Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Konstruera en Kollagen Hydrogel för leverans av Stem Cell-laddad kitosanmikrosfärer

doi: 10.3791/3624 Published: June 1, 2012
* These authors contributed equally

Summary

En stor hinder i nuvarande stamcellsterapi är att bestämma den mest effektiva metoden för att leverera dessa celler att värdvävnader. Här beskriver vi ett kitosan-baserad leverans metod som är effektiv och enkel i tillvägagångssätt, samtidigt som fett som härrör stamceller för att behålla sin multipotens.

Abstract

Multipotenta stamceller har visat sig vara mycket användbara när det gäller regenerativ medicin 1-3. Emellertid, i syfte att använda dessa celler effektivt för vävnadsregenerering, måste ett antal variabler beaktas. Dessa variabler inkluderar: den totala volymen och ytarean av implantationsstället, de mekaniska egenskaperna hos vävnaden och vävnaden mikromiljö, vilken innefattar mängden av vaskularisering och komponenterna i den extracellulära matrisen. Därför måste de material som används för att leverera dessa celler vara biokompatibla med en definierad kemisk sammansättning med bibehållande av en mekanisk hållfasthet som härmar värdvävnaden. Dessa material måste också vara permeabelt för syre och näringsämnen för att tillhandahålla en gynnsam mikromiljö för celler att fästa och föröka sig. Kitosan, en katjonisk polysackarid med utmärkt biokompatibilitet, kan lätt modifieras kemiskt och har en hög affinitet för att binda med in vivo-macromolecules 4-5. Kitosan efterliknar glykosaminoglykan del av den extracellulära matrisen, så att den kan fungera som ett substrat för cellvidfästning,-migration och-proliferation. I denna studie använder vi chitosan i form av mikrosfärer att leverera fett som härrör stamceller (ASC) i en kollagen baserat tredimensionell ställning 6. En ideal cell-till-mikrosfär-förhållandet bestämdes med avseende på inkubationstid och celldensitet för att uppnå maximala antalet celler som kan laddas. Gång ASC ympas på den kitosan-mikrosfärer (CSM), är de inbäddade i en kollagen byggnadsställning och kan upprätthållas i odling under längre tidsperioder. Sammanfattningsvis tillhandahåller denna studie en metod för att exakt leverera stamceller inom en tredimensionell byggnadsställning biomaterialet.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Isolera adipösa-härledda stamceller (ASC)

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Isolera råtta perirenalt och epididymalt fett-och tvätta med steril Hanks buffrade saltlösning (HBSS) innehållande 1% fetalt bovint serum (FBS) som tidigare beskrivits 6.
  2. Färs vävnaden och överföra 1-2 g i 25 ml HBSS innehållande 1% FBS i en 50 ml-rör och centrifugera vid 500 g under 8 min vid rumstemperatur.
  3. Uppsamla det fritt flytande skikt fettvävnad och överföring till 125 ml Erlenmeyer-kolv och behandlades med 25 ml kollagenas av typ II (200 U / ml) i HBSS under 45 min vid 37 ° C på en orbital skakanordning (125 rpm).
  4. Försiktigt bort den flytande fraktionen (nedan olja och fett-skiktet) och filtrera sekventiellt genom en 100 | im och 70 | im nylonnät filtret. Centrifugera extraktet i 500 g under 10 min vid rumstemperatur, aspirera supernatant och tvätta pelleten två gånger med 25 ml HBSS.
  5. Resuspendera cellpelleten i 50 ml tillväxtmedium (MesenPRO RS Basal Medium) kompletterat med MesenPRO RS tillväxtsupplement, antibiotikum-antimykotikum (100 U / ml penicillin G, 100 ug / ml streptomycinsulfat och 0,25 | ig / ml Amfotericin B) och 2 mM L-glutamin och celler Pipettera i 2 T75-kolvar (25 ml / kolv).
  6. Kultur av ASC i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C (Passage 2-4 ASC används för alla experiment).

