Summary
Vi beskriver en metod för att villkorligt knockdown uttrycket av ett målprotein vid vuxen zebrafisk fena regenerering. Denna teknik innebär att mikro-injektion och elektroporera morpholinos Antisensoligonukleotid i fin vävnad, vilket gör att testa proteinets roll i olika stadier av fin förnyelse, inklusive sårläkning, blastema bildning, och regenerativ utväxt.
Abstract
Vissa arter av urodeles och teleost fisk kan regenerera sina vävnader. Zebrafisk har blivit en allmänt använd modell för att studera den spontana regenerering av vuxna vävnader, såsom hjärta 1, näthinnan 2, ryggmärg 3, synnerven 4, sensoriska hörselceller 5, och fenor 6.
Zebrafisk fena är en relativt enkel bihang som lätt manipuleras för att studera flera steg i epimorphic regenerering. Klassiskt, var fin förnyelse präglas av tre olika steg: sårläkning, blastema formation och fin utväxt. Efter amputering del av fenan, prolifererar omgivande epitel-och migrerar över såret. Vid 33 ° C, sker denna process i sex timmar efter amputation (HPA, figur 1B) 6,7. Därefter underliggande celler från olika linjer (ex. ben, blod, glia, fibroblast) tillbaka in i cellcykeln för att bilda en proliferativ blastema, wedan den överliggande epidermis fortsätter att föröka sig (figur 1D) 8. Utväxt inträffar som celler proximalt till blastema åter differentiera till sina respektive linjerna för att bilda ny vävnad (fig 1E) 8. Beroende på nivån på amputation, är fullt regenerering klar i en vecka till en månad.
Uttrycket av ett stort antal genfamiljer, inklusive Wnt, HOX, FGF, MSX, retinoinsyra, Shh, Notch, bmp, och aktivin-beta A gener, är upp-regleras under olika etapperna i fin förnyelse 9-16. Emellertid har de roller för dessa gener och deras kodade proteiner under regenerering varit svårt att bedöma, om inte en specifik inhibitor för proteinet existerar 13, en temperaturkänslig mutant föreligger eller ett transgent djur (antingen som överuttrycker vildtyp-protein eller en dominerande -negativ protein) genererades 7,12. Vi utvecklatPED en omvänd genetisk teknik för att snabbt och enkelt testa funktionen av varje gen under fin regeneration.
Morfolino oligonukleotider används ofta för att studera förlust av specifika proteiner under zebrafisk, Xenopus, kyckling och mus utveckling 17-19. Morpholinos baspar med en komplementär RNA-sekvens till antingen blocket pre-mRNA-splitsning eller mRNA-translation. Vi beskriver ett förfarande för att effektivt införa fluorescein-märkt antisens morpholinos i regenererande zebrafisk fenor till knockdown uttryck av målproteinet. Den morfolino är mikroinjicerades in i varje blastema av den regenererande zebrafisk stjärtfenan och elektroporerades in i de omgivande cellerna. Fluorescein ger laddning till elektroporera att morfolino och visualisera morfolino i fin vävnad.
Detta protokoll möjliggör villkorligt protein knockdown att undersöka vilken roll specifika proteiner under regenerativ fin utväxt. I Discussion, beskriver vi hur denna metod kan anpassas för att studera betydelsen av specifika proteiner under sårläkning eller blastema bildning, samt en potentiell markör för cellmigration under blastema bildning.
Protocol
1. Återsuspendera morfolino
- Späd 300 nM fluorescein-märkt morfolino i 100 | il av nukleas-fritt vatten för att göra en approximativt 3 mM lösning. Den morfolino Lösningen uppdelades i alikvoter i flera paraffin-förseglade mikrocentrifugrör och förvarades vid rumstemperatur och skyddat från ljus.
