Summary
Deze video protocol toont de isolatie en de uitbreiding van stamcellen als cellen van chirurgisch gereseceerd menselijke glioblastoom mutliforme (GBM) tumor weefsel met behulp van de neurosphere assay kweekmethode.
Abstract
Stam-achtige cellen werden geïsoleerd in tumoren zoals borst-, long-, colon-, prostaat-en de hersenen. Een kritiek punt in al deze tumoren, met name in glioblastoom mutliforme (GBM), is het identificeren en te isoleren tumor initiëren cel populatie (s) om hun rol te onderzoeken in tumorvorming, progressie, en herhaling. Inzicht in tumor initiëren van celpopulaties zal aanwijzingen geven over het vinden van effectieve therapeutische benaderingen voor deze tumoren. De neurosphere assay (NSA), vanwege zijn eenvoud en reproduceerbaarheid is gebruikt als de methode van keuze voor isolatie en verspreiding van veel van deze tumorcellen. Dit protocol laat de neurosphere kweekmethode te isoleren en stam-achtige cellen uit te breiden in chirurgisch weggesneden humane GBM tumor weefsel. De procedures omvatten een eerste chemische vertering en mechanische dissociatie van tumorweefsel, en vervolgens plating de resulterende enkele celsuspensie in NSA cultuur. Na 7-10 dagen, primaire neurospheres van 150-200 micrometer in diameter kunnen worden waargenomen en zijn klaar voor verdere passage en uitbreiding.
Protocol
1. Verzameling van primaire GBM Tissue
- Een glioblastoma mutliforme (GBM) tumor is verkregen van een patiënt gediagnosticeerd met de kanker en die een operatie ondergaan.
- Regelingen moeten worden gemaakt met neurochirurgie team. De neurochirurg zal plaats de verwijderde tumor GBM in een geschikte grootte buis met neurale stamcellen (NSC) basaal medium, aangevuld met 10-15% antibiotica (Peniciline / streptomycine). Koude medium moet worden verstrekt aan operatiekamer door lab. Als alternatief, koude HEPES-gebufferd minimale essentiële medium (HEM) of fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) met een hoge concentratie van antibiotica kan ook worden gebruikt voor dit doel.
- De verwijderde tumor weefsel wordt geleverd aan het lab op het ijs en onder de motorkap.
2. Dissociatie van de primaire tumor in de Single-Cell Suspension
- Bovenop de oorspronkelijke medium / PBS wordt verwijderd uit de valk buis en het monster wordt gewassen 2-3 keer met 5-10ml PBS / NSC basismedium om bloed en vuil te verwijderen. De PBS / Medium is verwijderd en de GBM tumor weefsel wordt geplaatst in een petrischaal.
- Het weefsel wordt in kleine stukjes gesneden en gehakt met een nr. 10 scalpel in kleine stukjes naar de oppervlakte voor het trypsine te vergroten. Hakken kan 1-3 minuten, afhankelijk van de grootte van de tumor.
- Het gehakt weefsel wordt getrypsiniseerd in 3-5 ml van de voorverwarmde% 0,05 trypsine-EDTA gedurende 10-15 minuten bij een 37 ° C waterbad. Een elektronische pipet wordt gebruikt om de kleine stukjes tumor en trypsine te zetten in een 15 ml Falcon buis.
- Een gelijk volume van de sojaboon trypsine-remmer wordt toegevoegd aan de enzymatische trypsine reactie na de incubatietijd te stoppen.
- Trypsine inactivatie wordt verzekerd door pipetteren de schorsing op en neer meerdere malen. Vervolgens wordt de suspensie gepelleteerd door centrifugeren bij 800rpm (110g) voor 5min.
- Het supernatant wordt verwijderd en het weefsel stukken worden geresuspendeerd in 1 ml van de steriele NSC basal medium. De klompjes worden gescheiden door zachtjes en neer te pipetteren (3-7 keer) tot een gladde melkachtige enkele cel suspensie is ontstaan. Het aantal pipetteerstappen is direct afhankelijk van de grootte van deeltjes in de gehakt weefsel. Langdurige en krachtige mechanische dissociatie moet worden vermeden omdat het kan resulteren in celdood en een vermindering van de sfeer formatie.
- Van de VN-gesplitste stukken en vuil te verwijderen, is 10-15 ml van de basale medium toegevoegd aan de buis en de celsuspensie wordt gefilterd door een 40 micron cel zeef in een 50 ml buis.
- De gefilterde suspensie wordt gecentrifugeerd bij 800rpm (110g) voor 5min. Het supernatant wordt achteraf weggegooid.
- Gepelleteerd cellen worden dan geresuspendeerd in 1-2 ml van complete NSC medium voor cel tellen.
3. Celgetal en Plating
- 10 pi van de celsuspensie wordt toegevoegd aan 90 ul van 0,04% trypan blauw in een 1 ml eppendorfbuisje.
Let op: andere geschikte cel verdungen kan ook worden gebruikt. - Pipet op en neer om de schorsing te mengen. 10 pi van de cellen / trypan blauw mengsel wordt overgebracht naar hemocytometer om celdichtheid tellen.
- Cellen worden uitgeplaat in volledige NSC medium (een mengsel van NSC basale medium en NSC proliferatie aan te vullen op een 09:01 verhouding), aangevuld met 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF en 1μl/ml van 0,2% heparine (2μg/ml) in juiste weefselkweek schepen. 5, 20 en 40 ml medium wordt gebruikt voor T25, T80 en T175 flessen, respectievelijk. Antibiotica kunnen worden toegevoegd aan het medium bij een concentratie van 1:100 tot kans op besmetting verminderen.
- De kolf is geplaatst in een incubator ingesteld op 37 ° C en 5% CO 2.
4. Passage en uitbreiding van de GBM afgeleid sferen:
- Wanneer de neurospheres een gemiddelde grootte van 150-200 micrometer in diameter bereikt, de cultuur is klaar voor subcultuur. De inhoud van elke kolf wordt verwijderd en geplaatst in een passende omvang steriele Tissue cultuur buis, en gecentrifugeerd bij 800 rpm (110 g) gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Het supernatant wordt verwijderd en de pellet wordt geresuspendeerd in 1 ml van 0,05% trypsine-EDTA.
- Om een optimale behandeling met trypsine, wordt de celsuspensie geïncubeerd bij 37 ° C in een waterbad voor 2-3 minuten. Te stoppen met de trypsine-activiteit een gelijk volume van soja trypsine-remmer wordt toegevoegd aan de celsuspensie en de celsuspensie voorzichtig gepipetteerd op en neer.
- De celsuspensie wordt gecentrifugeerd bij 800 rpm (110g) gedurende 5 minuten. Vervolgens wordt het supernatant verwijderd en de cellen worden geresuspendeerd in 1 ml van NSC medium.
- Een cel telling wordt uitgevoerd zoals eerder beschreven.
- De cellen worden uitgeplaat bij een concentratie van 5x10 4 cellen / ml in volledige NSC medium aangevuld met groeifactoren en uitgeplaat in de juiste grootte weefselkweek schepen zoals beschreven in de vorige deel.
- Secundaire neurospheres worden gevormd in 7-10 dagen toen geïncubeerd bij 37 ° C in een vochtigeified incubator met 5% CO 2.
5. Representatieve resultaten:
Na beplating van de afzonderlijke cellen geoogst van GBM tumorweefsel, tumor stam-achtige cellen prolifereren en het genereren van kleine clusters van cellen bestaat uit enkele cellen in 3-4 dagen (zie de video en zie figuur 1). Omdat deze clusters groeien, krijgen ze een meer ronde vorm, zodat met 7-8 dagen, een goede fase heldere bollen met een gemiddelde diameter van 150-200 micron vorm (Zie de video en Figuur 2). Bij hogere vergroting, gezonde bollen meestal demonstreren microspikes op hun periferie. Na grote bol, zoals clusters binnen 1-2 dagen na de initiatie cultuur is te wijten aan het bestaan van niet-gesplitste klonten in de binging van de cultuur en mag niet worden verward als echte bollen. De hoeveelheid puin in de primaire tumor sfeer cultuur hangt af van de oorspronkelijke bron van weefsel en al dan niet omvat alle omliggende hersenweefsel. De juiste weefsels bereidingstechniekeninclusief enzymatische en mechanische dissociatie, en de daaropvolgende filtratie van het monster met een voldoende hoeveelheid van het medium kan leiden tot minder vuil in de cultuur.
Figuur 1. Primaire GBM bol cultuur 4 dagen na de plating. Tumor stam-achtige cellen prolifereren en het genereren van kleine clusters van cellen in 3-4 dagen. Originele Vergroting; 20x.
Figuur 2. Passage een GBM bol cultuur 8 dagen na plating. Originele Vergroting; 20x.
Discussion
Om neurale stamcellen en stamcellen uit normale volwassen en foetale hersenen 1, 2, 3, 4 isoleren en ook de tumor stam-achtige cellen aan kanker weefsels zoals long-5-, prostaat-6-, borst-7 en de hersenen 8, 9 van de neurosphere test is vaak gebruikt als de methode van keuze. Met behulp van deze eenvoudige en reproduceerbare test, kan men het genereren van een onbepaald aantal cellen van de tumor operatief verwijderde weefsel dat dezelfde kenmerken als somatische stamcellen te tonen; ex vivo multipotent, de mogelijkheid om nieuwe tumoren te creëren bij de implantatie, en zelf-vernieuwing. Deze cellen kunnen worden gebruikt om de basis van kanker celbiologie waaronder cel-cel interacties, en differentiatie, migratie, invasie en celdood te bestuderen. Daarnaast, geïsoleerde tumor stam-achtige cellen geven een waardevol instrument om te onderzoeken hoe tumoren vormen, vooruitgang en terugval en ook om de onderliggende cellulaire mechanismen die voortvloeien dat uiteindelijk zou kunnen inzicht te verstrekken aan therapeutische ontrafelenmogelijkheden.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Florida Centre for Brain Tumor onderzoek; Preston A. Wells Jr Center for Brain Tumor Therapie.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
- Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255, 1707-1710 (1992).
- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
- Eramo, A. Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population. Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).
- Patrawala, L. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
- Li, X. Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy. J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).
- Galli, R. Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma. Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).
- Deleyrolle, L. P. Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma. Brain. 134, 1331-1343 (2011).