2. Förberedelse kitosanmikrosfärer (CSM)

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. CSM förbereds av en vatten-i-olja emulgering process tillsammans med en jonisk koacervation teknik med vår tidigare protokoll 6. Emulgera en vattenhaltig lösning av kitosan (6 ml 3% vikt / volym kitosan i 0,5 M ättiksyra) i en 100 ml av en oljefas bestående av sojaolja, n-oktanol (1:2 volym / volym) och 5% sorbitan-mono-oleat (Spän 80) emulgeringsmedel, med användning av överliggande (1700 rpm) och magnetisk omrörning (1000 rpm) samtidigt, i motsatta riktningar. Detta dubbla metod för att blanda säkerställer att miceller bildas tidigt innan tvärbindning sker kan förbli i lösning och inte sedimentera till botten. Dessutom magnetomrörare stöd i de-aggregering kitosan under micellbildning och rigidization.
  2. Blandningen omröres kontinuerligt under ca 1 timme tills en stabil vatten-i-olja-emulsion erhålles. Jonisk tvärbindning initieras genom tillsats av 1,5 ml av 1% vikt / volym kaliumhydroxid i n-oktanol var 15 min under 4 timmar (24 ml totalt).
  3. Efter fullbordan av tvärbindningsreaktionen, långsamt dekantera oljefasen av blandningen innehållande CSM och tillsätt omedelbart sfärerna till 100 ml aceton. Tvätta kulorna med aceton tills oljefasen avlägsnas fullständigt.
  4. Torka de återvunna kulor i en vakuum-exsickator och analyze utan vidare bearbetning. Den genomsnittliga CSM partikelstorlek, ytarea per mg, och enheten kubiska volym bestämdes med användning partikelstorleksanalysator.
  5. För efterföljande experiment, tvätta CSM tre gånger med sterilt vatten för att avlägsna kvarvarande salter och sterilisera med absolut alkohol.

3. Bestämning av antalet fria aminogrupper i CSM

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Bestäm antalet fria aminogrupper närvarande i CSM efter jonisk tvärbindning med hjälp av trinitro bensen (TNBS) syra analys av Bubins och Ofner 7. Inkubera 5 mg mikrosfärer med 1 mL av 0,5% TNBS-lösning i en 50 ml glasrör under 4 h vid 40 ° C och hydrolyseras med tillsats av 3 mL av 6N HCl vid 60 ° C under 2 timmar.
  2. Kyla proven till rumstemperatur och extrahera de fria TNBS genom tillsats av 5 ml avjoniserat vatten och 10 ml etyl-eter.
  3. Värm en 5 ml alikvot av den vattenhaltiga fasen till 40 ° C i ett vattenbad under 15 min för att förånga eventuell kvarvarande eter, kyl till rumstemperatur och späd med 15 ml vatten.
  4. Mät absorbansen vid 345 nm med en spektrofotometer med användning av TNBS-lösning utan kitosan som blank och kitosan som används för framställning CSM att fastställa det totala antalet aminogrupper. Uppskatta antalet fria aminogrupper av CSM i förhållande till kitosan.

4. Laddar ASC i CSM

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Ekvilibrera 5 mg steriliseras CSM i avsnitt 2,5 i sterila HBSS natten och lägga till en 8-m porstorlek odlingsplatta insats (24-brunnar).
  2. Efter CSM har fast på membranet, noggrant aspireras HBSS och tillsätt 300 | il tillväxtmedium till insidan av insatsen och 700 | il av odlingsmediet till the utsidan av insatsen.
  3. Återsuspendera ASC vid lämplig koncentration (1 x 04 till 4 oktober x 10 4) i 200 | il av odlingsmediet och säd över CSM inuti odlingsplatta insatsen. Den slutliga volymen av mediet i odlingsinsatsen, efter ympning, är 500 | il.
  4. Inkubera ympade ASC på CSM i 24 timmar i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.