- Att bestämma den exakta morfolino koncentration, utspädd 5 pl morfolino-lösning (eller vatten som blank) i 95 | il av 0,1 N HCl. Ställ en baseline på en spektrofotometer vid 265 nm med vatten tomt och sedan bestämma läsningen av den utspädda morfolino lösningen. Multiplicera morfolino absorbansen genom sin bestäms konstant och med spädningsfaktorn för att bestämma koncentrationen i ng / il. Den morfolino konstanta beräknas som:
Morfolino konstant = molekylvikten för morfolino X 1000/molar absorbans.
Molekylvikten och molförhållandet absorbans för morfolino kan hittas på "Oligo Egenskaper "ark medföljer produkten. Dela morfolino koncentrationen i ng / l, av molekylvikten för att bestämma koncentrationen i mM. Späd morfolino, om nödvändigt, till en fungerande koncentration, normalt 1,2 mM.
2. Fin Amputation
- Bedöva vuxna zebrafisk i antingen trikain eller 2-fenoxietanol med 1,0 mg / ml i tanken vatten.
- Amputera fenan med en steril skalpell eller rakblad proximalt den första lepidotrichial förgreningspunkt. Detta bör göras på samma proximala / distala plats på varje djur (t.ex. 7 beniga segment distalt från fin gördel). VIKTIGT: se till att klippa helt vinkelrätt mot främre / bakre plan djuret. Vinklade skär kommer att resultera i ojämn fena utväxt av den dorsala och den ventrala halvorna av fenan.
- Återgå fisken till en tank. Vi typiskt bibehålla fisk vid 33 ° C för att öka regenerationen hastighet. Beroende på experimentell design, wAIT 0-2 dagar efter amputation (DPA) i FIN regeneration att börja innan införandet av morfolino. Alternativa tillvägagångssätt diskuteras i Diskussion, nedan.
3. Morfolino Injektion
- Dagen före injicering av morfolino, gör en injektion platta (figur 2). Se till att skära ut ett spår i den ena änden av en brunn, vilken hjälper till att stabilisera fisk för mikroinjektion förfarandet.
- Vid 2 DPA, förbereder mikroinjektion apparat och morfolino lösning.
- Späd fluorescein-märkta morfolino till rätt koncentration (rekommenderar att börja med 1,2 mM) och placera i en 65 ° C vattenbad under 5 minuter.
- Dra ut glaset nålen för mikro-injektion med en nål avdragare.
- Ladda nålen med morfolino (obs: beroende på om du back-fyllning eller front-ladda din nål kommer att avgöra om du laddar nålen först, eller skära spetsen först).
- Klipp av spetsen in nålen in vinkel.
- Följ anvisningarna i din mikro-insprutningssystemet att injicera en ca 5 nl bubbla av morfolino per injektion. Större volymer av morfolino kan störa vävnaden.
- Bedöva fisken och lägg på injektion plattan. Avlägsna all överskottsvätska och orientera nålen till det lämpliga läget, just distalt till den beniga strålen (fig 3). Användning av ett mikroskop och mikroinjektion anordning lämplig för morfolino injektioner (se tabell av specifika reagensen), sprutas in i morfolino fenan från anterior till posterior, såsom visas i figur 3. Injicering från bakre till främre bringar flänsen vävnaden att rulla upp under injektionen och är mycket svår.
- Stick in nålen försiktigt i regenerativ vävnad, precis distalt till varje beniga ray (märkt "1" i figur 3) och tryck distalt fram ligger i blastema (märkt "2" i figur 3). Var noga med att inte trycka nålen genom endäck fin. När nålen är korrekt lokaliserad, injicera morfolino (dvs. klicka en gång). Vid 1,2 mM, visas fluorescein-märkta morfolino lösningen gul-grön, även under normala ljusförhållanden. Med varje injektion kan en gul "puff" av morfolino lösning vara visualiseras, som hjälper lokalisera injektion i blastema. Cirka 75 nl (10-15 klick) av morfolino lösningen ska injiceras per beniga ray. Paus ~ 1 sek mellan klick. Vi injicera bara den dorsala sidan, med den ventrala som elektroporering endast kontroll. Alternativt skulle man kunna upprepa hela proceduren med en kontroll morfolino på den ventrala delen av fenan.
4. Elektroporering av den morfolino
- Omedelbart efter insprutningen av morfolino, avlägsna injektion plattan från mikroinjektion apparat. Fyll injektionen plattan väl med anestesi lösningen tills fisken är nedsänkt. Den elektroporation utförs under vattenlinjen. <li> A 3 mm i diameter platinaplåt pincettdelen elektrod (Cuy 650-P3 pincett, Protech International) lokaliserar de pulser till approximativt hälften av fenan. Var noga med att inte vidröra elektroderna till fenan vävnaden. För att säkerställa att elektroderna inte vidrör fenan vävnaden, roterar fisken på dess ryggsidan och titta rakt nedåt mittlinjen för elektroporering.
- Elektroporera både dorsala och ventrala (med kontroll för en icke-specifika effekter elektroporering) sidorna av flänsen med användning av en CUY21 fyrkantsvåg elektroporator (Protech International, Inc.). Torka elektroderna med en fuktig Kimwipe efter varje elektroporering för att avlägsna eventuella bubblor som kan ha bildats. Om de inte tas bort, en mini-charge bygger upp, vilket kommer att locka vävnaden mot elektroden. De elektroporering parametrar bör sättas till tio på varandra följande 50 ms pulser, vid 15 V med en 1 sek paus mellan pulser.
- Lägg fisken på en glasskiva eller en petriskål och snabbt image fenan och se till nOTE den dorsala / ventrala orientering. Denna bild kommer att användas för återväxten analys på följande dag. Återgå fisken till tanken.
5. Analys
- Om den riktade protein som slogs i uttryck krävs för korrekt fena regenerering, bör en dramatisk skillnad mellan den dorsala och den ventrala halvorna av fenan vara uppenbart 1 dag efter elektroporering (figur 5B).
- Vid 3 DPA, ta en annan bild av fenan för varje fisk och matcha upp denna bild med motsvarande 2 DPA bild (figur 5B). Den naturliga variationen i fenan pigmentering mönstret mellan djur gör att du kan korrekt identifiera enskilda fiskar.
- Med användning av NIH Image, spåra 2 DPA och 3 dPa områden av både dorsala och ventrala halvor (figur 5B).
- För att bestämma% området dorsal jämfört ventrala Använd följande formel: (dorsala 3dpa - Mjukstrålar 2dpa) / (ventrala 3dpa - Ventrala 2dpa) X 100 =% area
6. Representativa resultat
- Vi analys alltid för fin utväxt på 3 DPA, eller 24 HPE (timmar efter elektroporering). Vid denna tidpunkt bör den fluorescein-märkta morfolino vara närvarande i den dorsala delen av fenan (Supplemental Figur 1 och Figur 6A). Det är normalt att se några avslutande ner till nivå amputation.
- Det bör inte finnas någon skillnad mellan den dorsala och den ventrala sidan i fenan injiceras och elektroporerades med kontrollgruppen morpholinos (figur 6B).
- Om den experimentella morfolino riktar en väsentlig protein för fenan utväxt, bör en dramatisk skillnad mellan den dorsala och den ventrala sidan observeras (Figur 6C).
- Om elektroden rörde fenan under elektroporering kommer vävnaden visas bruna (nästan brunnit i utseende) och nekrotisk.
"Src =" / files/ftp_upload/3632/3632fig1.jpg "/>
Figur 1. Schematisk av de olika händelser som inträffar under fin regeneration. De underliggande gånger för varje händelse ges i timmar efter amputation (HPA) och motsvarar en tank temperatur av 33 ° C.
Figur 2. A. Schema över injektion plattan, som är tillverkad av agaros och innehåller en liten brunn för att hålla fisken under mikroinjektion av morfolino.
