Summary
Nous décrivons une méthode pour conditionnellement knockdown l'expression d'une protéine cible lors de la régénération du poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique consiste à micro-injection et électroporation morpholinos oligonucléotide antisens dans le tissu fin, ce qui permet de tester le rôle de la protéine à différents stades de la régénération des nageoires, y compris la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l'excroissance de régénération.
Abstract
Certaines espèces de poissons téléostéens et les urodèles peuvent régénérer leurs tissus. Le poisson zèbre sont devenus un modèle largement utilisé pour étudier la régénération spontanée des tissus adultes, tels que le coeur 1, de la rétine 2, la moelle épinière 3, nerf optique 4, les cellules ciliées sensorielles 5, 6 et les nageoires.
La nageoire du poisson zèbre est un appendice relativement simple qui est facile à manipuler pour étudier plusieurs étapes dans la régénération epimorphic. Classiquement, la régénération fin a été caractérisée par trois étapes distinctes: la cicatrisation des plaies, de la formation blastème, et l'excroissance fin. Après l'amputation partie de l'aileron, l'épithélium environnant prolifère et migre sur la plaie. A 33 ° C, ce processus se produit dans les six heures après l'amputation (hpa, figure 1B) 6,7. Ensuite, les cellules sous-jacentes de différentes lignées (ex. os, sang, cellules gliales, des fibroblastes) ré-entrer dans le cycle cellulaire pour former un blastème proliférative, wien que l'épiderme sus-jacent continue à proliférer (figure 1D) 8. Excroissance se produit en tant que cellules proximales à la ré-blastème se différencier en lignées leurs respectives pour former de nouveaux tissus (figure 1E) 8. Selon le niveau de l'amputation, la régénération complète est achevée en une semaine à un mois.
L'expression d'un grand nombre de familles de gènes, y compris wnt, Hox, FGF, msx, l'acide rétinoïque, chut, cran, bmp, et l'activine-bêta A gènes, est régulée à la hausse au cours des étapes spécifiques de la nageoire de régénération 9-16. Cependant, les rôles de ces gènes et leurs protéines codées en cours de régénération ont été difficiles à évaluer, à moins d'un inhibiteur spécifique de la protéine existe 13, un mutant sensible à la température existe ou un animal transgénique (soit surexprimant la protéine de type sauvage ou une position dominante négatif protéine) a été généré 7,12. Nous déveped une technique de génétique inverse à rapidement et facilement tester le fonctionnement de n'importe quel gène lors de la régénération fin.
Oligonucléotides morpholino sont largement utilisés pour étudier la perte de protéines spécifiques au cours du poisson zèbre, le xénope, poulet, et le développement de la souris 17-19. Paires de bases morpholinos avec une séquence d'ARN complémentaire l'une de bloc de pré-ARNm épissage ou de traduction d'ARNm. Nous décrivons une méthode pour introduire efficacement à la fluorescéine étiqueté antisens morpholinos en nageoires de poisson zèbre à l'expression de régénération inactivation de la protéine cible. Le morpholino est micro-injecté dans chaque blastème de régénération de la nageoire du poisson zèbre et la queue par électroporation dans les cellules environnantes. Fluorescéine fournit la charge pour électroporer la morpholino et de visualiser le morpholino dans le tissu fin.
Ce protocole permet knockdown protéines conditionnelle d'examiner le rôle des protéines spécifiques au cours de l'excroissance fin de régénération. Dans le Discussion, nous décrivons comment cette approche peut être adapté pour étudier le rôle des protéines spécifiques lors de la cicatrisation ou de la formation blastème, ainsi que d'un marqueur potentiel de la migration cellulaire lors de la formation blastème.
Protocol
1. Resuspendre morpholino
- Diluer 300 nM de fluorescéine-étiqueté morpholino dans 100 ul de nucléase-free eau pour faire une solution d'environ 3 mm. La solution est répartie dans des morpholino plusieurs microtubes paraffine scellés et entreposés à température ambiante et loin de la lumière.
- Pour déterminer la concentration exacte morpholino, diluer 5 pi de solution de morpholino (ou de l'eau comme une vierge) dans 95 ul de 0,1 N HCl. Fixer une référence sur un spectrophotomètre à 265 nm avec le blanc de l'eau et de déterminer ensuite la lecture de la solution diluée morpholino. Multiplier l'absorbance morpholino par sa constante déterminée et par le facteur de dilution pour déterminer la concentration en ng / ul. La constante est morpholino calculé comme suit:
Morpholino constante = poids moléculaire de l'absorbance X morpholino 1000/molar.
Le poids moléculaire et l'absorbance molaire pour le morpholino peuvent être trouvées sur le "Oligo Properties "feuille fournie avec le produit. Diviser la concentration morpholino, en ng / ul, par le poids moléculaire pour déterminer la concentration en mM. Diluer le morpholino, si nécessaire, à une concentration de travail, généralement 1,2 mM.
2. Amputation de la nageoire
- Anesthésier poisson zèbre adulte soit tricaïne ou 2-phénoxyéthanol à 1,0 mg / ml dans l'eau du réservoir.
- L'amputation de la nageoire à l'aide d'une lame de rasoir ou un scalpel stérile proximale du premier point de branchement lepidotrichial. Cela devrait être fait à la même proximale / distale emplacement sur chaque animal (par exemple 7 segments osseux distaux de la ceinture fin). IMPORTANT: assurez-vous de couper parfaitement perpendiculaire au plan antérieur / postérieure de l'animal. Coupes en biais se traduira dans l'expansion de la nageoire inégale des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire.
- Retournez le poisson dans un réservoir. En général, nous maintenir le poisson à 33 ° C pour augmenter le taux de régénération. Selon la conception expérimentale, wACI 0-2 jours après l'amputation (dpa) pour la régénération des nageoires et commencer avant l'introduction de la morpholino. D'autres approches sont abordées dans la discussion, ci-dessous.
3. Morpholino injection
- Le jour avant l'injection du morpholino, faire une plaque d'injection (figure 2). Assurez-vous de découper une encoche à une extrémité du puits, qui aide à stabiliser le poisson pour la procédure de microinjection.
- A 2 dpa, préparer l'appareil d'injection de micro-et la solution morpholino.
- Diluer la fluorescéine-étiqueté morpholino à la concentration appropriée (vous recommandons de commencer avec 1,2 mM) et placer dans un bain à 65 ° C l'eau, pendant 5 minutes.
- Retirez l'aiguille de verre pour l'injection de micro-aiguilles aide d'un extracteur.
- Chargez l'aiguille avec le morpholino (note: selon que vous sauvegardez le remplissage ou l'avant-charger votre aiguille de déterminer si vous chargez la première aiguille, ou de couper la pointe en premier).
- Coupez la pointe de l'aiguille à uneangle n.
- Suivez les instructions de votre système d'injection de micro-injecter une bulle d'environ 5 nl de morpholino par injection. Les volumes plus importants de morpholino pourrait perturber le tissu.
- Anesthésier le poisson et les déposer sur la plaque d'injection. Retirez tous les excès de liquide et d'orienter l'aiguille à l'emplacement approprié, juste en aval de la raie osseuse (figure 3). En utilisant un microscope et un appareil approprié pour la micro-injection morpholino injections (voir le tableau des réactifs spécifiques), injecter le morpholino dans la nageoire d'avant en arrière, comme le montre la figure 3. L'injection d'arrière en avant provoque le tissu fin de retrousser lors de l'injection et il est très difficile.
- Insérez l'aiguille doucement dans le tissu régénératrice, juste en aval de chaque rayon osseux (marqué "1" dans la figure 3) et poussez jusqu'à ce que distalement situé dans le blastème (marqué «2» à la figure 3). Soyez prudent de ne pas pousser l'aiguille à travers la sallefin des pneus. Lorsque l'aiguille est correctement localisée, injecter le morpholino (c.-à-cliquer une fois). A 1,2 mM, la solution de fluorescéine-étiqueté morpholino apparaît jaune-vert, même dans des conditions d'éclairage normales. Avec chaque injection, d'un jaune "bouffée" de la solution morpholino peuvent être visualisées, ce qui permet de localiser l'injection pour le blastème. Environ 75 nl (10-15 clics) de la solution morpholino doit être injecté par rayon osseux. Pause ~ 1 sec entre les deux clics. Nous injecter seulement la face dorsale, en utilisant la ventrale électroporation seule commande. Alternativement, on pourrait répéter cette procédure complète en utilisant un morpholino contrôle sur la moitié ventrale de la nageoire.
4. L'électroporation de la morpholino
- Immédiatement après l'injection du morpholino, retirer la plaque d'injection de l'appareil d'injection de micro-. Remplir la plaque d'injection bien avec la solution d'anesthésie jusqu'à ce que le poisson est immergé. L'électroporation est réalisée sous la conduite d'eau. <p> A platine 3 mm de diamètre pince plaque d'électrode (CUY-P3 650 pincettes, Protech international) localise les impulsions d'environ la moitié de l'ailette. Soyez prudent de ne pas toucher les électrodes sur le tissu fin. Pour veiller à ce que les électrodes ne se touchent pas le tissu fin, tourner le poisson sur sa face dorsale et regardez vers le bas de la ligne médiane pour l'électroporation.
- Électroporer la fois la dorsale et ventrale (pour contrôler les effets d'une électroporation non-spécifiques) côtés de la nageoire en utilisant une onde carrée CUY21 Electroporateur (Protech International, Inc). Essuyez les électrodes avec une Kimwipe humide après chaque électroporation pour éliminer les bulles qui se sont formées. Si elles ne sont pas supprimés, un mini-charge s'accumule, ce qui va attirer le tissu vers l'électrode. Les paramètres d'électroporation devrait être fixé à dix consécutive impulsions de 50 ms, à 15 V avec une pause de 1 sec entre les impulsions.
- Placer le poisson sur une lame de verre ou de boîtes de Pétri et rapidement l'image de la fin, en veillant à nouvoir l'orientation dorsale / ventrale. Cette image sera utilisée pour l'analyse repousse le lendemain. Retournez le poisson dans le réservoir.
5. Analyse
- Si la protéine ciblée qui a été renversé dans l'expression est nécessaire à la régénération fin bon, une différence spectaculaire entre les deux moitiés dorsale et ventrale de la nageoire devrait être évident un jour après l'électroporation (figure 5B).
- A 3 dpa, prendre une autre photo de la nageoire de chaque poisson et correspondre cette image avec le correspondant d'image 2 dpa (figure 5B). La variation naturelle dans le modèle de pigmentation fin entre les animaux vous permettra d'identifier correctement chaque poisson.
- Utilisation de l'image NIH, de retracer les 2 et 3 dpa zones dpa des deux moitiés des dorsales et ventrales (figure 5B).
- Pour déterminer la zone% de la consommation par rapport dorsale ventrale de la formule suivante: (dorsaux 3DPA - dorsaux 2dpa) / (ventrale 3DPA - 2dpa ventrale) X 100 =% de la surface
6. Les résultats représentatifs
- Nous avons toujours de dosage pour l'excroissance fin à 3 hpe dpa, ou 24 (électroporation heures après). A cette époque, le morpholino fluorescéine-étiqueté doivent être présents dans la moitié dorsale de la nageoire (Figure complémentaire 1 et la figure 6A). Il est normal de voir certains de fuite vers le bas pour le niveau de l'amputation.
- Il devrait y avoir aucune différence entre les côtés dorsal et ventral de la nageoire injecté et électroporation avec le morpholinos de contrôle (figure 6B).
- Si la cible expérimentale morpholino une protéine essentielle pour leur croissance nageoire, une différence considérable entre les côtés dorsal et ventral doivent être observées (Figure 6C).
- Si l'électrode a touché l'aileron lors de l'électroporation, le tissu apparaît brune (presque brûlé en apparence) et nécrotiques.
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Figure 1. Schéma des différents événements qui se produisent lors de la régénération fin. Les temps qui sous-tendent pour chaque événement sont donnés en heures post-amputation (hpa) et correspondent à une température de la cuve de 33 ° C.
Figure 2. A. Schéma de la plaque d'injection, qui est fabriqué à partir d'agarose et contient un petit puits pour maintenir le poisson pendant micro-injection du morpholino.