5. Fastställande av Andel ASC Lastning och cellviabilitet i CSM

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Efter inkubation uppsamlades den ASC-laddade CSM i en steril 1,5 ml mikrocentrifugrör utan att störa de celler som har migrerat in i insatsen membranet.
  2. Avlägsna återstående mediet och tillsätt 250 | il färskt tillväxtmedium till röret.
  3. Till varje rör tillsätt 25 pl MTT-[3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid]lösning (5 mg / ml) och inkubera under 4 h i en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  4. Efter inkubation, avlägsna mediet, tillsätt 250 | il dimetylsulfoxid, och virveln i blandningen under 2-5 minuter för att solubilisera formazan-komplexet.
  5. Centrifugera CSM vid 2700 x g under 5 min och bestämma den överstående absorbansen mättes vid 570 nm med användning av 630 nm som referens.
  6. Bestämma cellantalet associerad med CSM relativt absorbansvärde som erhållits från ett känt antal livskraftiga ASC.

6. Kännetecknande ASC-CSM-Embedded kollagengel

Notera: Alla förfaranden genomfördes vid rumstemperatur om inget annat anges.

  1. Blandning ASC-laddad CSM (5 mg innehållande ≈ 2 x 10 4-celler) med typ 1 kollagen (7,5 mg / ml) extraherades från råttsvanssena enligt metoden av Bomstein 8 och fibrillera efter justering av pH till 6,8 med användning av 2 N NaOH. Tillsätt den fibrillerade kollagen-ASC-CSM blandningen till en 12-brunnars platta och inkubera under 30 min vid en 5% CO2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  2. Efter fullständig flimmer inkubera kollagen-ASC-CSM geler upp till 14 dagar i en 5% CO 2 fuktad inkubator vid 37 ° C.
  3. Release och migration av celler från CSM i gelén observerades användning av standard mikroskopi tekniker.

7. Representativa resultat

I föreliggande studie har vi utvecklat ett in vitro-strategi för att skapa stamceller från kitosan-mikrosfärer (CSM) i en kollagengel byggnadsställning. Porösa CSM av enhetlig storlek (175-225 pm i diameter) och sammansättning framställdes och användes som cell bärare (Figur 2). Efter inkubering ASC med CSM cellerna fäst vid en koncentration av 2 x 10 4 cells/5mg av CSM. Cellerna kan sprida över mikrosfären och utsträcka filopodiain i de porösa sprickorna i mikrosfären (figur 3). När väl den cell-laddade CSM blandades med kollagengel, började cellerna omedelbart migrerar in i de geler (figur 4).

Tabell 1
Tabell 1. Biologiska fördelar för användningen av kitosan och kollagen i en stamcell avgivningssystem.

Figur 1
Figur 1. Schematisk visar den övergripande strategin för den dubbla användningen av ASC-CSM laddade kollagen ställningar. Figurerna 2, 3 och 4 är kommenterad i schematiska att hjälpa till med tolkning av bilderna.

Figur 2
Figur 2. Schematisk representation som beskriver processen för ympning stamceller på kitosan-mikrosfärer. ProcESS handlar samodling ASC med CSM i en 8 - m porstorlek odlingsplatta insats. Efter 24 timmar, mikrosfärerna bort från insatsen och är klara för inbäddning i ett biomaterial matris.

Figur 3
Figur 3. Morfologisk karakterisering av CSM laddad-med ASC. Panel A visar ett Ijusmikrofoto av ASC-laddade CSM, medan panel B visar samma bildfält överlagrad med en bild erhållen genom konfokal fluorescensmikroskopi. ASC var förladdad med kalcein AM (grön). Panel C visar en bild av en SEM-bild av en obelastad mikrosfär, medan panel D visar celler laddades på mikrosfären (asterisker). TEM bilden i panel E visar en tvärsektion av en obelastad mikrosfär. En mängd porer och sprickor finns i hela mikrosfären. Panel F visar en tvärsektion mikrosfär med celler (pilar) som är fäst och som sträcker sig filopodia in i cre-laster. Original förstoringar: A & B = 70X, C = 500x, D = 2.000 x, E & F = 2.500 x.

Figur 4
Figur 4. Migration av ASC från CSM i den tredimensionella byggnadsställningen kollagen. Panelerna A och B avbildar CSM med celler migrerar bort från mikrosfären och in i kollagenmatrisen på dag 3 (A, pilar). Panel B visar ett liknande kultur efter 12 dagar. Transmissionselektronmikroskopi (TEM) är bilder som avbildas i C, D och E. Asterisker i C och D visar en mikrosfär som har tvärsnitt med celler migrerar bort från mikrosfären (pilar). Större förstoring av panel D, visas i panel E, och visar cellen filopodia förknippas kollagenfibriller (infälld). Original förstoring: A & B = 100x, C & D = 6.000 x; E = 20.000 x, infälld = 150.000 x.