Figur 3. Schematisk i morfolino mikroinjektion. A. Placera fisken i skålen med huvudet av fisken i spåret skär ur brunnen, som kommer att hjälpa fisken att förbli. B. Vid låg förstoring ordna nålen så att den ligger nära den regenererande vävnaden av fenan. C.
Figur 4. Schematisk FIN elektroporation. A. Efter mikroinjektion, placera fisken i en petriskål fylld av anestesi och elektroporera både dorsala och ventrala halvor. B. Se till att inte röra fenan vävnaden. Elektroderna placeras ~ 1 mm från vävnaden.
Figur 6. Exempel på förväntadresultat. A. Fluorescerande bilder som visar en fluorescein-märkt kontroll morfolino i den dorsala delen av fenan, 24 timmar efter elektroporering (HPE). B. Brightfield bild av en fena som injicerades och elektroporerades med en kontroll morfolino i dorsala halv . Bilden visar samma återtillväxt av både dorsala och ventrala halvor av en fena, 24 HPE. C. Brightfield bild av en fena som injicerades och elektroporerades med en experimentell morfolino i dorsal halv. Bilden visar inhiberingen av återväxt på den dorsala / injicerade sidan. Linjen visar hur mycket återväxten vid 2 DPA, omedelbart före morfolino injektion och elektroporation.
Figur 7. Schematisk av en alternativ injektion och elektroporering förfarande för målproteiner involverade i sårläkning och blastema bildning. A. Injicera morfolinomellan varje ben fenstråle på den dorsala delen av fenan. B. elektroporera den morfolino som vanligt. C. amputera fenan omedelbart proximalt (~ 1 beniga segmentet) till injektionsstället. D. fluorescein-märkta morfolino kan observeras i såret epitel och blastema vid 24 HPE.
Figur 8. Användning av den teknik för att rikta såret epitel och blastema bildning. A. Brightfield bild av en fena vid 24 hPa som injicerades och elektroporerades med en kontroll morfolino omedelbart före amputation. B. Fluorescerande bild av fenan som visas i panel A. Notera att den injicerade dorsala delen av fenan visar god upptag av morfolino i regenerativ vävnad. C -. C "Högre förstoring av den dorsala delen av fenan som visas i fälten A och B. Injektionsställena är ofta fortfarande synliga (pilhuvuden), Men många målinriktade cellerna har migrerat att delta i såret epitel och blastema formation (pil).
Figur 9. Användning av den teknik till målceller som migrerar för att bilda den blastema. A. Fluorescerande och brightfield innanförliggande bilder som visar en fena injiceras och elektroporerades med morfolino på båda de dorsala och ventrala delar. Fenan sedan amputerades vid två plan. Den dorsala halv skars omedelbart distalt om injektionsstället, där som den ventrala halv klipptes 9-10 beniga segment distalt om injektionsstället. Vid 24 hpa B., de fluorescerande och brightfield infällda bilder visar att morfolino har övergått till dorsala regenerera (1), men inte den ventrala regenerera (2), vilket indikerar att endast cellen omedelbart proximalt i förhållande till den skurna området delta i bildningen blastema. De två uppsättningarna av vita pilspetsar visar för varje amputationplan. Panelerna märkta 1 och 2 längst till höger i bilden visar en större förstoring av den dorsala och den ventrala halvorna av fenan, respektive.
Supplementär Figur 1. En video av en konfokal z-stapel av en region som motsvarar placeringen av en blastema i en fena injiceras och elektroporerades med en kontroll morfolino. Bilden togs vid 24 HPE. Eftersom en enda fluorescein molekyl inte kan visualiseras, kan inte all morfolino visualiseras eller kvantifieras. Men dessa bilder ger en uppfattning om de olika grader av upptag som kan visualiseras i celler, från enskilda punktata prickar, till hela celler fulla av fluorescerande morfolino. På stillbild, är den orientering som visas. Skala bar: 25 mikrometer.
Discussion
Här beskriver vi en kraftfull förlust av funktionen förhållningssätt till villkorligt knockdown proteiner av intresse under fin regeneration i vuxen zebrafisk. Denna teknik har använts för att studera gener gap junction, signalering receptorer, transkriptionsfaktorer och mikroRNA under regenerativ fena utväxt 16, 20-22.
Vi förväntar oss att denna teknik också kan användas för att studera gener som krävs för sårläkning och blastema bildning genom att anpassa tekniken. Till exempel, injicerade vi och elektroporerades en kontroll morfolino i utrymmet mellan de beniga fenan strålar på den dorsala delen av fenan före amputation (Figur 7). Vi amputerade sedan fenan omedelbart distalt om injektionen planet. 24 hPa, observerade vi att morfolino riktade celler hade migrerat distalt att bilda både såret epitelet och blastema (Figur 8), vilket indikerar att celler under dessa tidiga stadier av förnyelse kan också Targeted.
Tekniken har några anmärkningsvärda begränsningar. Till exempel, kvarstår fluorescens från fluorescein taggen inte efter fixering och bearbetning för immunohistokemi, vilket gör det omöjligt att korrelera en särskild cellulär fenotyp (dvs cell-proliferation) med mängden av morfolino närvarande i en cell. Dessutom har vi inte kunnat att konsekvent uppnå den elektroporering av plasmider in i regenerering stjärtfenan, fastän en föregående grupp rapporterade om den framgångsrika elektroporering av DNA i vävnaden fena 23. Slutligen har vi noterat att morfolino är bara effektivt under cirka 48 timmar efter elektroporation 21, som förbjuder användning av denna teknik i sin nuvarande form för att testa gener som är involverade i differentieringen av nya celltyper. Ytterligare tester och modifiering av förfarandet kan övervinna dessa nuvarande begränsningar.
Dessutom är det möjligt att denna teknik skulle kunna användasatt testa proteiner involverade i cellmigration från den underliggande vävnaden till blastema. Till exempel, injicerade vi och elektroporerades en kontroll morfolino i båda sidorna av flänsen (såsom beskrivits i figur 7) före amputation. Vi amputerade sedan dorsala delen av fenan omedelbart distalt om injektionen planet och vi amputerade den ventrala fenan mycket mer distalt. Vid 24 hPa, hade morfolino-positiva celler på ryggsidan migrerat från injektionsstället till överliggande såret epitel och blastema. Men det var inte fallet på den ventrala sidan (Figur 9). Detta stödjer tanken att endast de celler som ligger till grund för amputation planet delta i den regenerativa svar. Dessa data tyder också på att proteiner hypotes att krävas för cellmigration kan testas med användning av denna teknik.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Freimann Life Science Center och Center for Zebrafish forskning personal för deras vård och underhåll av zebrafisk.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Micro-injection pump | World Precision Instruments, Inc. | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
| Micro-manipulator | World Precision Instruments, Inc. | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
| Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
| Needle holder | World Precision Instruments, Inc. | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
| Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |
References
- Poss, K. D. Getting to the heart of regeneration in zebrafish. Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).
- Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J. Neurobiol. 44, 289-307 (2000).
- Becker, T., Wullimann, M. F., Becker, C. G., Bernhardt, R. R., Schachner, M. Axonal regrowth after spinal cord transection in adult zebrafish. J. Comp. Neurol. 377, 577-595 (1997).
- Becker, C. G., Becker, T. Repellent guidance of regenerating optic axons by chondroitin sulfate glycosaminoglycans in zebrafish. J. Neurosci. 22, 842-853 (2002).
- Lopez-Schier, H., Hudspeth, A. J. A two-step mechanism underlies the planar polarization of regenerating sensory hair cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 18615-1820 (2006).
