Summary
यह वीडियो प्रोटोकॉल अलगाव और शल्य चिकित्सा resected मानव glioblastoma (जीबीएम) mutliforme ट्यूमर ऊतक कोशिकाओं से neurosphere परख संस्कृति पद्धति का उपयोग करके की तरह स्टेम के विस्तार को दर्शाता है.
Abstract
स्तन, फेफड़ों, बृहदान्त्र, प्रोस्टेट, और मस्तिष्क के रूप में में ट्यूमर में स्टेम कोशिकाओं की तरह पृथक किया गया है. इन सभी ट्यूमर में एक महत्वपूर्ण मुद्दा glioblastoma mutliforme (जीबीएम) में विशेष रूप से, की पहचान करने और ट्यूमर की शुरुआत सेल की आबादी (ओं) को अलग करने के लिए ट्यूमर गठन, प्रगति, और पुनरावृत्ति में उनकी भूमिका की जांच करने के लिए है. समझना ट्यूमर सेल आबादी की शुरुआत के सुराग के लिए इन ट्यूमर के लिए प्रभावी चिकित्सकीय दृष्टिकोण खोजने के लिए प्रदान करेंगे. neurosphere परख (एनएसए) अपनी सादगी और reproducibility के कारण अलगाव और इस ट्यूमर कोशिकाओं के कई के प्रसार के लिए पसंद की विधि के रूप में इस्तेमाल किया गया है. इस प्रोटोकॉल neurosphere संस्कृति को अलग करने और शल्य चिकित्सा resected मानव जीबीएम ट्यूमर ऊतक में स्टेम कोशिकाओं की तरह का विस्तार विधि को दर्शाता है. प्रक्रियाओं एक प्रारंभिक रासायनिक पाचन और ट्यूमर के ऊतक के यांत्रिक हदबंदी, और बाद में एनएसए संस्कृति में एकल कक्ष निलंबन परिणामस्वरूप चढ़ाना शामिल हैं. 7-10 दिनों के बाद, 150-2 के प्राथमिक neurospheresव्यास में 00 सुक्ष्ममापी और देखा जा सकता है आगे passaging और विस्तार के लिए तैयार हैं.
Protocol
1. प्राथमिक जीबीएम ऊतक का संग्रह
- एक glioblastoma mutliforme ट्यूमर (जीबीएम) कैंसर के साथ का निदान कर रहे हैं और सर्जरी के दौर से गुजर रोगी से प्राप्त की है.
- व्यवस्था न्यूरोसर्जरी टीम के साथ किया जाना चाहिए. न्यूरोसर्जन एक उपयुक्त आकार तंत्रिका स्टेम सेल (एनएससी) बेसल 10-15% एंटीबायोटिक दवाओं (/ Peniciline Streptomycine) के साथ पूरक मध्यम युक्त ट्यूब में resected जीबीएम ट्यूमर की जगह होगी. शीत मध्यम प्रयोगशाला द्वारा ऑपरेटिंग कमरे के लिए प्रदान की जानी चाहिए. वैकल्पिक रूप से, ठंड HEPES बफर न्यूनतम आवश्यक (हेम) मध्यम या फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के एंटीबायोटिक दवाओं के उच्च एकाग्रता के साथ भी इस उद्देश्य के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
- resected ट्यूमर ऊतक बर्फ पर प्रयोगशाला के लिए दिया जाता है और हुड के अंतर्गत रखा है.
2. एकल सेल सस्पेंशन में प्राथमिक ट्यूमर की हदबंदी
- मूल मध्यम / पीबीएस के अतिरिक्त बाज़ ट्यूब से निकाल दिया जाता है और नमूना 5-10m के साथ 2-3 बार धोया जाता हैपीबीएस / एनएससी बेसल मध्यम रक्त और मलबे को हटाने के लिए. पीबीएस Medium / निकाल दिया है और जीबीएम ट्यूमर ऊतक एक पेट्री डिश में रखा गया है.
- ऊतक छोटे - छोटे टुकड़ों में काट रहा है और trypsinization प्रक्रिया के लिए सतह क्षेत्र को बढ़ाने के लिए छोटे टुकड़ों में नहीं, 10 स्केलपेल ब्लेड के साथ कीमा बनाया हुआ है. नख़रेबाज़ ट्यूमर के आकार के आधार पर 1-3 मिनट लग सकते हैं.
- कीमा बनाया हुआ ऊतक पूर्व गर्म 0.05% एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में 10-15 मिनट के लिए trypsin EDTA के 3 5ml में trypsinized है. एक इलेक्ट्रॉनिक विंदुक एक 15ml फाल्कन ट्यूब में छोटे ट्यूमर के टुकड़े और trypsin हस्तांतरण करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
- सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा के लिए ऊष्मायन अवधि के बाद enzymatic trypsin प्रतिक्रिया को रोकने के लिए जोड़ा जाता है.
- Trypsin निष्क्रियता निलंबन pipetting ऊपर और नीचे कई बार द्वारा सुनिश्चित की है. फिर, निलंबन pelleted 5min के लिए 800rpm (110g) centrifuging से नीचे है.