Figur 5
Figur 5.Schematisk skildrar de stora användningsområdena för CSM i regenerativ medicin och läkemedel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En stor hinder i stam cell-baserad terapi utvecklar effektiva metoder för leverans av celler till de angivna områden för reparation. Grund av en patient till en variabilitet vävnadstypen, skada storlek och djup, måste metoden för att leverera stamceller bestämmas från fall till fall. Även bädda stamceller i en matris och leverera dem till sårstället verkar vara ett nästa logiska strategi för tissue engineering, vissa tekniska hinder kvar. Detta inkluderar förmågan hos de inbäddade cellerna att fästa till matrisen och ger ett biokompatibelt omger där cellerna kan bifoga förökar sig och återupprätta en lämplig mikromiljö innan anoikis 9-10. Denna process kräver att cellerna uppreglera sina maskiner matrix remodeling, en process som kan ta dagar att genomföra före den önskade cellen processerna proliferation, migration och differentiering av stamceller. För att kringgå dessa frågor, h viave utvecklat en metod att förspänning stamceller på kitosanmikrosfärer innan bädda in dem i en lämplig matris att reparera den skadade vävnaden. Användning vårt unika jonisk tvärbindning metoder för att framställa mikrosfärerna, är protokollet kunna framställa> 90% av mikrosfärerna vara inom 175-225 nm i diameter, vilket genererar en utmärkt mikrostorlek bärare för celler. Ännu viktigare är att efter tvärbindning, mikrosfärerna förblir positivt laddad, vilket är mycket lämpad för cellbindning. Dessa mikrosfär egenskaper gör det möjligt stamceller att fästa snabbt på CSM. Väl ansluten dessa stamceller mikrosfärer är stabila och har förmåga att uppnå rumsliga arrangemang i ställningen, såsom kollagen hydrogeler, för att efterlikna den skadade vävnaden. Sammanfattningsvis ger detta protokoll en ny metod för att ladda ASC på CSM och visar att cellerna på mikrosfärerna kan migrera samtidigt bevara sitt fenotyp stamceller. Den porösa CSM beskrivits tillhandahålla enutmärkt mikromiljö för ASC fastsättning och fortfarande tillåta cellerna att migrera in i den omgivande matrisen.

Sammanfattning:

Kritiska steg

  • Använda enhetligt dimensionerade mikrosfärer eftersom variationen i diameter direkt påverkar ytarean som finns tillgänglig för cellbindning per mg mikrosfär.
  • Framställa en likformig bädd av mikrosfärer inom odlingsinsatsen till optimal enhetlig vidhäftning av cellerna till CSM.
  • Säkerställa att volymen av mediet tillsattes till den yttre brunn i cellkultur insatsen är större än menisken hos det inre brunn. Typiskt en inre: är den yttre volymförhållande av 1:2 är lämpligt, eftersom detta underlättar celler fästa till mikrosfärerna.
  • Fördela cellen mikrosfärer jämt i schavotten. Om fördelningen av ASC-CSM är alltför tät, kommer cellerna inte migrera från sitt mikrosfärer.
  • Önskad mängd CSM och distributiondistributionskanaler densitet är beroende av applikation och skadad vävnad område.

Begränsningar

  • Denna metod är begränsad till den totala ytarean som finns tillgänglig på mikrosfärerna. Om en högre cellantal önskas, är mer mikrosfärer behövs för att öka ytarean.
  • Processen möjliggör för celler att ympas på den förformade mikrosfärer och är inte avsedd för ändamål cellinkapslingsorgan.
  • Den kitosanmikrosfärer utvecklats i denna process kan stödja förankringsberoende celler men inte andra celler typer.
  • Eftersom kitosanmikrosfärer har utvecklats med användning av en 0,5 M ättiksyralösning, emulgerat i en oljeblandning (sojaolja: n-oktanol) och utvanns med användning av organiska lösningsmedel är det inte tillåter aktiva terapeutiska grupper känsliga för de ovan nämnda tillstånd.
  • Den CSM är huvudsakligen avsedda för att leverera celler / läkemedel i kortare tidsintervall (5-10 dagar) på grund av dess snabbare nedbrytningtakt, till skillnad från de som är avsedda för lång tid tillgänglighet.

Möjliga Ändringar och mångsidighet (Figur 5)

  • Mikrosfärstorleken kan modifieras för att förändra den totala ytarean. Till exempel kan mikrosfärstorleken reduceras för att öka ytarean / mg CSM, vilket i sin tur kommer att öka den totala ytarean och antalet celler som kan fästa till mikrosfärerna, vilket resulterar i en ökad cell belastningen per mikrosfär.
  • Kitosan-mikrosfärer kan användas som en bärare för att fylla på andra celltyper (endotelceller och pericyter, fibroblaster, etc).
  • Cell-laddade kulor (antingen enkel-eller multipel-cell-typer) kan vara inbäddad i specifika lägen av byggnadsställningar. Denna strategi kommer att bidra till byggandet av flercelliga vävnadstekniska byggnadsställningar för vävnadsregenerering.
  • Förutom celladministrering, kan mikrosfärer också användas för att avge terapeutiska läkemedel (dvs, tillväxtfaktorer, inducerare differentiering och / eller antibiotika). Dessa läkemedel mikrosfärer kan också användas i kombination med cell-laddade mikrosfärer inom en byggnadsställning för att öka läkningen och att återhämta sig.

Felsökning

  • Vid utarbetandet av CSM, om en stor variation i storlek inträffar, då ett antal poster kan justeras för att ge önskad CSM storlek 11.
    • Viskositeten hos kitosanlösningen. Nyframställd lager är föredraget att hålla lösningen under konstant viskositet från sats till sats beredning
    • Justera volym av ytaktivt medel (SPÄN 80) användes för att framställa emulsionen.
    • Säkerställa att hastigheten för overhead-omrörare förblir konstant under hela processen (hastighet kan variera med elspänningsfluktueringar
    • Under omrörning förlänar atmosfärisk luft kan orsaka turbulens och storlek variation (detta kan undvikas genom keEP vätskan krusning, som bildas under omröring, strax över bladen hos den överliggande omrörare.
  • För att säkerställa optimal cellbelastning för mikrosfärerna, kan en kalorimetrisk MTT-analysen kan utföras. Detta kommer att ge en uppskattning av antalet viabla celler laddades per mg mikrosfär.
  • Förhindra klumpning av cell-laddade mikrosfärer genom att suspendera dem i en liten volym medium för cellodling innan de blandas i en byggnadsställning såsom en kollagen hydrogel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga konkurrerande finansiella intressen finns.

Disclaimers

De åsikter eller påståenden som finns här är de privata åsikter författarnas egna och skall inte tolkas som officiella eller reflekterande synpunkter från Department of Defense och den amerikanska regeringen. Författarna är anställda av den amerikanska regeringen, och detta arbete framställdes som en del av deras officiella plikter. Allt arbete fick stöd av den amerikanska armén medicinsk forskning och materiel Command. Denna studie utfördes under ett protokoll granskas och godkännas av den amerikanska armén medicinsk forskning och Materielverk Institutional Review Board, och i enlighet med den godkända protokollet.