- Johnson, S. L., Weston, J. A. Temperature-sensitive mutations that cause stage-specific defects in Zebrafish fin regeneration. Genetics. 141, 1583-1595 (1995).
- Nechiporuk, A., Poss, K. D., Johnson, S. L., Keating, M. T. Positional cloning of a temperature-sensitive mutant emmental reveals a role for sly1 during cell proliferation in zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 258, 291-306 (2003).
- Tu, S., Johnson, S. L. Fate restriction in the growing and regenerating zebrafish fin. Dev. Cell. 20, 725-732 (2011).
- Geraudie, J., Ferretti, P. Correlation between RA-induced apoptosis and patterning defects in regenerating fins and limbs. Int. J. Dev. Biol. 41, 529-532 (1997).
- Jazwinska, A., Badakov, R., Keating, M. T. Activin-betaA signaling is required for zebrafish fin regeneration. Curr. Biol. 17, 1390-1395 (2007).
- Laforest, L., Brown, C. W., Poleo, G., Geraudie, J., Tada, M., Ekker, M., Akimenko, M. A. Involvement of the sonic hedgehog, patched 1 and bmp2 genes in patterning of the zebrafish dermal fin rays. Development. 125, 4175-4178 (1998).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Poss, K. D., Shen, J., Nechiporuk, A., McMahon, G., Thisse, B., Thisse, C., Keating, M. T. Roles for Fgf signaling during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 222, 347-358 (2000).
- Raya, A., Koth, C. M., Buscher, D., Kawakami, Y., Itoh, T., Raya, R. M., Sternik, G., Tsai, H. J., Rodriguez-Esteban, C., Izpisua-Belmonte, J. C. Activation of Notch signaling pathway precedes heart regeneration in zebrafish. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 11889-11895 (2003).
- Smith, A., Avaron, F., Guay, D., Padhi, B. K., Akimenko, M. A. Inhibition of BMP signaling during zebrafish fin regeneration disrupts fin growth and scleroblasts differentiation and function. Dev Biol. 299, 438-454 (2006).
- Thummel, R., Li, L., Tanase, C., Sarras, M. P., Godwin, A. R. Differences in expression pattern and function between zebrafish hoxc13 orthologs: recruitment of Hoxc13b into an early embryonic role. Dev. Biol. 274, 318-333 (2004).
- Coonrod, S. A., Bolling, L. C., Wright, P. W., Visconti, P. E., Herr, J. C. A morpholino phenocopy of the mouse mos mutation. Genesis. 30, 198-200 (2001).
- Heasman, J., Kofron, M., Wylie, C. Beta-catenin signaling activity dissected in the early Xenopus embryo: a novel antisense approach. Dev. Biol. 222, 124-134 (2000).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene knockdown in zebrafish. Nat. Genet. 26, 216-2120 (2000).
- Hoptak-Solga, A. D., Nielsen, S., Jain, I., Thummel, R., Hyde, D. R., Iovine, M. K. Connexin43 (GJA1) is required in the population of dividing cells during fin regeneration. Dev. Biol. 317, 541-548 (2008).
- Thummel, R., Bai, S., Sarras, M. P., Song, P., McDermott, J., Brewer, J., Perry, M., Zhang, X., Hyde, D. R., Godwin, A. R. Inhibition of zebrafish fin regeneration using in vivo electroporation of morpholinos against fgfr1 and msxb. Dev. Dyn. 235, 336-346 (2006).
- Yin, V. P., Thomson, J. M., Thummel, R., Hyde, D. R., Hammond, S. M., Poss, K. D. Fgf-dependent depletion of microRNA-133 promotes appendage regeneration in zebrafish. Genes Dev. 22, 728-733 (2008).
- Tawk, M., Tuil, D., Torrente, Y., Vriz, S., Paulin, D. High-efficiency gene transfer into adult fish: a new tool to study fin regeneration. Genesis. 32, 27-31 (2002).