- सतह पर तैरनेवाला खारिज कर दिया है और ऊतक टुकड़े बाँझ एनएससी बीए की 1ml में resuspended हैंसाल मध्यम. clumps धीरे से ऊपर और नीचे pipetting एक चिकनी दूधिया एकल कक्ष निलंबन हासिल की है जब तक (3-7 बार) द्वारा अलग हैं. pipetting चरणों की संख्या को सीधे कीमा बनाया हुआ ऊतकों में कणों के आकार पर निर्भर करता है. लंबी और जोरदार यांत्रिक पृथक्करण के रूप में यह कोशिका मृत्यु और क्षेत्र के गठन में एक कमी में परिणाम हो सकता है बचा जाना चाहिए.
- संयुक्त राष्ट्र के अलग टुकड़े और मलबे को हटाने के लिए, बेसल मध्यम के 10-15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ा जाता है और सेल निलंबन एक 40 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से एक 50ml ट्यूब में फ़िल्टर्ड है.
- फ़िल्टर निलंबन 5min पर 800rpm (110g) के लिए centrifuged है. सतह पर तैरनेवाला बाद में खारिज कर दिया है.
- Pelletted कोशिकाओं तो सेल गिनती के लिए पूरी एनएससी माध्यम से 1-2ml में resuspended हैं.
3. सेल गणना और चढ़ाना
- सेल निलंबन के 10 μL 1ml Eppendorf ट्यूब में 90 0.04% Trypan नीले रंग के μL करने के लिए जोड़ा जाता है.
नोट: अन्य उपयुक्त कक्ष diluमाहौल भी इस्तेमाल किया जा सकता है. - विंदुक और नीचे निलंबन मिश्रण. कोशिकाओं / trypan नीले रंग के मिश्रण के 10 μL hemocytometer को हस्तांतरित क्रम में सेल घनत्व गिनती.
- कक्ष पूरा एनएससी (एनएससी बेसल मध्यम और 09:01 के अनुपात में एनएससी प्रसार पूरक का एक मिश्रण) मध्यम 20ng/ml EGF, 10ng/ml bFGF और 1μl/ml के साथ 0.2% (2μg/ml) हेपरिन में पूरक में चढ़ाया जाता है उपयुक्त टिशू कल्चर वाहिकाओं. मध्यम के 5, 20 और 40 मिलीलीटर T25, T80 और T175 बोतल के लिए प्रयोग किया जाता है, क्रमशः. एंटीबायोटिक्स मध्यम करने के लिए 1:100 के एक एकाग्रता में जोड़ा जा सकता है संदूषण का मौका कम.
- कुप्पी एक मशीन सेट में 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 पर रखा गया है .
4. Passaging और जीबीएम व्युत्पन्न क्षेत्रों का विस्तार:
- जब neurospheres व्यास में 150-200 सुक्ष्ममापी की एक औसत आकार पर पहुंच गया, संस्कृति subculture के लिए तैयार है. प्रत्येक कुप्पी की सामग्री निकाल दिया है और एक उचित आकार बाँझ Tiss में रखाue संस्कृति ट्यूब, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 800 rpm (110 ग्राम) पर centrifuged.
- सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और गोली trypsin - EDTA 0.05% की एक मिलीलीटर में resuspended है.
- एक इष्टतम trypsinization को प्राप्त करने के लिए, सेल निलंबन 37 डिग्री 2-3 मिनट के लिए पानी के स्नान में सी incubated है. Trypsin गतिविधि रोकने सोयाबीन trypsin अवरोध करनेवाला के एक बराबर मात्रा सेल निलंबन के लिए जोड़ा जाता है और सेल निलंबन धीरे pipetted है और नीचे.
- सेल निलंबन 5 मिनट के लिए 800 rpm (110g) पर centrifuged है. फिर, सतह पर तैरनेवाला हटा दिया है और कोशिकाओं एनएससी माध्यम से 1 मिलीलीटर में resuspended हैं.
- एक सेल गिनती के रूप में पहले वर्णित किया जाता है.
- कोशिकाओं को पूरा एनएससी मध्यम में 5x10 4 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता के साथ पूरक वृद्धि कारक है और उपयुक्त आकार टिशू कल्चर पिछले भाग में वर्णित के रूप में जहाजों में चढ़ाया पर चढ़ाया जाता है.
- माध्यमिक neurospheres 7-10 दिनों में गठन कर रहे हैं जब 37 डिग्री सेल्सियस incubated में एक नम5% सीओ 2 के साथ ified इनक्यूबेटर .
5. प्रतिनिधि परिणाम:
एकल जीबीएम ट्यूमर ऊतक से काटा कोशिकाओं चढ़ाना के बाद, ट्यूमर स्टेम कोशिकाओं की तरह पैदा करना और 3-4 दिनों में कुछ कोशिकाओं से बना (वीडियो और चित्रा 1 देखें) कोशिकाओं के छोटे समूहों उत्पन्न. के रूप में इन समूहों के होते हैं, वे 150-200 माइक्रोन प्रपत्र (देखें वीडियो और चित्रा 2) के एक औसत व्यास के साथ इतना है कि 7-8 दिनों से अधिक गोलाकार आकार, उचित चरण उज्ज्वल क्षेत्रों का अधिग्रहण. उच्च बढ़ाई, स्वस्थ क्षेत्रों को आम तौर पर अपनी परिधि में microspikes दिखाना है. 1-2 दिनों में समूहों की तरह बड़े क्षेत्र होने संस्कृति दीक्षा के बाद गैर - अलग clumps की संस्कृति का binging के अस्तित्व के कारण है और सच क्षेत्रों के रूप में गलत नहीं चाहिए. प्राथमिक ट्यूमर क्षेत्र संस्कृति में मलबे की राशि ऊतक के प्रारंभिक स्रोत पर निर्भर करता है और चाहे या नहीं यह किसी भी आसपास के मस्तिष्क के ऊतकों में शामिल हैं. उचित ऊतक तैयारी तकनीकमध्यम के लिए पर्याप्त राशि के साथ enzymatic और यांत्रिक पृथक्करण, और नमूने के बाद निस्पंदन सहित संस्कृति में कम मलबे में परिणाम कर सकते हैं.
चित्रा 1 4 दिनों के चढ़ाना के बाद प्राथमिक जीबीएम क्षेत्र संस्कृति. ट्यूमर स्टेम तरह कोशिकाओं पैदा करना और कोशिकाओं के 3-4 दिनों में छोटे समूहों उत्पन्न. मूल आवर्धन, 20x.
चित्रा 2 चढ़ाना के बाद 8 दिन एक जीबीएम क्षेत्र संस्कृति पारित . मूल आवर्धन, 20x.
Discussion
सामान्य वयस्क और भ्रूण दिमाग 1, 2, 3, 4 से तंत्रिका स्टेम और पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं को अलग और भी ट्यूमर स्टेम 5 फेफड़े, प्रोस्टेट 6, 7 स्तन और मस्तिष्क 8, 9 के रूप में कैंसर के ऊतकों से कोशिकाओं की तरह neurosphere परख किया गया है अक्सर पसंद की विधि के रूप में इस्तेमाल किया. पूर्व vivo multipotency, आरोपण पर नए ट्यूमर बनाने की क्षमता, और आत्म नवीकरण, यह सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परख का प्रयोग, एक resected ट्यूमर ऊतक कोशिकाओं से है कि दैहिक स्टेम कोशिकाओं के रूप में इसी तरह की विशेषताओं को दिखाने का एक अनिश्चित संख्या उत्पन्न कर सकते हैं. इन कोशिकाओं को बुनियादी कैंसर कोशिका जीव विज्ञान सेल करने वाली सेल बातचीत, और भेदभाव, प्रवास, आक्रमण और कोशिका मृत्यु सहित अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, पृथक ट्यूमर स्टेम कोशिकाओं की तरह ट्यूमर के रूप में, प्रगति और पतन भी कैसे और अध्ययन अंतर्निहित पाने सेलुलर तंत्र है कि अंततः चिकित्सकीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता को जानने के लिए एक अमूल्य उपकरण प्रदान करते हैंविकल्प.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
प्रेस्टन ए वेल्स जूनियर केंद्र ब्रेन ट्यूमर थेरेपी के लिए, यह काम फ्लोरिडा ब्रेन ट्यूमर अनुसंधान के लिए केंद्र से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| NeuroCult NSC Basal Medium (Human) | Medium | Stem Cell Technologies | 05750 | |
| NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human) | Medium supplement | Stem Cell Technologies | 05753 | |
| %0.05 trypsin-EDTA | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25300-062 | |
| *MEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 41500-018 | HEM component |
| *HEPES | Reagent | Sigma-Aldrich | H4034 | HEM component |
| *Distilled water | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15230-147 | |
| **DNase I | Reagent | Roche Group | 104159 | |
| **Soybean trypsin inhibitor | Reagent | Sigma-Aldrich | T6522 | |
| Pen/Strep | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| No. 10 scalpel blade | Surgical tool | BD Biosciences | 371610 | |
| Petri Dish | Culture ware | BD Biosciences | 353003 | |
| Small forceps | Surgical tools | Fine Science Tools | 11050-10 | |
| Cell strainer | Sieve | BD Biosciences | 352340 | |
| T25 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 136196 | |
| T80 flask | Culture ware | Nalge Nunc international | 178905 | |
| 15 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352096 | |
| 50 ml tubes | Culture ware | BD Biosciences | 352070 | |
| EGF | Growth factor | R&D Systems | 2028-EG | |
| b-FGF | Growth factor | R&D Systems | 3139-FB | |
| Heparin | Growth factor | Sigma-Aldrich | H4784 | Reconstituted in PBS |
| * To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C. | ||||
| ** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer. | ||||
References
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- Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells. Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).
- Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).
- Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay. J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).
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