Summary
这个视频协议演示的隔离和扩大干细胞的神经球的实验文化方法如手术切除人脑胶质瘤mutliforme（GBM）的肿瘤组织使用。
Abstract
已被隔离，如乳腺癌，肺癌，结肠癌，前列腺癌和脑肿瘤干细胞样细胞。在所有这些肿瘤的一个关键问题，尤其是在胶质母细胞瘤（GBM）的mutliforme，是识别和分离肿瘤启动细胞的人口（S），以调查他们的作用，在肿瘤的形成，进展和复发。了解肿瘤启动细胞群会提供线索，发现这些肿瘤的有效治疗方法。神经球测定（NSA），由于其简单性和可重复性已被用作隔离和传播这种肿瘤细胞的首选方法。此协议表明神经球的培养方法，隔离和扩大人类GBM的手术切除肿瘤组织中的干细胞样细胞。该程序包括一个初始的化学性消化和机械分离肿瘤组织，并随后电镀NSA的文化产生的单细胞悬液。经过7-10天，初级神经球的150-2在直径00微米，可以观察到，并准备进一步传代和扩张。
Protocol
1。收集原发性GBM的组织
- mutliforme一个胶质母细胞瘤（GBM）肿瘤与癌症的诊断和手术病人获得。
- 神经外科团队必须作出安排。神经外科医生，将放置在一个合适的大小，包含神经干细胞（NSC）的培养基辅以10-15％的抗生素（Peniciline / Streptomycine）管切除的大紫荆勋章肿瘤。冷介质，必须提供由实验室手术室。另外，冷的HEPES缓冲的最低限度的基本培养基（HEM）或磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）的高浓度抗生素也可以用于此目的。
- 切除的肿瘤组织被传递到冰实验室和置于引擎盖下。
2。原发肿瘤分解成单细胞悬液
- 原中/ PBS的差额从猎鹰管和样品洗净，用5 - 10M的2-3倍L的PBS /国科会培养基，以清除血液和碎片。 PBS /中等被删除，在培养皿中的大紫荆勋章的肿瘤组织。
- 组织切成小块，剁碎和10号成小片的手术刀刀片胰蛋白酶消化过程，增加表面积。切碎可以采取1-3分钟，取决于肿瘤的大小。
- 碎组织胰酶消化35毫升预热％0.05胰蛋白酶- EDTA在37℃水浴10-15分钟。使用的电子移液器是转移到15毫升猎鹰管的微小肿瘤件和胰蛋白酶。
- 大豆胰蛋白酶抑制剂等体积添加到阻止酶的胰蛋白酶反应后的潜伏期。
- 胰蛋白酶失活，确保移液的悬浮上下几次。然后，暂停800rpm（110克）离心5分钟沉淀下来。
- 上清被丢弃，并组织块悬浮在无菌国科会BA1毫升SAL介质。团块分离轻轻吹打起来，直到达到一个平稳的乳白色单细胞悬液（3-7倍）。步移液操作的数量直接取决于粒子剁碎组织的大小。应避免冗长和充满活力的机械分离，因为它可能导致细胞死亡，并减少在球体形成。
- 要删除联合国分离件和碎片，添加10-15毫升培养基管细胞悬液通过40微米的细胞过滤器过滤后进入一个50毫升管。
- 过滤悬浮离心800rpm（110克）为5min。事后被丢弃上清。
- Pelletted细胞，然后悬浮在完成国科会为中等细胞计数12毫升。
3。细胞计数和电镀
- 10μL的细胞悬液加入到90μL0.04％台盼蓝在1毫升Eppendorf管。
注：其他合适的细胞稀释各条指令可能也可以使用。 - 移液器上下混合暂停。 10μL的细胞/台盼蓝的混合物转移到血球以计数细胞密度。
- 细胞是镀在完成国科会（NSC培养基和NSC增殖的补充，在9:1的比例混合培养基的0.2％肝素（2μg/ml）与20ng/ml EGF，在10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子和1μl/ml）适当的组织培养容器。 5，20和40毫升介质的T25，T80和T175培养瓶，分别用于。抗生素可加入浓度为1:100中期，以减少污染的机会。
- 烧瓶放置在一个孵化器设置在37 ° C和5％CO 2。
4。传代和扩大GBM的衍生领域：
- 当神经球达到了一个直径在150-200微米的平均规模，文化是亚文化的准备。每个烧瓶中的内容被删除，并放置在一个适当大小的无菌TISSUE文化管，并在室温下5分钟800转（110克）离心。
- 除去上清和沉淀重悬于1毫升的0.05％胰蛋白酶EDTA。
- 为了达到最佳的胰蛋白酶消化，细胞悬液培养在37℃水浴为2-3分钟。要停止胰蛋白酶的活性大豆胰蛋白酶抑制剂等体积加入细胞悬液，细胞悬液轻轻吸管上下。
- 细胞悬液，离心5分钟800转（110克）。然后，取上清液被删除，在1毫升的NSC培养基中悬浮细胞。
- 如前面所述，一个细胞计数。
- 这些细胞是镀在完成国科会培养基辅以生长因子，并在适当大小的组织文化，如前面部分所述的船只镀的浓度在5X10 4个细胞/毫升。
- 在7-10天，在37 ° C在潮湿中学神经球形成ified孵化器与5％的CO 2。
5。代表性的成果：
电镀后从GBM的肿瘤组织中收获了单细胞，肿瘤干细胞样细胞增殖，并产生小的细胞在3-4天，少数细胞组成（见视频和图1）集群。由于这些集群的成长，他们将获得由7-8天这样，适当阶段明亮领域的球形，平均直径为150-200微米的形式（见视频和图2）。在更高的放大倍率，健康的领域，通常体现在其外围microspikes。大球体，如在1-2天内集群文化启动后，由于存在非游离团块文化暴食，不应该被误认为是真正的领域。在原发肿瘤领域的文化碎片量取决于组织的初始源，它是否包含任何周围的脑组织。适当的组织制备技术包括足够数量的中等酶和机械分离，和随后的样品过滤，可以导致在更短的文化碎片。
图1。小学大紫荆勋章后第4天电镀领域的文化。肿瘤干细胞样细胞增殖和细胞产生的小群在3-4天。原放大; 20X。
图2通道电镀后第8天一个大紫荆勋章领域的文化。原放大; 20X。
Discussion
为了隔离从正常成人和胎儿大脑1，2，3，4的神经干细胞和祖细胞，也肿瘤干细胞样， 乳腺癌7 6 5肺癌，前列腺癌和脑8，9，如癌组织细胞的神经干检测已经常使用的方法的选择。使用这个简单，重复性实验，可以生成一个无限期的数量从切除的肿瘤组织细胞，表明成体干细胞相似的特点;体内多能，能够创造新的肿瘤后植入，自我更新。这些细胞可用于研究的基本癌的细胞生物学，包括细胞与细胞之间的相互作用，分化，迁移，侵袭和细胞死亡。此外，分离出肿瘤干细胞样细胞提供了一个宝贵的工具，研究如何肿瘤形成，进展和复发，也解开底层产生的细胞机制，最终能提供洞察力，以治疗选项。
Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是从佛罗里达州的脑瘤研究中心的资助;普雷斯顿A.井小的脑肿瘤治疗中心的支持。
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
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