Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Neuroscience

Isolering och utbyggnad av tumour glioblastoma multiforme celler med Neurosphere analys

Published: October 30, 2011 doi: 10.3791/3633

Summary

Denna video protokoll visar isolering och utbyggnad av stamceller som celler från kirurgiskt avlägsnade mänskliga glioblastom mutliforme (GBM) tumörvävnad med hjälp av neurosphere metoden analys kultur.

Abstract

Stem-liknande celler som har isolerats i tumörer, såsom bröst-, lung-, tjocktarms-, prostata och hjärna. En kritisk fråga i alla dessa tumörer, särskilt i glioblastom mutliforme (GBM) är att identifiera och isolera tumörer cellpopulation (s) för att undersöka deras roll i tumörbildning, progression och upprepning. Förstå tumörer cellpopulationer ger ledtrådar till att finna effektiva behandlingsmetoder för dessa tumörer. Den neurosphere analys (NSA) på grund av sin enkelhet och reproducerbarhet har använts som metod i valet för isolering och förökning av många av denna tumörceller. Detta protokoll visar neurosphere kultur metod för att isolera och expandera stamceller-liknande celler i kirurgiskt avlägsnade mänskliga GBM tumörvävnad. De förfaranden inkluderar en inledande kemisk nedbrytning och mekanisk dissociation av tumörvävnad, och därefter plätering den resulterande enskild cell suspension i NSA kultur. Efter 7-10 dagar, primär neurospheres på 150-200 mikrometer i diameter kan observeras och är redo för ytterligare passaging och expansion.

Protocol

1. Insamling av primär GBM Tissue

  1. En glioblastom mutliforme (GBM) tumör erhålls från en patient med diagnosen cancer och som genomgår kirurgi.
  2. Arrangemang måste göras med neurokirurgi team. Den neurokirurg placerar opererande GBM tumör i en lämplig storlek röret med neurala stamceller (NSC) bassubstratets kompletteras med 10-15% antibiotika (Peniciline / streptomycin). Kalla medelstora måste ges till operationssalen med lab. Alternativt kall HEPES-buffrad minst viktigt medium (HEM) eller fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med hög koncentration av antibiotika kan också användas för detta ändamål.
  3. Den opererande tumörvävnad levereras till labbet på is och placeras under huven.

2. Dissociation av primärtumör till encelliga Suspension

  1. Överstiger den ursprungliga medium / PBS tas bort från falken röret och provet tvättas 2-3 gånger med 5-10ml PBS / NSC bassubstratets att ta bort blod och smuts. PBS / Medium tas bort och GBM tumörvävnad placeras i en petriskål.
  2. Vävnaden skärs i små bitar och malet med en nr 10 skalpell blad i små bitar för att öka ytan för trypsinization process. Finhacka kan ta 1-3 minuter beroende på storleken av tumören.
  3. Den malda vävnad är trypsinized i 3-5 ml förvärmda% 0,05 trypsin-EDTA i 10-15 minuter vid 37 ° C vattenbad. En elektronisk pipett används för att överföra den lilla tumören bitar och trypsin i en 15 ml Falcon rör.
  4. En lika stor volym av sojabönor trypsin inhibitor läggs för att stoppa den enzymatiska trypsin reaktion efter inkubationstiden.
  5. Trypsin inaktivering säkerställs genom att pipettera suspensionen upp och ned flera gånger. Då är suspensionen pelleterat ner genom att centrifugera vid 800rpm (110g) för 5min.
  6. Supernatanten tas bort och vävnaden bitarna är suspenderade i 1 ml steril NSC basal medium. De klumpar är dissocierade genom att försiktigt pipettera upp och ned (3-7 gånger) tills en slät mjölkig enda cell suspension erhålls. Antalet pipetteringssteg är direkt beroende av storleken på partiklar i malet vävnad. Långa och kraftig mekanisk dissociation bör undvikas eftersom det kan leda till celldöd och minskad sfär bildas.
  7. Att ta bort onödiga dissocierade bitar och skräp, är 10-15 ml bassubstratets läggs till röret och cellsuspension filtreras genom ett 40 mikron cell sil i en 50 ml tub.
  8. Den filtrerade suspension centrifugeras vid 800rpm (110g) för 5min. Supernatanten tas bort efteråt.
  9. Pelletted cellerna då suspenderade i 1-2ml av kompletta NSC medium för cell räkna.

3. Celltal och plätering

  1. 10 mikroliter av cellsuspensionen läggs till 90 mikroliter av 0,04% Trypan blå i en 1 ml Eppendorf-rör.
    Obs: andra lämpliga celler utspädningtioner kan också användas.
  2. Pipettera upp och ner för att blanda suspension. 10 mikroliter av cellerna / trypan blå blandning överförs till hemocytometer för att räkna celltätheten.
  3. Celler är pläterade helt NSC medium (en blandning av NSC bassubstratets och NSC spridning tillägg på ett 9:1-förhållande) kompletteras med 20ng/ml fonden 10ng/ml bFGF och 1μl/ml på 0,2% heparin (2μg/ml) i lämpligt vävnadskultur fartyg. 5, 20 och 40 ml medium används för T25, T80 och T175 kolvar, respektive. Antibiotika kan läggas till mediet vid en koncentration av 1:100 för att minska risken för kontamination.
  4. Kolven placeras i en inkubator inställd på 37 ° C och 5% CO 2.