Acknowledgments

Doz stöds av ett bidrag som beviljats ​​från The Geneva Foundation. SN fick stöd av postdoktorsstipendium Grant från Pittsburgh Tissue Engineering Initiative.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14175 Consumable
Fetal Bovine Serum Hyclone SH30071.03 Consumable
Collagenase Type II Sigma-Aldrich C6685 Consumable
70-μm nylon mesh filter BD Biosciences 352350 Consumable
100-μm nylon mesh filter BD Biosciences 352360 Consumable
MesenPRO Growth Medium System Invitrogen 12746-012 Consumable
L-glutamine GIBCO, by Life Technologies 25030 Consumable
T75 Tissue Culture Flask BD Biosciences 137787 Consumable
Chitosan Sigma-Aldrich 448869 Consumable
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Consumable
N-Octanol Acros Organics 150630025 Consumable
Sorbitan-Mono-oleate Sigma-Aldrich S6760 Consumable
Potassium Hydroxide Sigma-Aldrich P1767 Consumable
Acetone Fisher Scientific L-4859 Consumable
Ethanol Sigma-Aldrich 270741 Consumable
Trinitro Benzenesulfonic Acid Sigma-Aldrich P2297 Consumable
Hydrochloric Acid Sigma-Aldrich 320331 Consumable
Ethyl Ether Sigma-Aldrich 472-484 Consumable
8-μm Tissue Culture Plate Inserts BD Biosciences 353097 Consumable
1.5-ml Microcentrifuge Tubes Fisher Scientific 05-408-129 Consumable
MTT Reagent Invitrogen M6494 Consumable
Dimethyl Sulfoxide Sigma-Aldrich D8779 Consumable
Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) Molecular Probes, Life Technologies Q2502PMP Consumable
Type 1 Collagen Travigen 3447-020-01 Consumable
Sodium Hydroxide Sigma-Aldrich S8045 Consumable
12-Well Tissue Culture Plates BD Biosciences 353043 Consumable
Centrifuge Eppendorf 5417R Equipment
Orbital Shaker New Brunswick Scienctific C24 Equipment
Humidified Incubator with Air-5% CO2 Thermo Fisher Scientific, Inc. Model 370 Equipment
Overhead Stirrer IKA Visc6000 Equipment
Magnetic Stirrer Corning PC-210 Equipment
Vacuum Desiccator - - Equipment
Particle Size Analyzer Malvern Instruments STP2000 Spraytec Equipment
Water Bath Fisher Scientific Isotemp210 Equipment
Spectrophotometer Beckman Coulter Inc. Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer Equipment
Vortex Diagger 3030a Equipment
Microplate Reader Molecular Devices SpectraMax M2 Equipment
Light/Fluorescence Microscope Olympus Corporation IX71 Equipment
Confocal Microscope Olympus Corporation FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope Equipment
Scanning Electron Microscope Carl Zeiss, Inc. Leo 435 VP Equipment
Transmission Electron Microscope JEOL JEOL 1230 Equipment

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Krampera, M. Mesenchymal stem cells for bone, cartilage, tendon and skeletal muscle repair. Bone. 39, 678-683 (2006).
  2. Patrick, C. W. Tissue engineering strategies for adipose tissue repair. Anat. Rec. 263, 361-366 (2001).
  3. Pountos, I., Giannoudis, P. V. Biology of mesenchymal stem cells. Injury. 36, Suppl 3. S8-S12 (2005).
  4. Kim, I. Y. Chitosan and its derivatives for tissue engineering applications. Biotechnol. Adv. 26, 1-21 (2008).
  5. Shi, C. Therapeutic potential of chitosan and its derivatives in regenerative medicine. J. Surg. Res. 133, 185-192 (2006).
  6. Natesan, S. Adipose-derived stem cell delivery into collagen gels using chitosan microspheres. Tissue Eng. Part. A. 16, 1369-1384 (2010).
  7. Bubnis, W. A., Ofner, C. M. 3rd The determination of epsilon-amino groups in soluble and poorly soluble proteinaceous materials by a spectrophotometric method using trinitrobenzenesulfonic acid. Anal. Biochem. 207, 129-133 (1992).
  8. Bornstein, M. B. Reconstituted rattail collagen used as substrate for tissue cultures on coverslips in Maximow slides and roller tubes. Lab Invest. 7, 134-137 (1958).
  9. Benoit, D. S. Integrin-linked kinase production prevents anoikis in human mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 81, 259-268 (2007).
  10. Nuttelman, C. R., Tripodi, M. C., Anseth, K. S. Synthetic hydrogel niches that promote hMSC viability. Matrix Biol. 24, 208-218 (2005).
  11. Shanmuganathan, S. Preparation and characterization of chitosan microspheres for doxycycline delivery. Carbohydr. Polym. 73, 201-211 (2008).
  12. Haque, T., Chen, H., Ouyang, W., Martoni, C., Lawuyi, B., Urbanska, A., Prakash, S. Investigation of a new microcapsule membrane combining alginate, chitosan, polyethylene glycol and poly-L-lysine for cell transplantation applications. Int. J. Artif. Organs. 28, 631-637 (2005).
  13. Goren, A., Dahan, N., Goren, E., Baruch, L., Machluf, M. Encapsulated human mesenchymal stem cells: a unique hypoimmunogenic platform for long-term cellular therapy. FASEB J. 24, 22-31 (2010).
  14. Zielinski, B. A., Aebischer, P. Chitosan as a matrix for mammalian cell encapsulation. Biomaterials. 15, 1049-1056 (1994).
  15. Girandon, L., Kregar-Velikonja, N., Božikov, K., Barliç, A. In vitro Models for Adipose Tissue Engineering with Adipose-Derived Stem Cells Using Different Scaffolds of Natural Origin. Folia Biol. (Praha). 57, 47-56 (2011).
  16. Baruch, L., Machluf, M. Alginate-chitosan complex coacervation for cell encapsulation: effect on mechanical properties and on long-term viability. Biopolymers. 82, 570-579 (2006).
  17. Wei, Y., Gong, K., Zheng, Z., Wang, A., Ao, Q., Gong, Y., Zhang, X. Chitosan/silk fibroin-based tissue-engineered graft seeded with adipose-derived stem cells enhances nerve regeneration in a rat model. J. Mater. Sci. Mater. Med. (2011).
  18. Wang, Q., Jamal, S., Detamore, M. S., Berkland, C. PLGA-chitosan/PLGA-alginate nanoparticle blends as biodegradable colloidal gels for seeding human umbilical cord mesenchymal stem cells. J. Biomed. Mater. Res. A. 96, 520-527 (2011).
  19. Alves da Silva, M. L., Martins, A., Costa-Pinto, A. R., Correlo, V. M., Sol, P., Bhattacharya, M., Faria, S., Reis, R. L., Neves, N. M. Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor. J. Tissue Eng. Regen. Med. (2010).
  20. Kang, Y. M., Lee, B. N., Ko, J. H., Kim, G. H., Kang, K. N., Kim da, Y., Kim, J. H., Park, Y. H., Chun, H. J., Kim, C. H., Kim, M. S. In vivo biocompatibility study of electrospun chitosan microfiber for tissue engineering. Int. J. Mol. Sci. 11, 4140-4148 (2010).
  21. Bozkurt, G., Mothe, A. J., Zahir, T., Kim, H., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Chitosan channels containing spinal cord-derived stem/progenitor cells for repair of subacute spinal cord injury in the rat. Neurosurgery. 67, 1733-1744 (2010).
  22. Leipzig, N. D., Wylie, R. G., Kim, H., Shoichet, M. S. Differentiation of neural stem cells in three-dimensional growth factor-immobilized chitosan hydrogel scaffolds. Biomaterials. 32, 57-64 (2011).
  23. Altman, A. M., Gupta, V., Ríos, C. N., Alt, E. U., Mathur, A. B. Adhesion, migration and mechanics of human adipose-tissue-derived stem cells on silk fibroin-chitosan matrix. Acta Biomater. 6, 1388-1397 (2010).
  24. Altman, A. M., Yan, Y., Matthias, N., Bai, X., Rios, C., Mathur, A. B., Song, Y. H., Alt, E. U. IFATS collection: Human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model. Stem Cells. 27, 250-258 (2009).
  25. Machado, C. B., Ventura, J. M., Lemos, A. F., Ferreira, J. M., Leite, M. F., Goes, A. M. 3D chitosan-gelatin-chondroitin porous scaffold improves osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells. Biomed. Mater. 2, 124-131 (2007).
Konstruera en Kollagen Hydrogel för leverans av Stem Cell-laddad kitosanmikrosfärer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, R. J. Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres. J. Vis. Exp. (64), e3624, doi:10.3791/3624 (2012).More

Zamora, D. O., Natesan, S., Christy, R. J. Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres. J. Vis. Exp. (64), e3624, doi:10.3791/3624 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter