Summary
वर्तमान स्टेम सेल उपचार में एक बड़ी बाधा सबसे प्रभावी मेजबान के ऊतकों को इन कोशिकाओं को देने के लिए विधि का निर्धारण है. यहाँ, हम एक प्रसव chitosan आधारित पद्धति है कि कुशल और सरल दृष्टिकोण में है का वर्णन है, जबकि वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल उनके multipotency के बनाए रखने के लिए अनुमति देता है.
Abstract
Multipotent स्टेम कोशिकाओं पुनर्योजी दवा 1-3 के क्षेत्र में अत्यंत उपयोगी हो दिखाया गया है. हालांकि, इन कोशिकाओं ऊतक उत्थान के लिए प्रभावी ढंग से इस्तेमाल करने के लिए आदेश में, चर की संख्या को ध्यान में रखा जाना चाहिए. कुल मात्रा और आरोपण साइट की सतह क्षेत्र, ऊतक के यांत्रिक गुणों और ऊतक microenvironment, जो vascularization और बाह्य मैट्रिक्स के घटकों की राशि भी शामिल है: इन चर शामिल हैं. इसलिए, सामग्री के लिए इन कोशिकाओं को देने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा एक परिभाषित रासायनिक संरचना के साथ biocompatible है जबकि एक यांत्रिक शक्ति है कि मेजबान ऊतक mimics बनाए रखने चाहिए. इन सामग्रियों को भी ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की कोशिकाओं को देते हैं और पैदा के लिए एक अनुकूल microenvironment प्रदान करने के लिए प्रवेश के योग्य होना चाहिए. Chitosan, उत्कृष्ट biocompatibility के साथ एक cationic polysaccharide, आसानी से रासायनिक और संशोधित कर सकते हैं vivo में मैक के साथ बाँध के लिए एक उच्च संबंध है4-5 romolecules. Chitosan बाह्य मैट्रिक्स के ग्लाइकोसमिनोग्लाइकन भाग mimics, यह कोशिका आसंजन, प्रवास, और प्रसार के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में कार्य करने के लिए सक्षम है. इस अध्ययन में हम microspheres के रूप में chitosan का उपयोग करने के लिए एक तीन आयामी पाड़ 6 आधारित कोलेजन में वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (ए एस सी) देने. एक आदर्श सेल करने के लिए microsphere अनुपात ऊष्मायन समय और सेल घनत्व कोशिकाओं है कि लोड किया जा सकता है की अधिकतम संख्या प्राप्त करने के लिए सम्मान के साथ निर्धारित किया गया था. एक बार ए एस सी chitosan के microspheres (CSM) पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं, वे एक कोलेजन पाड़ में एम्बेडेड रहे हैं और संस्कृति में विस्तारित अवधि के लिए बनाए रखा जा सकता है. सारांश में, इस अध्ययन के एक ठीक करने के लिए एक तीन आयामी biomaterial पाड़ के भीतर स्टेम सेल देने के लिए एक तरीका प्रदान करता है.
Protocol
1. अलग वसा व्युत्पन्न स्टेम सेल (एएससी)
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- Perirenal चूहा और अधिवृषणी वसा को अलग और बाँझ हांक नमक बफर (HbSS) समाधान 1% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त के रूप में पहले 6 वर्णित से धो.
- ऊतक क़ीमा और 50 एमएल ट्यूब और कमरे के तापमान में 8 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 500 जी में 1% FBS युक्त HbSS के 25 एमएल में 1-2 जी हस्तांतरण.
- इकट्ठा मुक्त अस्थायी वसा ऊतक परत और 125 एमएल erlenmeyer कुप्पी हस्तांतरण और 37 पर 45 मिनट के लिए HbSS में 25 में Collagenase प्रकार द्वितीय (200 यू / एमएल) की एमएल के साथ इलाज ° सी एक कक्षीय हिलनेवाला (125 आरपीएम).
- ध्यान से तरल अंश (तेल और वसा की परत के नीचे) को हटाने और एक 100 माइक्रोन और 70 माइक्रोन नायलॉन जाल फिल्टर के माध्यम से क्रमिक रूप से फिल्टर. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए 500 जी में छानना अपकेंद्रित्र, supernatan महाप्राण (व्यंजन)टी और गोली 25 एमएल HbSS के साथ दो बार धोना.
- विकास मध्यम (MesenPRO रुपये बेसल मध्यम) MesenPRO रुपये ग्रोथ अनुपूरक, एंटीबायोटिक कवकनाशी (100 यू / पेनिसिलिन जी, 100 μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन सल्फेट, और 0.25 μg एमएल / Amphotericin से बी एमएल) के साथ पूरक की 50 एमएल में सेल गोली Resuspend , और 2 T75 बोतल (25 एमएल / फ्लास्क) में 2 मिमी एल glutamine और pipet कोशिकाओं.
- 37 डिग्री सेल्सियस (2-4 पारित ए एस सी सभी प्रयोगों के लिए उपयोग किया जाता है) पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में ए एस सी संस्कृति है.
2. Chitosan microspheres (CSM) की तैयारी
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- CSM एक ईओण राशीकरण के हमारे पिछले 6 प्रोटोकॉल तकनीक का उपयोग के साथ पानी में तेल पायसीकरण प्रक्रिया द्वारा तैयार कर रहे हैं. एक तेल चरण मिश्रण की 100 एमएल सोया की निर्वाचकगण में chitosan के एक जलीय घोल (0.5 एम एसिटिक एसिड में 6 3% w / वी chitosan एमएल) रासायनिक पायसीतेल, n - octanol (1:2 वी / वी) और 5% पायसीकारकों Sorbitan मोनो oleate (80 अवधि), (1700 rpm) भूमि के ऊपर और चुंबकीय (1000 आरपीएम) एक साथ सरगर्मी विपरीत दिशाओं में है, का उपयोग कर. मिश्रण सुनिश्चित करता है कि पार से जोड़ने से पहले होता है पर जल्दी बनते micelles समाधान में बनी रहती है और के बसने नीचे नहीं कर सकते हैं की इस दोहरी विधि. इसके अलावा, चुंबकीय पट्टी में हलचल एड्स micelle गठन और rigidization दौरान chitosan के डी - कुल.
- मिश्रण लगातार एक स्थिर पायस पानी में तेल प्राप्त किया जाता है जब तक लगभग 1 घंटे के लिए हड़कंप मच गया. इस ईओण crosslinking 1% w / v n - octanol 4 घंटे (24 एमएल) के लिए हर 15 मिनट में पोटेशियम हीड्राकसीड के 1.5 एमएल के अलावा के साथ शुरू की है.
- Crosslinking प्रतिक्रिया के पूरा होने के बाद, धीरे धीरे मिश्रण युक्त CSM के तेल चरण छानना और तुरंत एसीटोन की 100 एमएल क्षेत्रों जोड़ने. एसीटोन साथ क्षेत्रों धो तेल चरण तक पूरी तरह से हटा दिया जाता है.
- एक निर्वात desiccator और गुदा में बरामद क्षेत्रों सूखीआगे की प्रक्रिया के बिना yze. औसत CSM के कण आकार, सतह क्षेत्र और मिलीग्राम प्रति इकाई घन मात्रा कण आकार विश्लेषक का उपयोग करके निर्धारित किया गया था.
- बाद के प्रयोगों के लिए, बाँझ जल के साथ CSM तीन बार धोने के लिए अवशिष्ट लवण को दूर करने के लिए और पूर्ण शराब के साथ बाँझ.
3. CSM में मुफ्त एमिनो समूह की संख्या निर्धारण
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- मुक्त अमीनो ईओण crosslinking के बाद CSM में मौजूद trinitro benzenesulfonic (TNBS) Bubins और OFNER 7 एसिड परख का उपयोग करके समूहों की संख्या का निर्धारण करते हैं. 1 एक 50 एमएल ग्लास ट्यूब में 0.5% TNBS समाधान के 40 डिग्री सेल्सियस से कम 4 घंटे के लिए एमएल के साथ microspheres की 5 मिलीग्राम सेते हैं और 2 के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर 6N एचसीएल 3 एमएल के अलावा के साथ Hydrolyze.
- कमरे के तापमान के लिए नमूनों को शांत करने के लिए, और विआयनीकृत पानी की 5 एमएल और एथिल की 10 एमएल जोड़कर मुफ्त TNBS निकालनेईथर.
- 40 करने के लिए डिग्री सेल्सियस एक नहाने के पानी में 15 मिनट किसी भी अवशिष्ट आकाश, कमरे के तापमान को शांत, लुप्त हो जाना करने के लिए और पानी के 15 एमएल के साथ पतला के लिए एक जलीय चरण 5 एमएल अशेष भाजक गर्म.
- 345 एनएम पर एक chitosan के बिना TNBS समाधान का उपयोग कर के रूप में खाली और chitosan CSM के तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया एमिनो समूहों की कुल संख्या का निर्धारण स्पेक्ट्रोफोटोमीटर साथ absorbance के उपाय. Chitosan के सापेक्ष CSM की मुक्त एमिनो समूहों की संख्या का अनुमान है.
4. लोड हो रहा है CSM में ए एस सी
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- संतुलित करना रातोंरात बाँझ HbSS में 2.5 अनुभाग से निष्फल CSM की 5 मिलीग्राम और 8 माइक्रोन रोमकूप आकार झिल्ली संस्कृति थाली डालने (24 अच्छी तरह से थाली) को जोड़ने.
- बाद CSM झिल्ली पर बसे है, ध्यान से HbSS महाप्राण (व्यंजन) और डालने के अंदर और विकास मीडिया के 700 μL वें मध्यम विकास की 300 μL जोड़नेबाहर डालने का ई.
- उपयुक्त एकाग्रता में resuspend ए एस सी (1 10 x 4 x 4 10 4) के विकास और संस्कृति थाली डालने के अंदर CSM पर मध्यम बीज के 200 μL में. संस्कृति डालने के भीतर माध्यम की अंतिम मात्रा, बोने के बाद, 500 μL है.
- CSM पर ए एस सी वरीयता प्राप्त सेते हैं एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस
5. CSM में ए एस सी लोड हो रहा है और सेल व्यवहार्यता का प्रतिशत निर्धारण
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- ऊष्मायन के बाद, बिना कोशिकाओं कि डालने झिल्ली में चले गए परेशान ए एस सी भरी हुई बाँझ 1.5 मिलीग्राम microcentrifuge के ट्यूब में CSM इकट्ठा.
- अवशिष्ट मध्यम निकालें और ट्यूब ताजा मध्यम विकास के 250 μL जोड़ें.
- प्रत्येक ट्यूब 25 μL MTT [3 - (4,5 - dimethylthiozole-2-YL) -2,5 - diphenyltetrazolium ब्रोमाइड] जोड़ने(5 मिलीग्राम / एमएल) समाधान और एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 4 घंटे के लिए 37 सेते हैं ° सी.
- ऊष्मायन के बाद, मध्यम निकालने के लिए, डाइमिथाइल sulfoxide के 250 μL जोड़ने, और 2-5 लिए formazan जटिल solubilize मिनट के लिए मिश्रण भंवर.
- 2700 एक्स जी पर 5 मिनट के लिए CSM, अपकेंद्रित्र और निर्धारित सतह पर तैरनेवाला absorbance के 570 संदर्भ के रूप में 630 एनएम का उपयोग कर एनएम पर मापा.
- सेल व्यवहार्य ए एस सी की ज्ञात संख्या से प्राप्त absorbance के मूल्य के सापेक्ष CSM के साथ जुड़े संख्या का निर्धारण करते हैं.
6. ए एस सी-CSM - एंबेडेड कोलेजन जेल निस्र्पक
नोट: कमरे के तापमान पर सभी प्रक्रियाओं प्रदर्शन किया गया जब तक अन्यथा नोट.
- ए एस सी भरी हुई मिक्स प्रकार 1 (7.5 मिलीग्राम / एमएल) और कोलेजन 8 Bornstein और रेशे की तरह की पद्धति के अनुसार चूहे की पूंछ कण्डरा से 2 एन NaOH उपयोग 6.8 पीएच समायोजन के बाद निकाले साथ CSM (5 मिलीग्राम 2 ≈ 10 x 4 कोशिकाओं से युक्त). 12 अच्छी तरह से थाली तंतुमय कोलेजन ए एस सी-CSM मिश्रण जोड़ें और 37 पर एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 30 मिनट के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- पूरा fibrillation के बाद, एक 5% सीओ 2 humidified इनक्यूबेटर में 14 दिनों तक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोलेजन - ए एस सी CSM जैल सेते हैं
- CSM से जेल में कोशिकाओं की रिहाई प्रवास मानक माइक्रोस्कोपी तकनीकों का उपयोग करते हुए मनाया गया.
7. प्रतिनिधि परिणाम
वर्तमान अध्ययन में, हम एक में इन विट्रो एक कोलैजेन जेल पाड़ में से chitosan microspheres (CSM) स्टेम कोशिकाओं देने की रणनीति विकसित किया है. वर्दी (व्यास में 175-225 माइक्रोन) आकार और संरचना के झरझरा CSM के लिए तैयार थे और सेल वाहक (चित्रा 2) के रूप में इस्तेमाल किया. CSM के साथ ए एस सी incubating के पर, कोशिकाओं 2 एक्स 10 CSM की 4 cells/5mg की एकाग्रता में संलग्न है. कोशिकाओं microsphere से अधिक प्रसार करने में सक्षम थे, जबकि filopodia विस्तारmicrosphere की झरझरा दरारों (चित्रा 3) में. एक बार सेल लोड CSM के कोलेजन जेल के साथ मिलाया गया, कोशिकाओं तुरंत जैल (चित्रा 4) में पलायन शुरू कर दिया.
तालिका 1 chitosan और कोलेजन की एक स्टेम सेल वितरण प्रणाली में उपयोग के लिए जैविक लाभ.
चित्रा 1. योजनाबद्ध ए एस सी CSM लोड कोलेजन scaffolds के दोहरे उपयोग के लिए समग्र रणनीति चित्रण आंकड़े 2, 3, और 4 के लिए छवियों की व्याख्या के साथ सहायता के लिए योजनाबद्ध भीतर एनोटेट कर रहे हैं.
चित्रा 2. योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व chitosan के microspheres पर स्टेम सेल के बीज बोने की क्रिया की प्रक्रिया चित्रण. procमाइक्रोन रोमकूप आकार झिल्ली संस्कृति थाली डालने ईएसएस - एक 8 में CSM के साथ सह - संवर्धन ए एस सी शामिल है. 24 घंटे के बाद, microspheres डालने से हटा रहे हैं और एक biomaterial मैट्रिक्स में embedding के लिए तैयार हैं.
चित्रा 3 ए एस सी के साथ CSM लोड morphological विशेषताओं. पैनल ए एस सी भरी हुई CSM की एक प्रकाश माइक्रोग्राफ दर्शाया गया है, जबकि पैनल बी confocal प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा प्राप्त की छवि के साथ आरोपित को देखने के एक ही क्षेत्र से पता चलता है. ए एस सी calcein AM CST (हरा) के साथ preloaded किया गया. पैनल सी उतार microsphere की एक SEM छवि की छवि को दर्शाया गया है, जबकि पैनल विकास microsphere (तारांकन) पर लोड कोशिकाओं से पता चलता है. पैनल ई में मंदिर छवि उतार microsphere के पार अनुभाग से पता चलता है. Pores और दरारों के एक भीड़ microsphere भर में स्थित हैं. पैनल एफ से पता चलता है कि कोशिकाओं के साथ एक पार sectioned microsphere (तीर) संलग्न और रचनात्मक में filopodia विस्तारफैलाया. मूल magnifications: एक और बी = 70x, सी = 500x, डी २,००० = x, ई और एफ 2500 = x.
चित्रा 4 ए एस सी की तीन आयामी कोलेजन पाड़ में CSM से प्रवासन. पैनलों ए और बी कोशिकाओं microsphere से दूर पलायन और मैट्रिक्स कोलेजन (एक तीर) 3 दिन में CSM को दर्शाती है. पैनल बी 12 दिनों के बाद एक इसी तरह की संस्कृति को दर्शाता है. संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (मंदिर) छवियों सी, डी, और सी और डी में ई. तारों में चित्रित कर रहे हैं एक microsphere कि पार sectioned microsphere (तीर) से दूर पलायन कोशिकाओं के साथ किया गया है दिखाते हैं. पैनल विकास के उच्च बढ़ाई पैनल ई में दर्शाया जाता है, और सेल कोलेजन तंतुओं (इनसेट) से जुड़ी filopodia से पता चलता है. मूल बढ़ाई: ए और बी 100x = सी और डी = 6000 x; ई 20,000 = x, इनसेट 150.000 = x.
चित्रा 5.योजनाबद्ध पुनर्योजी दवा और दवा वितरण में CSM के विशाल उपयोग चित्रण.
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Discussion
स्टेम सेल आधारित चिकित्सा में एक प्रमुख बाधा कोशिकाओं की मरम्मत के लिए निर्दिष्ट क्षेत्रों के लिए वितरण के लिए कुशल तरीके विकसित कर रहा है. रोगी परिवर्तनशीलता के लिए रोगी के कारण, प्रकार, ऊतक चोट आकार और गहराई देने स्टेम कोशिकाओं की कार्यप्रणाली एक मामले दर मामले के आधार पर निर्धारित किया जाना चाहिए. हालांकि एक मैट्रिक्स के भीतर स्टेम सेल एम्बेड और उन्हें घाव साइट को देने के लिए ऊतक इंजीनियरिंग के लिए अगले तार्किक दृष्टिकोण प्रतीत होता है, कुछ तकनीकी बाधाओं रहते हैं. यह एम्बेडेड कोशिकाओं की क्षमता मैट्रिक्स के लिए देते हैं और आसपास biocompatible है जो कोशिकाओं को देते हैं, और पैदा कर सकते हैं 9-10 anoikis से पहले एक उपयुक्त microenvironment पैर जमाने प्रदान शामिल है. इस प्रक्रिया में कोशिकाओं को उनके मैट्रिक्स remodeling मशीनरी, एक प्रक्रिया है कि दिन लेने के लिए प्रसार, प्रवास, और स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव के वांछित सेल की प्रक्रिया से पहले पूरा कर सकते हैं upregulate करने की आवश्यकता है. इन मुद्दों को दरकिनार करने के लिए, हम जएवेन्यू पूर्वलोड chitosan के microspheres पर पहले उन्हें क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत के लिए एक उपयुक्त मैट्रिक्स में एम्बेड करने के लिए स्टेम कोशिकाओं के लिए एक विधि विकसित की है. हमारे अद्वितीय ईओण पार जोड़ने microspheres तैयार तरीकों का प्रयोग, प्रोटोकॉल> microspheres की 90% तैयार करने के लिए व्यास में 175-225 माइक्रोन के भीतर होना करने में सक्षम है, इस प्रकार की कोशिकाओं के लिए एक उत्कृष्ट वाहक सूक्ष्म आकार पैदा. इससे भी महत्वपूर्ण बात, पार से जोड़ने के बाद, microspheres सकारात्मक आरोप लगाया रहते हैं, जो अत्यधिक सेल अनुलग्नक के लिए अनुकूल है. इन microsphere विशेषताओं स्टेम सेल जल्दी CSM पर की अनुमति देते हैं. एक बार जुड़ा है, इन स्टेम सेल लोड microspheres के स्थिर और पाड़ के भीतर स्थानिक ऐसे कोलेजन hydrogels के रूप में, व्यवस्था, घायल ऊतकों की नकल प्राप्त करने में सक्षम हैं. संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल CSM पर लोड ए एस सी के लिए एक नया तरीका प्रदान करता है और दिखाता है कि microspheres पर कोशिकाओं जबकि उनके स्टेम सेल phenotype के संरक्षण की ओर पलायन कर सकते हैं. झरझरा CSM के एक प्रदान वर्णितए एस सी लगाव के लिए उत्कृष्ट microenvironment और अभी भी कोशिकाओं के आसपास के मैट्रिक्स में विस्थापित करने के लिए अनुमति देते हैं.
सारांश:
महत्वपूर्ण कदम
- समान आकार की microspheres का उपयोग करें के बाद से व्यास में परिवर्तन सीधे microspheres की सेल मिलीग्राम प्रति लगाव के लिए उपलब्ध सतह क्षेत्र को प्रभावित करती है.
- संस्कृति डालने के भीतर इष्टतम कोशिकाओं के समान CSM के लिए अनुलग्नक microspheres की वर्दी बिस्तर तैयार करते हैं.
- सुनिश्चित करें कि मीडिया की मात्रा सेल संस्कृति डालने की बाहरी अच्छी तरह से अच्छी तरह से भीतर का नवचंद्रक से अधिक है. आमतौर पर, एक आंतरिक: बाहरी 1:02 की मात्रा अनुपात उचित है, क्योंकि यह कोशिकाओं को microspheres करने के लिए संलग्न की सुविधा.
- Microspheres पाड़ के भीतर समान रूप से लोड सेल बांटो. यदि ए एस सी-CSM का वितरण भी घना है, कोशिकाओं उनके microspheres से विस्थापित नहीं होगा.
- CSM और वितरित की वांछित मात्राbution घनत्व आवेदन और घायल ऊतकों क्षेत्र पर निर्भर है.
सीमाएँ
- इस विधि कुल सतह क्षेत्र की microspheres पर उपलब्ध करने के लिए सीमित है. यदि एक उच्च सेल नंबर वांछित है, और अधिक microspheres सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए आवश्यक हैं.
- प्रक्रिया कोशिकाओं preformed microspheres पर वरीयता प्राप्त और सेल encapsulation के प्रयोजनों के लिए इरादा नहीं है की अनुमति देता है.
- chitosan इस प्रक्रिया में विकसित की microspheres लंगर निर्भर कक्षों को समर्थन लेकिन नहीं अन्य प्रकार की कोशिकाओं कर सकते हैं.
- और का उपयोग कर विलायक कार्बनिक यह सक्रिय चिकित्सकीय moieties उपर्युक्त हालत कमजोर नहीं की अनुमति नहीं है बरामद: के बाद से chitosan के microspheres 0.5m एसिटिक एसिड समाधान, एक तेल मिश्रण (n-octanol सोया तेल) में emulsified का उपयोग कर विकसित कर रहे हैं.
- CSM के मुख्य रूप से अपने तेज गिरावट के कारण कोशिकाओं / कम समय अवधि (5-10 दिन) में दवाओं देने का इरादा कर रहे हैंदर, लंबी अवधि की उपलब्धता के लिए करना उन लोगों के विपरीत.
संभव संशोधन और बहुमुखी प्रतिभा (चित्रा 5)
- Microsphere आकार कुल सतह क्षेत्र में परिवर्तन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, microsphere आकार सतह क्षेत्र / CSM के मिलीग्राम, जो बारी में कुल सतह क्षेत्र और कोशिकाओं कि microspheres करने के लिए संलग्न कर सकते हैं की संख्या को बढ़ाने के, microsphere प्रति बढ़ा सेल भार में जिसके परिणामस्वरूप जाएगा बढ़ाने के लिए कम किया जा सकता है.
- Chitosan microspheres के अन्य प्रकार की कोशिकाओं (endothelial कोशिकाओं, pericytes, तंतुप्रसू, आदि) को लोड करने के लिए एक कैरियर के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है.
- कक्ष लोड क्षेत्रों (या तो एकल या एकाधिक कक्ष प्रकार) scaffolds के विशिष्ट स्थानों के भीतर एम्बेडेड जा सकता है. इस रणनीति ऊतक उत्थान के लिए multicellular ऊतक इंजीनियर scaffolds के निर्माण में मदद मिलेगी.
- सेल वितरण के अलावा, microspheres भी चिकित्सकीय दवाओं देने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, वृद्धि कारक है, भेदभाव inducers, और / या एंटीबायोटिक दवाओं). इन दवा भरी हुई microspheres भी सेल लोड microspheres के साथ संयोजन में एक पाड़ के भीतर हो सकता है इस्तेमाल किया जा करने के लिए चिकित्सा और उत्थान की प्रक्रिया को बढ़ाने.
समस्या निवारण
- पर CSM तैयारी, अगर आकार में एक बड़ा बदलाव होता है, तो मदों की एक संख्या में वांछित CSM के 11 आकार उपज समायोजित किया जा सकता है.
- Chitosan के समाधान की चिपचिपाहट. हौसले से तैयार स्टॉक लगातार चिपचिपापन के तहत बैच बैच तैयारी से समाधान रखने के लिए पसंद है
- Surfactant की मात्रा समायोजित (80 अवधि) के पायस तैयार किया है.
- सुनिश्चित करें कि भूमि के ऊपर दोषी की गति इस प्रक्रिया के दौरान स्थिर रहता है (गति बिजली उतार चढ़ाव के साथ भिन्न हो सकते हैं
- के दौरान प्रदान वायुमंडलीय हवा सरगर्मी अशांति और आकार में भिन्नता का कारण हो सकता है (इस के द्वारा से बचा जा सकता हैep के तरल तरंग है, जो उपरि दोषी की ब्लेड पर सरगर्मी के दौरान रूपों.
- Microspheres की इष्टतम सेल लोड हो रहा है सुनिश्चित करने के लिए, एक उष्मापन संबंधी MTT परख प्रदर्शन किया जा सकता है. यह व्यवहार्य कोशिकाओं की अनुमानित संख्या microspheres की मिलीग्राम प्रति लोड दे देंगे.
- सेल संस्कृति मीडिया की एक छोटी मात्रा में उन्हें निलंबित करके सेल लोड microspheres के उन्हें एक एक कोलेजन hydrogel जैसे पाड़ भीतर मिश्रण से पहले रोकने.
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Disclosures
कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों मौजूद हैं.
अस्वीकरण
राय या दावे को समाहित इस के साथ साथ लेखक के निजी विचार हैं और अधिकारी के रूप में या रक्षा या अमेरिकी सरकार के विभाग के विचारों को दर्शाती है यह अर्थ लगाया जा नहीं रहे हैं. लेखकों अमेरिकी सरकार के कर्मचारी हैं, और यह काम उनके सरकारी कर्तव्यों के भाग के रूप में तैयार किया गया था. सभी काम अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान द्वारा समर्थित किया गया. इस अध्ययन की समीक्षा की और अमेरिकी सेना चिकित्सा अनुसंधान और materiel कमान संस्थागत समीक्षा बोर्ड, और अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार के द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के तहत आयोजित किया गया.
Acknowledgments
DOZ जिनेवा फाउंडेशन से सम्मानित किया गया अनुदान द्वारा समर्थित है. एस.एन. पिट्सबर्ग ऊतक इंजीनियरिंग पहल से एक Postdoctoral फैलोशिप अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hanks BalancedSalt Solution (HBSS) | GIBCO, by Life Technologies | 14175 | Consumable |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30071.03 | Consumable |
| Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6685 | Consumable |
| 70-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352350 | Consumable |
| 100-μm nylon mesh filter | BD Biosciences | 352360 | Consumable |
| MesenPRO Growth Medium System | Invitrogen | 12746-012 | Consumable |
| L-glutamine | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | Consumable |
| T75 Tissue Culture Flask | BD Biosciences | 137787 | Consumable |
| Chitosan | Sigma-Aldrich | 448869 | Consumable |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Consumable |
| N-Octanol | Acros Organics | 150630025 | Consumable |
| Sorbitan-Mono-oleate | Sigma-Aldrich | S6760 | Consumable |
| Potassium Hydroxide | Sigma-Aldrich | P1767 | Consumable |
| Acetone | Fisher Scientific | L-4859 | Consumable |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 270741 | Consumable |
| Trinitro Benzenesulfonic Acid | Sigma-Aldrich | P2297 | Consumable |
| Hydrochloric Acid | Sigma-Aldrich | 320331 | Consumable |
| Ethyl Ether | Sigma-Aldrich | 472-484 | Consumable |
| 8-μm Tissue Culture Plate Inserts | BD Biosciences | 353097 | Consumable |
| 1.5-ml Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | Consumable |
| MTT Reagent | Invitrogen | M6494 | Consumable |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8779 | Consumable |
| Qtracker Cell Labeling Kit (Q tracker 655) | Molecular Probes, Life Technologies | Q2502PMP | Consumable |
| Type 1 Collagen | Travigen | 3447-020-01 | Consumable |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | Consumable |
| 12-Well Tissue Culture Plates | BD Biosciences | 353043 | Consumable |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | Equipment |
| Orbital Shaker | New Brunswick Scienctific | C24 | Equipment |
| Humidified Incubator with Air-5% CO2 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | Model 370 | Equipment |
| Overhead Stirrer | IKA | Visc6000 | Equipment |
| Magnetic Stirrer | Corning | PC-210 | Equipment |
| Vacuum Desiccator | - | - | Equipment |
| Particle Size Analyzer | Malvern Instruments | STP2000 Spraytec | Equipment |
| Water Bath | Fisher Scientific | Isotemp210 | Equipment |
| Spectrophotometer | Beckman Coulter Inc. | Beckman Coulter DU800UV/Visible Spectrophotometer | Equipment |
| Vortex | Diagger | 3030a | Equipment |
| Microplate Reader | Molecular Devices | SpectraMax M2 | Equipment |
| Light/Fluorescence Microscope | Olympus Corporation | IX71 | Equipment |
| Confocal Microscope | Olympus Corporation | FV-500 Laser Scanning Confocal Microscope | Equipment |
| Scanning Electron Microscope | Carl Zeiss, Inc. | Leo 435 VP | Equipment |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEOL 1230 | Equipment |
References
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