Figure 3. Schéma de microinjection morpholino. A. Placez le poisson dans le plat avec la tête du poisson dans l'encoche découpée dans le puits, ce qui aidera les poissons restent stables. B. A faible grossissement, organiser l'aiguille de telle sorte que il est à proximité de la régénération des tissus de l'ailette. C
Figure 4. Schéma d'électroporation fin. A. Après microinjection, placer le poisson dans une boîte de Pétri pleine de l'anesthésie et électroporer les moitiés dorsale et ventrale. B. Assurez-vous de ne pas toucher le tissu fin. Les électrodes doivent être placés ~ 1 mm à partir du tissu.
Exemples Figure 6. De s'attendrerésultats. A. image fluorescente montrant une fluorescéine-étiqueté de contrôle morpholino dans la moitié dorsale de la nageoire, 24 heures après l'électroporation-(HPE). B. Brightfield l'image d'un aileron qui a été injecté et électroporation avec un morpholino de contrôle dans la moitié dorsale . L'image montre la repousse égale des deux moitiés des dorsales et ventrales d'une nageoire, 24 hpe. C. Brightfield l'image d'un aileron qui a été injecté et électroporation avec un morpholino expérimentale dans la moitié dorsale. L'image montre l'inhibition de la repousse sur le côté dorsal / injecté. La ligne indique le montant de la repousse à 2 dpa, immédiatement avant l'injection morpholino et l'électroporation.
Figure 7. Schéma d'une injection alternée et la procédure d'électroporation à des protéines cibles impliquées dans la cicatrisation des plaies et la formation de blastème. A. Injecter le morpholinoentre chaque rayon de la nageoire osseuse sur la moitié dorsale de la nageoire. B. électroporer la morpholino comme d'habitude. C. amputer la nageoire immédiatement proximale (~ 1 segment osseux) au site d'injection. D. La fluorescéine-étiqueté morpholino peuvent être observées dans l'épithélium de la plaie et blastème à 24 hpe.
Figure 8. En utilisant la technique de cibler l'épithélium plaies et la formation blastème. A. Brightfield l'image d'une ailette à 24 hpa qui a été injecté et électroporation avec un morpholino, immédiatement avant l'amputation. B. image fluorescente de la nageoire montré dans le panneau A. Note que la moitié injectée dorsale de la nageoire montre bonne assimilation du morpholino dans le tissu régénératrice. C -. C "plus fort grossissement de la moitié dorsale de la nageoire présenté dans les panneaux A et B. Les sites d'injection sont souvent encore visibles (flèches), Mais de nombreuses cellules cibles ont migré à participer dans l'épithélium de la plaie et la formation blastème (flèche).
Figure 9. En utilisant la technique pour cibler les cellules qui migrent pour former le blastème. A. fluorescent et les images en fond clair encart montrant une nageoire injecté et une électroporation avec morpholino sur les deux moitiés des dorsales et ventrales. La nageoire a ensuite été amputée à deux plans. La moitié dorsale a été coupé immédiatement en aval des sites d'injection, alors que la moitié ventrale a été coupé 9-10 segments osseux distaux aux sites d'injection. B. A 24 hpa, les images fluorescentes et fond clair encart montrent que morpholino a migré vers la dorsale régénérer (1), mais pas les régénérés ventrale (2), indiquant que seule la cellule immédiatement à proximité du site de coupe participer à la formation de blastème. Les deux ensembles de pointes de flèches blanches montrent le niveau de chaque amputationavion. Panneaux marqués 1 et 2 à l'extrême droite de l'image montrent une vue plus fort grossissement des moitiés dorsale et ventrale de la nageoire, respectivement.
Figure 1 supplémentaire. Une vidéo d'un confocale z-empilement d'une région correspondant à l'emplacement d'un blastème dans une ailette injecté et une électroporation avec un groupe morpholino commande. L'image a été prise à 24 hpe. Comme une molécule de fluorescéine unique ne peut pas être visualisée, pas tous de la morpholino peuvent être visualisés ou quantifié. Cependant, ces images donnent une idée des divers degrés de l'absorption qui peuvent être visualisées dans des cellules individuelles, à partir de points punctiformes, à cellules entières pleines de fluorescence morpholino. Sur l'image fixe, l'orientation est indiquée. La barre d'échelle: 25 microns.
Discussion
Ici, nous décrivons un puissant perte de fonction d'approche aux protéines d'intérêt conditionnellement knockdown lors de la régénération chez le poisson zèbre nageoire adulte. Cette technique a été utilisée pour étudier les gènes des jonctions lacunaires, de signalisation des récepteurs des facteurs de transcription, et microARN au cours excroissance fin de régénération 16, 20-22.
Nous prévoyons que cette technique pourrait également être utilisé pour étudier les gènes nécessaires à la cicatrisation des plaies et la formation de blastème en adaptant la technique. Par exemple, on injecte et un groupe morpholino électroporation de commande dans l'espace entre les rayons de la nageoire osseux sur la moitié de l'ailette dorsale avant l'amputation (figure 7). Nous avons ensuite amputé de la nageoire immédiatement en aval de l'avion d'injection. 24 hPa, nous avons observé que les cellules morpholino ciblées avaient émigré distalement pour former à la fois l'épithélium de la plaie et blastème (Figure 8), indiquant que les cellules au cours de ces premières étapes de la régénération peut aussi être TargETED.
La technique a quelques limitations notables. Par exemple, la fluorescence de la balise fluorescéine ne persiste pas après fixation et de traitement pour l'immunohistochimie, ce qui rend impossible de corréler un phénotype cellulaire particulier (c.-à-prolifération cellulaire) avec le montant de morpholino présent dans une cellule. En outre, nous avons été en mesure de réaliser constamment l'électroporation de plasmides dans la nageoire caudale de régénération, mais un groupe précédent a fait rapport de l'électroporation réussie de l'ADN dans le tissu fin 23. Enfin, nous avons noté que le morpholino n'est efficace que pour environ 48 heures après l'électroporation 21, qui interdit l'utilisation de cette technique dans sa forme actuelle pour tester les gènes impliqués dans la différenciation des types de cellules nouvelles. Les essais supplémentaires et modification de la procédure peut permettre de surmonter ces limitations actuelles.
En outre, il est possible que cette technique pourrait être utiliséepour tester des protéines impliquées dans la migration cellulaire à partir du tissu sous-jacent à l'blastème. Par exemple, nous avons injecté et un contrôle par électroporation morpholino dans les deux côtés de l'aileron (comme décrit dans la figure 7) avant l'amputation. Nous avons ensuite amputée de la moitié dorsale de la nageoire immédiatement en aval de l'avion d'injection et nous amputer la nageoire ventrale beaucoup plus distale. À 24 hpa, les cellules morpholino-positifs sur la face dorsale avait migré à partir du site d'injection à l'épithélium sus-jacent et la plaie blastème. Cependant, ce n'était pas le cas sur la face ventrale (figure 9). Cela confirme l'idée que seules les cellules qui sous-tendent le plan d'amputation de participer à la réponse régénérative. Ces données suggèrent également que les protéines hypothétiques être requis pour la migration des cellules pourrait être testé en utilisant cette technique.
Disclosures
Nous n'avons rien à communiquer.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Freimann Life Science Center et le Centre pour le personnel de recherche Zebrafish pour leurs soins et l'entretien du poisson zèbre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CUY21-EDIT or CUY21-SC Square wave electroporator | Protech International, Inc. | CUY21EDIT or CUY21SC | Both units work for this protocol |
| 3-mm diameter paddle electrodes | Protech International, Inc. | CUY 650-P3 | |
| Morpholino | GeneTools, LLC | Morpholino should be custom designed to your protein of interest | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77861-1L | Anesthesia; dilute 1:1000 in fish system water for procedure, 1:500 for euthanasia |
| Micro-injection pump | World Precision Instruments, Inc. | PV830 Pneumatic PicoPump | Many different microinjection systems could be used |
| Micro-manipulator | World Precision Instruments, Inc. | MMJR | Right-handed (MMJL for left-handed) |
| Micro-injection needles, 1.0 mm outside diameter | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | These are borosilicate glass capillaries, pulled into a needle |
| Needle holder | World Precision Instruments, Inc. | 5430-ALL | Pico Nozzle Kit; make sure to inset the 1.0 mm pipette gasket |
| Needle puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | Other micropipette/needle pullers should also work |
| Microscope | Leica, Nikon, Zeiss | Number varies depending on the manufacturer | Any stereomicroscope with 20X optics and the ability to work with micromanipulators |
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