L'isolement et l'expansion des cellules humaines de glioblastome multiforme tumeur utilisant le test Neurosphère

Summary

Ce protocole vidéo démontre l'isolement et l'expansion des cellules souches comme des cellules de glioblastome mutliforme résection chirurgicale humaine (GBM) tissu tumoral en utilisant la méthode de dosage Neurosphère culture.

Abstract

Proche des cellules souches ont été isolées dans les tumeurs comme le sein, poumon, côlon, prostate et du cerveau. Une question essentielle dans toutes ces tumeurs, en particulier dans mutliforme glioblastome (GBM), est d'identifier et d'isoler la tumeur population cellulaire initiateur (s) pour enquêter sur leur rôle dans la formation tumorale, la progression, et les récidives. Comprendre la tumeur initier les populations de cellules fournira des indices pour trouver des approches thérapeutiques efficaces pour ces tumeurs. Le dosage de Neurosphère (NSA) en raison de sa simplicité et sa reproductibilité a été utilisée comme méthode de choix pour l'isolement et la propagation de nombreuses de cette cellules tumorales. Ce protocole illustre la méthode de culture Neurosphère à isoler et à étendre aux cellules souches dans la résection chirurgicale du tissu tumoral humain GBM. Les procédures comprennent une digestion chimique initial et de dissociation mécanique du tissu tumoral, et par la suite plaquage de la suspension cellulaire unique résultant de la culture NSA. Après 7-10 jours, primaire neurosphères du 150-200 m de diamètre peuvent être observés et sont prêts pour d'autres repiquage et d'expansion.

Protocol

1. Prélèvement de tissus GBM primaire

1. Un glioblastome mutliforme (GBM) tumeur est obtenue à partir d'un patient diagnostiqué avec le cancer et subissant une chirurgie.
2. Dispositions doivent être prises avec l'équipe de neurochirurgie. Le neurochirurgien aura lieu la tumeur réséquée GBM dans un tube de taille appropriée contenant des cellules souches neurales (NSC) milieu de base additionné d'antibiotiques 10-15% (Peniciline / streptomycine). Milieu froid doit être fournie à la salle d'opération par le laboratoire. Alternativement, le froid tamponné HEPES milieu essentiel minimum (HEM) ou de tampon phosphate salin (PBS) à forte concentration d'antibiotiques peuvent également être utilisés à cette fin.
3. Le tissu tumoral réséqué est livré au laboratoire sur la glace et placé sous le capot.

2. La dissociation de la tumeur primitive en une seule cellule de suspension

1. L'excès du support original / PBS est éliminé du tube Falcon et l'échantillon est lavé 2-3 fois avec le 5-10ml de PBS / NSC milieu basal pour enlever le sang et les débris. Le PBS / milieu est éliminé et le tissu tumoral GBM est placé dans une boîte de Pétri.
2. Le tissu est coupé en petits morceaux et émincé avec une lame de bistouri n ° 10 en petits morceaux pour augmenter la surface pour le processus de traitement à la trypsine. Mincing peut prendre 1-3 minutes selon la taille de la tumeur.
3. Le tissu émincé est trypsinisées en 3-5ml de pré-chauffé à 0,05% de trypsine-EDTA pendant 10-15 minutes dans un bain d'eau à 37 ° C. Une pipette électronique est utilisé pour transférer les morceaux minuscules tumeurs et de la trypsine dans un tube de 15ml Falcon.
4. Un volume égal de l'inhibiteur de trypsine de soja est ajouté pour arrêter la réaction enzymatique trypsine après la période d'incubation.
5. Inactivation trypsine est assurée par la suspension de pipetage de haut en bas plusieurs fois. Ensuite, la suspension est granulé par centrifugation à 800rpm (110g) pendant 5 min.
6. Le surnageant est éliminé et les morceaux de tissus sont remis en suspension dans 1ml de solution stérile NSC bamoyennes sal. Les bouquets sont dissociés par un léger pipetage haut et en bas (3-7 fois) jusqu'à ce qu'une bonne suspension laiteuse seule cellule est atteint. Le nombre d'étapes de pipetage dépend directement de la taille des particules dans les tissus hachés. De longs et vigoureux dissociation mécanique devrait être évitée car elle pourrait entraîner la mort cellulaire et une réduction de la formation sphère.
7. Pour supprimer l'ONU dissocié des pièces et des débris, 10-15 ml de milieu de base est ajoutée dans le tube et la suspension cellulaire est filtrée à travers une passoire de 40 microns de cellules dans un tube de 50ml.
8. La suspension filtrée est centrifugé à 800rpm (110g) pendant 5 min. Le surnageant est éliminé par la suite.
9. Cellules Pelletted sont ensuite resuspendues dans 1-2ml de NSC milieu complet pour le comptage cellulaire.

3. Numération cellulaire et placage

1. 10 pl de la suspension cellulaire sont ajoutés à 90 uL de 0,04% bleu trypan dans un tube eppendorf 1ml.
   Remarque: d'autres cellules appropriées dilutiontions peuvent également être utilisés.
2. Pipeter haut et en bas pour mélanger la suspension. 10 uL des cellules / bleu trypan mélange est transféré à hémocytomètre pour compter la densité cellulaire.
3. Les cellules sont étalées au NSC milieu complet (un mélange de NSC milieu basal et NSC prolifération supplément à un ratio de 9:1) complété avec 20ng/ml EGF, bFGF et 10ng/ml 1μl/ml de l'héparine de 0,2% (2μg/ml) dans appropriée des récipients de culture tissulaire. 5 ml, 20 et 40 du milieu est utilisé pour des flacons T25, T80 et T175, respectivement. Des antibiotiques peuvent être ajoutés dans le milieu à une concentration de 1:100 pour diminuer risques de contamination.
4. Le ballon est placé dans un incubateur réglé à 37 ° C et 5% de CO _2.

4. Le repiquage et l'expansion du GBM sphères dérivés:

1. Lorsque les neurosphères atteint une taille moyenne de 150-200 m de diamètre, la culture est prêt pour la sous-culture. Le contenu de chaque flacon est retiré et placé dans une taille appropriée TISS stérilestube de culture ue, et centrifugé à 800 rpm (110 g) pendant 5 min à température ambiante.
2. Le surnageant est éliminé et le culot est resuspendu dans 1 ml de 0,05% de trypsine-EDTA.
3. Pour parvenir à une trypsinisation optimale, la suspension cellulaire est incubée à 37 ° C dans un bain d'eau pendant 2-3 min. Pour arrêter l'activité de la trypsine un volume égal de l'inhibiteur de trypsine de soja est ajoutée à la suspension cellulaire et la suspension cellulaire est doucement introduit à la pipette de haut en bas.
4. La suspension cellulaire est centrifugée à 800 tours par minute (110g) pendant 5 min. Ensuite, le surnageant est éliminé et les cellules sont remises en suspension dans 1 ml de milieu NSC.
5. Un comptage des cellules est effectué comme décrit précédemment.
6. Les cellules sont étalées à une concentration de 5x10 ⁴ cellules / ml dans NSC milieu complet additionné de facteurs de croissance et plaquées dans des navires de taille appropriée la culture de tissus tels que décrits dans la partie précédente.
7. Neurosphères secondaires se forment dans les 7-10 jours lorsqu'elle est incubée à 37 ° C dans un environnement humideified incubateur avec 5% de CO _2.

5. Les résultats représentatifs:

Après étalement de la récolte des cellules individuelles à partir de tissus tumoraux GBM, une tumeur proche des cellules souches prolifèrent et génèrent de petits amas de cellules composée de quelques cellules dans 3-4 jours (voir la vidéo et graphique 1). Comme ces grappes de croître, ils acquièrent une forme plus sphérique afin que par 7-8 jours, des sphères lumineuses bonne phase avec un diamètre moyen de 150-200 microns forme (voir la vidéo et graphique 2). A plus fort grossissement, de sphères saines habituellement démontrer microspikes à leur périphérie. Ayant grande sphère comme les grappes de 1-2 jours après l'initiation de la culture est due à l'existence de non-dissociée des touffes à l'binging de la culture et ne doivent pas être confondus avec les sphères vrai. La quantité de débris dans la culture sphère tumeur primitive varie en fonction de la source initiale de tissu et si oui ou non il comprend tout tissu cérébral environnant. Techniques appropriées de préparation des tissusnotamment la dissociation enzymatique et mécanique et la filtration ultérieure de l'échantillon avec une quantité suffisante de milieu peut aboutir à moins de débris dans la culture.

Figure 1. Primaires de la culture sphère GBM 4 jours après placage. Tumeur proche des cellules souches prolifèrent et génèrent de petits amas de cellules dans les 3-4 jours. Grossissement original; 20x.

Figure 2. Passage d'une culture sphère GBM 8 jours après placage. Grossissement original; 20x.

Discussion

Pour isoler souches neurales et de cellules progénitrices d'adulte normal et le cerveau du fœtus ^{1, 2, 3, 4} et aussi une tumeur proche des cellules souches provenant de tissus de cancer comme le poumon ^5, de la prostate ^{6, 7} et le cerveau maternel ^{8, 9} le dosage a été Neurosphère fréquemment utilisées comme la méthode de choix. L'utilisation de ce test simple et reproductible, on peut générer un nombre indéfini de cellules de tissu tumoral réséqué qui montrent les mêmes caractéristiques que les cellules souches somatiques; multipotence ex vivo, la capacité de créer de nouvelles tumeurs lors de l'implantation, et l'auto-renouvellement. Ces cellules pourraient être utilisées pour étudier la biologie fondamentale sur le cancer des cellules dont la cellule à cellule des interactions, et de la différenciation, la migration, l'invasion et la mort cellulaire. En outre, les tumeurs isolées proche des cellules souches de fournir un outil précieux pour étudier comment se forment les tumeurs, les progrès et rechutes et aussi de démêler les sous-tendent les mécanismes cellulaires dérivant qui pourraient éventuellement fournir des indications aux thérapeutiquesoptions.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche Group	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD Biosciences	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Biosciences	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.