意図している率は、長期の可用性を目的としたものとは異なります。

可能な修正と多様性( 図5)

  • ミクロスフェアのサイズは、総表面積を変えるために変更されることがあります。例えば、ミクロスフェアのサイズは、順番にフェアにつき増加した細胞の負荷、その結果、全表面積とミクロスフィアに接続することができるセルの数を増加させるCSMの表面積/ mgを、高めるために低下する可能性があります。
  • キトサンマイクロスフェアは、他の細胞タイプ(血管内皮細胞、周皮細胞、線維芽細胞など)をロードするための担体として使用することができます。
  • セルにロードされた球は、(単一または複数のセルのタイプのいずれか)足場の特定の場所に埋め込むことができます。この戦略は、組織再生のための多組織工学の足場の構築に役立ちます。
  • 細胞送達に加えて、微小球はまた、治療薬を届けるために使用することができます(すなわち、増殖因子、分化誘導剤、および/または抗生物質)。これらの薬剤はロードされたミクロスフェアは、癒しと再生のプロセスを強化するために足場内のセルにロードされたミクロスフェアと組み合わせて使用​​することができます。

トラブルシューティング

  • サイズの大きな変動が発生した場合、CSMを準備する際に、次に項目の数は、所望のCSMのサイズ11を得るために調整することができます。
    • キトサン溶液の粘度。新たに調製した株式は、バッチ間の準備から一定の粘度の下で解決策を維持することが好ましい
    • エマルジョンを調製するために使用される界面活性剤の量(スパン80)を調整します。
    • オーバーヘッドスターラーの速度がプロセスを通じて一定のまま確保(速度は、電力の変動によって異なる場合があります
    • 付与大気を攪拌すると、乱流とサイズバリエーションを引き起こす可能性があり中に(これはKEことで回避できますただオーバーヘッドスターラーの刃の上に、攪拌中に形成液体のリップルを、EP。
  • ミクロスフェアの最適なセルローディングを確保するために、熱量MTTアッセイを行うことができます。これは、微小球のミリグラムあたりのロードされた生細胞数の推定値を与える。
  • コラーゲンハイドロゲルのような足場の中でそれらを混合する前に細胞培養培地、少量でそれらを懸濁することによって細胞にロードされたミクロスフェアの凝集を防ぐことができます。

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Disclosures

なし競合する経済的利益は存在しません。

免責事項

ここに記載されている意見やアサーションは、作者の私的見解であり、公式、または国防省、または米国政府の部門の意見を反映して解釈されるべきではありません。著者らは、米国政府の従業員であり、この作品は、その職務の一部として作成されました。すべての作業は、米陸軍医学研究および資材コマンドでサポートされていました。本研究では、米陸軍医学研究および資材コマンド機関審査委員会によって審査、承認されたプロトコルの下で実施され、承認されたプロトコルに準拠していた。

Acknowledgments

DOZは、ジュネーブ財団から授与の助成金によってサポートされています。 SNは、ピッツバーグ·ティッシュエンジニアリング·イニシアティブからポストドクトラルフェローシップ·グラントによってサポートされていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm nylon mesh filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm nylon mesh filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

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References

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バイオ、問題64、生体医工学、組織工学、キトサン、ミクロスフェア、コラーゲン、ハイドロゲル、細胞送達、脂肪由来幹細胞、ASC、CSM
幹細胞にロードされたキトサンミクロスフェアの配信のためにコラーゲンハイドロゲルの構築
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Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, More

Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, R. J. Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres. J. Vis. Exp. (64), e3624, doi:10.3791/3624 (2012).

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