Summary
Это видео демонстрирует протокол изоляции и расширения стволовые клетки, как из хирургически удаленных человеческих mutliforme глиобластомы (GBM) опухолевой ткани использованием метода культуры neurosphere анализа.
Abstract
Стволовые-подобных клеток были выделены в опухолей, таких как рак молочной железы, легких, толстой кишки, предстательной железы и мозга. Важным вопросом во всех этих опухолей, особенно в глиобластомы mutliforme (GBM), заключается в выявлении и изоляции опухоль начала клеточной популяции (ы), чтобы исследовать их роль в образовании опухоли, прогрессирование и повторения. Понимание опухоль начала клеточных популяций предоставят ключи к поиску эффективных терапевтических подходов для этих опухолей. Neurosphere анализа (NSA), благодаря своей простоте и воспроизводимости была использована в качестве метода выбора для изоляции и распространения многих из этого опухолевые клетки. Этот протокол демонстрирует neurosphere метод культуры, чтобы изолировать и расширить стволовых клеток, как хирургически удаленных человеческих тканей опухоли GBM. Процедуры включают в себя начальное переваривание химической и механической диссоциации опухолевой ткани, а затем покрытие в результате суспензии отдельных клеток в культуре АНБ. Через 7-10 дней, первичные нейросферы из 150-200 мкм в диаметре может наблюдаться и готовы к дальнейшему пассажей и расширения.
Protocol
1. Сбор первичных тканей GBM
- Глиобластомы mutliforme (GBM) опухоли получается из пациентов с диагнозом рак и перенесших операцию.
- Меры должны быть сделаны с нейрохирургия команда. Нейрохирург будет место удаленной опухоли GBM в соответствующий размер трубы содержащие нейронных стволовых клеток (НСК) базальной среде, дополненной 10-15% антибиотиков (Peniciline / стрептомицин). Холодная среда должна быть предоставлена операционной комнате лаборатории. Кроме того, холодные HEPES буфером минимальной необходимой среде (ВЭМ) или фосфатно-солевым буфером (PBS) с высокой концентрацией антибиотиков также может быть использован для этой цели.
- Ткани резекции опухоли доставляется в лабораторию на льду и под капотом.
2. Диссоциация первичной опухоли в монопольном клеточной суспензии
- Превышение первоначальной среды / PBS будет удален из трубки сокола и образец промывают 2-3 раза с 5-10мл PBS / НСК базальной среды для удаления крови и мусора. PBS / Средний удаляется и GBM опухолевой ткани помещают в чашку Петри.
- Ткань разрезают на мелкие кусочки и фарш с № 10 лезвие скальпеля на мелкие кусочки, чтобы увеличить площадь поверхности для трипсинизации процесса. Измельчения может занять 1-3 минут в зависимости от размера опухоли.
- Фарш ткани трипсином в 3-5 мл подогретого 0,05% трипсина-EDTA в течение 10-15 минут при температуре 37 ° С водяной бане. Электронная пипетка используется для передачи мелкие кусочки опухоли и трипсина в 15 мл трубки Falcon.
- Равный объем соевого ингибитора трипсина добавляется, чтобы остановить ферментативной реакции трипсин после инкубационного периода.
- Трипсин инактивации обеспечивается с помощью пипетки подвески вверх и вниз несколько раз. Затем, подвеска гранулированный вниз центрифугированием при 800rpm (110г) за 5 мин.
- Супернатант отбрасывается и ткани куски ресуспендировали в 1 мл стерильной НСК басал среды. Скопления разобщены, осторожно пипеткой вверх и вниз (3-7 раз), пока гладкие молочно суспензии отдельных клеток достигается. Число шагов пипетирования напрямую зависит от размера частиц в измельченной ткани. Длительные и энергичной механической диссоциации следует избегать, поскольку это может привести к гибели клетки и сокращения в сфере образования.
- Чтобы удалить не-диссоциированных частей и обломков, 10-15 мл базальной среды добавляется к трубе и клеточная суспензия фильтруется через сетчатый фильтр 40 микрон ячейка в 50 мл трубки.
- Фильтруется суспензию центрифугируют при 800rpm (110г) за 5 мин. Супернатант отбрасывается после этого.
- Pelletted клетки затем ресуспендировали в 1-2 мл полной среды ННЦ для подсчета клеток.
3. Клеток и покрытие
- 10 мкл клеточной суспензии добавляют 90 мкл 0,04% Трипановый синего в 1 мл пробирку Эппендорфа.
Примечание: другие соответствующую ячейку dilutions также может быть использован. - Внесите вверх и вниз, смешать подвески. 10 мкл клеток / трипанового синего смесь передается гемоцитометра того, чтобы считать плотность клеток.
- Клетки высевают в полной среде NSC (смесь НСК базальной среды и СНБ распространения дополнения в 9:01 отношения) с добавлением 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF и 1μl/ml 0,2% гепарина (2μg/ml) в соответствующего суда культуры ткани. 5, 20 и 40 мл среды используется для T25, T80 и T175 колбы, соответственно. Антибиотики могут быть добавлены к среде при концентрации 1:100 уменьшить шанс заражения.
- Колбу помещают в термостат при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
4. Пассажей и расширение GBM производные сферах:
- Когда нейросферы достигли среднего размера 150-200 мкм в диаметре, культура готов к субкультуре. Содержание каждой колбе демонтирован и помещен в соответствующий размер стерильных Tissу.е. в пробирку и центрифугируют при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин при комнатной температуре.
- Супернатант удаляют, а осадок ресуспендируют в 1 мл 0,05% трипсина-EDTA.
- Для достижения оптимального трипсинизации, клеточную суспензию инкубировали при 37 ° С на водяной бане в течение 2-3 мин. Чтобы остановить трипсина деятельности равный объем соевого ингибитора трипсина добавляется к клеточной суспензии и суспензии клеток осторожно пипеткой вверх и вниз.
- Клеточной суспензии центрифугируют при 800 оборотов в минуту (110 г) в течение 5 мин. Затем супернатант удаляли, а клетки ресуспендируют в 1 мл среды НСК.
- Подсчет клеток проводили, как описано ранее.
- Клетки высевали в концентрации 5x10 4 клеток / мл в полной среде НСК дополнены факторы роста и помещают в соответствующего размера культуре ткани судов, как описано в предыдущей части.
- Вторичные нейросферы формируются через 7-10 дней, когда инкубировали при 37 ° C во влажнойified инкубаторе с 5% CO 2.
5. Представитель Результаты:
После покрытия одной клеток, полученных из тканей опухоли GBM, опухолевые стволовые клетки размножаются, как и создавать небольшие скопления клеток состоят из нескольких клеток в течение 3-4 дней (см. видео и рисунок 1). Так как эти кластеры растут, они приобретают более сферическую форму, так что на 7-8 дней, правильное фазы яркие шары с средним диаметром 150-200 микрон формы (см. видео и рисунок 2). При большем увеличении, здоровой сферы обычно демонстрируют microspikes на их периферии. Имея большой сферы, как кластеры в течение 1-2 дней после начала культура происходит из-за существования не-диссоциированных сгустки в разбрасывать деньги налево культуры и не следует путать с истинным сферах. Количество мусора в первичной опухоли сфере культуры меняется в зависимости от исходного источника тканей и является ли оно включает в себя любые окружающие ткани мозга. Правильное методы подготовки тканив том числе ферментативных и механической диссоциации и последующей фильтрации образца с достаточным количеством среды может привести к снижению мусора в культуре.
Рисунок 1. Первичные сфере культуры GBM через 4 дня после покрытия. Опухолевые стволовые клетки размножаются, как и создавать небольшие скопления клеток в 3-4 дня. Оригинальные Увеличение; 20x.
Рисунок 2. Прохождение один GBM сфере культуры через 8 дней после металлизации. Оригинальные Увеличение; 20x.
Discussion
Чтобы изолировать нейронных стволовых и прогениторных клеток из нормальных взрослых и плода мозг 1, 2, 3, 4, а также опухолевые стволовые клетки, как от рака тканей, таких как рак легких 5, 6 простаты, молочной железы 7 и 8 мозг, 9 neurosphere анализа была часто используется как метод выбора. С помощью этой простой и воспроизводимый анализ, можно генерировать неограниченное число клеток из ткани удаленной опухоли, которые показывают, что аналогичные характеристики, как соматические стволовые клетки, экс multipotency живом организме, способность создавать новые опухоли при имплантации, и самообновлению. Эти клетки могут быть использованы для изучения фундаментальной биологии раковых клеток, включая клетки к межклеточных взаимодействий и дифференциации, миграции, вторжения и гибели клеток. Кроме того, изолированные опухолевые стволовые клетки обеспечивают как бесценным инструментом для изучения того, как опухоль формы, прогресс, и рецидивов, а также раскрыть основные вытекающие клеточные механизмы, которые в конечном итоге может дать ответ на терапевтическиеварианты.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана грантами от центра Флориды для исследований мозга опухоли; Престон А. Уэллс Центр терапии опухолей мозга.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
- Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