4. Passaging och utbyggnad av GBM härrör sfärer:

  1. När neurospheres nått en genomsnittlig storlek på 150-200 mikrometer i diameter, är kulturen redo för subkultur. Innehållet i vardera kolven tas bort och placeras i en lämplig storlek steril TissUE kultur rör och centrifugeras vid 800 rpm (110 g) i 5 minuter vid rumstemperatur.
  2. Supernatanten bort och pellets är suspenderade i 1 ml% 0,05 trypsin-EDTA.
  3. För att uppnå en optimal trypsinization är cellsuspension inkuberas vid 37 ° C i ett vattenbad i 2-3 min. För att stoppa trypsin verksamheten en lika stor volym soja trypsin inhibitor läggs till cellsuspension och cellsuspension är försiktigt pipetteras upp och ner.
  4. Cellsuspensionen är centrifugeras vid 800 rpm (110g) i 5 minuter. Då är supernatanten bort och cellerna är suspenderade i 1 ml NSC medium.
  5. En celler utförs enligt beskrivningen tidigare.
  6. Cellerna är klädd i en koncentration av 5x10 4 celler / ml i hela NSC mediet kompletteras med tillväxtfaktorer och klädd i lämpliga kultur storlek vävnad fartyg som beskrivits i tidigare del.
  7. Sekundära neurospheres bildas i 7-10 dagar när de inkuberas vid 37 ° C i en fuktigified inkubator med 5% CO 2.

5. Representativa resultat:

Efter förkromning den enskilda celler skördas från GBM tumörvävnad, tumör stamceller-liknande celler föröka sig och skapa små kluster av celler som består av några få celler i 3-4 dagar (se videon och Figur 1). Eftersom dessa kluster växer, få de en mer sfärisk form så att vid 7-8 dagar, i rätt fas lysande klot med en genomsnittlig diameter av 150-200 mikron form (se videon och figur 2). Vid högre förstoring, friska kulor visar oftast microspikes på deras periferi. Med stor sfär som kluster inom 1-2 dagar efter kultur initiering beror på att förekomsten av icke-differentierade klumpar på binging av kulturen och bör inte förväxlas som sanna sfärer. Mängden skräp i primärtumör sfär kultur varierar beroende på den ursprungliga källan till vävnad och om det finns någon omgivande hjärnvävnad. Rätt vävnad förberedelse teknikerinklusive enzymatisk och mekanisk dissociation, och efterföljande filtrering av provet med en tillräcklig mängd medium kan resultera i mindre skräp i kulturen.

Figur 1
Figur 1. Primär GBM sfär kultur 4 dagar efter plätering. Tumör stam-liknande celler föröka sig och skapa små kluster av celler i 3-4 dagar. Original Förstoring, 20x.

Figur 2
Figur 2. Passage en GBM sfär kultur 8 dagar efter plätering. Original Förstoring, 20x.

Discussion

Att isolera neurala stamceller och progenitorceller från normala vuxna och foster hjärnor 1, 2, 3, 4 och också tumör stamceller-liknande celler från cancer vävnader såsom lungor 5, prostata-6, bröst 7 och hjärna 8, 9 av neurosphere analysen har ofta som den metod som föredras. Med denna enkla och reproducerbara analys, kan man skapa ett oändligt antal celler från opererande tumörvävnad som visar liknande egenskaper som somatiska stamceller, ex vivo multipotency, förmågan att skapa nya tumörer efter implantation, och självförnyelse. Dessa celler kan användas för att studera grundläggande biologi cancercellen inklusive cell till cell interaktioner, och differentiering, migration, invasion och celldöd. Dessutom isolerad tumör stamceller-liknande celler ger ett ovärderligt verktyg för att studera hur tumörer form, framsteg och återfall och även att riva upp de bakomliggande härrör cellulära mekanismer som så småningom skulle kunna ge insikter till terapeutiskalternativ.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgments

Detta arbete har finansierats med bidrag från Florida Centrum för hjärntumör forskning, Preston A. Wells Jr Centrum för hjärntumör terapi.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human) Medium Stem Cell Technologies 05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) Medium supplement Stem Cell Technologies 05753
%0.05 trypsin-EDTA Reagent GIBCO, by Life Technologies 25300-062
*MEM Reagent GIBCO, by Life Technologies 41500-018 HEM component
*HEPES Reagent Sigma-Aldrich H4034 HEM component
*Distilled water Reagent GIBCO, by Life Technologies 15230-147
**DNase I Reagent Roche Group 104159
**Soybean trypsin inhibitor Reagent Sigma-Aldrich T6522
Pen/Strep Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
No. 10 scalpel blade Surgical tool BD Biosciences 371610
Petri Dish Culture ware BD Biosciences 353003
Small forceps Surgical tools Fine Science Tools 11050-10
Cell strainer Sieve BD Biosciences 352340
T25 flask Culture ware Nalge Nunc international 136196
T80 flask Culture ware Nalge Nunc international 178905
15 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352096
50 ml tubes Culture ware BD Biosciences 352070
EGF Growth factor R&D Systems 2028-EG
b-FGF Growth factor R&D Systems 3139-FB
Heparin Growth factor Sigma-Aldrich H4784 Reconstituted in PBS
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
  2. Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
  3. Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
  4. Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
  5. Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
  6. Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
  7. Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
  8. Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
  9. Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).

Tags

Neurovetenskap glioblastoma multiforme tumörceller Neurosphere Assay isolering Expansion
Isolering och utbyggnad av tumour glioblastoma multiforme celler med Neurosphere analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Azari, H., Millette, S., Ansari, S., More

Azari, H., Millette, S., Ansari, S., Rahman, M., Deleyrolle, L. P., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (56), e3633, doi:10.3791/3633 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter