Isolamento e Expansão da Human Glioblastoma Multiforme Células Tumorais Utilizando o Ensaio Neurosphere

Summary

Este protocolo vídeo demonstra o isolamento e expansão de células-tronco como de mutliforme glioblastoma humano ressecado cirurgicamente (GBM) tecido tumoral utilizando o método de cultura neurosphere ensaio.

Abstract

-Tronco como células foram isoladas em tumores como mama, pulmão, cólon, próstata e cérebro. Uma questão crítica em todos estes tumores, especialmente em mutliforme glioblastoma (GBM), é identificar e isolar a população de células tumorais iniciar (s) para investigar o seu papel na formação de tumores, progressão e recorrência. Tumor compreensão iniciar populações de células irá fornecer pistas para encontrar abordagens terapêuticas eficazes para estes tumores. O ensaio neurosphere (NSA), devido à sua simplicidade e reprodutibilidade tem sido utilizado como o método de escolha para isolamento e propagação de muitas das células tumorais isso. Este protocolo demonstra o método de cultura neurosphere para isolar e expandir-tronco como células no tecido humano ressecado cirurgicamente GBM tumor. Os procedimentos incluem uma digestão química inicial e dissociação mecânica do tecido tumoral e, posteriormente, chapeamento da suspensão de células resultantes único da cultura NSA. Após 70-10 dias, neurospheres primária de 150-200 m de diâmetro podem ser observadas e estão prontos para mais passaging e expansão.

Protocol

1. Coleta de Tecido GBM primário

1. A glioblastoma mutliforme tumor (GBM) é obtido a partir de um paciente diagnosticado com o câncer e submetidos a cirurgia.
2. Providências devem ser feitas com a equipe de neurocirurgia. O neurocirurgião vai colocar o tumor ressecado GBM em um tubo de tamanho apropriado que contém células-tronco neurais (NSC) meio basal suplementado com antibióticos 10-15% (Peniciline / estreptomicina). Meio frio deve ser fornecida à sala de cirurgia por laboratório. Alternativamente, frio HEPES-buffered meio mínimo essencial (HEM) ou tampão fosfato salino (PBS) com alta concentração de antibióticos também pode ser usado para esta finalidade.
3. O tecido do tumor ressecado é entregue ao laboratório em gelo e colocado sob o capô.

2. Dissociação do tumor primário em uma única célula Suspensão

1. Excesso do meio original / PBS é removido do tubo falcon ea amostra é lavado 2-3 vezes com 5-10ml de PBS / NSC meio basal para remover o sangue e detritos. A PBS / Medium é removido eo tecido do tumor GBM é colocado em uma placa de Petri.
2. O tecido é cortado em pedaços pequenos e picada com uma lâmina de bisturi n º 10 em pedaços pequenos para aumentar a área de superfície para o processo de tripsinização. Picadura pode demorar alguns minutos 1-3, dependendo do tamanho do tumor.
3. O tecido é picada tripsinizados em 3-5ml de pré-aquecido 0,05% tripsina-EDTA por 10-15 minutos em banho-maria a 37 ° C. Uma pipeta eletrônico é usado para transferir as peças de tumor pequeno e tripsina em um tubo Falcon 15ml.
4. Um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionada para parar a reacção enzimática de tripsina após o período de incubação.
5. Inativação da tripsina é assegurada por pipetagem de suspensão para cima e para baixo várias vezes. Então, a suspensão é peletizada para baixo por centrifugação a 800rpm (110g) para 5min.
6. O sobrenadante é descartado e os pedaços de tecido são suspensas em 1 ml de estéril NSC bamédio sal. Os aglomerados são dissociados por pipetagem suavemente para cima e para baixo (3-7 vezes) até que uma suspensão de células lisas única leitosa é obtida. O número de etapas de pipetagem depende diretamente do tamanho das partículas no tecido picada. Longa e vigorosa dissociação mecânica deve ser evitado, pois pode resultar em morte celular e uma redução na formação de esfera.
7. Para remover un-dissociada pedaços e fragmentos, 10-15 ml de meio basal é adicionado ao tubo e da suspensão de células é filtrada através de um filtro celular 40 mícrons em um tubo de 50ml.
8. A suspensão é filtrada centrifugado a 800rpm (110g) para 5min. O sobrenadante é descartado depois.
9. Pelletted células são então ressuspenso em 1-2ml de meio de NSC completa para contagem das células.

3. Contagem de Células e Galvanização

1. 10 mL da suspensão de células é adicionado a 90 mL de 0,04% Trypan azul em um tubo eppendorf de 1ml.
   Nota: outras células diluição adequadações também podem ser usados.
2. Pipeta cima e para baixo para misturar a suspensão. 10 L das células / mistura de azul de tripano é transferido para hemocitômetro para contagem de densidade celular.
3. Células são banhados em meio NSC completa (uma mistura de NSC meio basal e complementar NSC proliferação em uma proporção de 9:1), suplementado com 20ng/mL EGF, bFGF e 10ng/ml 1μl/ml de heparina 0,2% (2μg/ml) em vasos de cultura apropriado tecido. 5, 20 e 40 ml de meio é usado para frascos T25, T80 e T175, respectivamente. Antibióticos podem ser adicionadas ao meio em uma concentração de 1:100 para diminuir chances de contaminação.
4. O balão é colocado em uma incubadora regulada a 37 ° C e 5% CO _2.

4. Passaging e expansão do GBM esferas derivados:

1. Quando o neurospheres chegou a um tamanho médio de 150-200 m de diâmetro, a cultura está pronta para subcultura. O conteúdo de cada balão é retirado e colocado em um tamanho adequado tiss estérilue tubo de cultura, e centrifugados a 800 rpm (110 g) por 5 min à temperatura ambiente.
2. O sobrenadante é removido eo pellet é ressuspenso em 1 ml de 0,05% tripsina-EDTA.
3. Para conseguir um ótimo tripsinização, a suspensão celular é incubada a 37 ° C em banho-maria por 2-3 min. Para interromper a atividade de tripsina um volume igual de inibidor de tripsina de soja é adicionada à suspensão de células e suspensão de células é suavemente pipetado cima e para baixo.
4. A suspensão celular é centrifugado a 800 rpm (110g) por 5 min. Em seguida, o sobrenadante é removido e as células são ressuspendidas em 1 ml de meio de NSC.
5. A contagem de células é realizada conforme descrito anteriormente.
6. As células são banhados em uma concentração de 5x10 ⁴ células / ml em meio NSC completo suplementado com fatores de crescimento e semeadas em vasos de tamanho apropriado de cultura de tecidos como descrito na parte anterior.
7. Neurospheres secundário são formados no dia 10/07 quando incubados a 37 ° C em um úmidoified incubadora com 5% de CO _2.

5. Resultados representativos:

Após o plaqueamento das células individuais colhidos GBM tecido tumoral, tumor de células-tronco como proliferar e gerar pequenos aglomerados de células composto por poucas células em 3-4 dias (veja o vídeo e Figura 1). Como estes grupos crescem, eles adquirem uma forma mais esférica de modo que, 7-8 dias, esferas fase adequada brilhante com um diâmetro médio de 150-200 formulário microns (Veja o vídeo e Figura 2). Na maior ampliação, esferas saudável geralmente demonstram microspikes em sua periferia. Tendo como grande esfera clusters em 1-2 dias após o início da cultura é devido à existência de não-dissociada aglomerados na binging da cultura e não deve ser confundido como esferas de fato. A quantidade de detritos na cultura esfera tumor primário varia de acordo com a fonte inicial de tecido e se é ou não inclui qualquer tecido cerebral circundante. Técnicas de preparação adequada do tecidoincluindo dissociação enzimática e mecânica, e posterior filtração da amostra com uma quantidade suficiente de médio pode resultar em menos detritos na cultura.

Figura 1. Esfera da cultura primária GBM quatro dias após o plaqueamento. Tumor-tronco como células proliferam e geram pequenos aglomerados de células em 3-4 dias. Ampliação original; 20x.

Figura 2. Passage uma cultura esfera GBM 8 dias após o plaqueamento. Ampliação original; 20x.

Discussion

Para isolar-tronco neurais e células progenitoras de adultos normais e cérebros fetal ^{1, 2, 3, 4} e também tumor-tronco como células dos tecidos do câncer, como pulmão ^{5, 6} de próstata, mama e cérebro ^{7 8, 9,} o ensaio foi neurosphere freqüentemente usado como o método de escolha. Com este ensaio simples e reprodutível, pode-se gerar um número indefinido de células do tecido do tumor ressecado que mostram características similares como células-tronco somáticas; multipotency ex vivo, a capacidade de criar novos tumores após o implante, e auto-renovação. Essas células poderiam ser usadas para estudar a biologia celular básica, incluindo câncer de célula a célula-interações, e, a diferenciação de migração, invasão e morte celular. Além disso, isolado tumor-tronco como células fornecem uma ferramenta valiosa para estudar como os tumores de forma, o progresso ea recaída e também para desvendar os mecanismos celulares subjacentes decorrentes que, eventualmente, poderiam fornecer insights para terapêuticaopções.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
NeuroCult NSC Basal Medium (Human)	Medium	Stem Cell Technologies	05750
NeuroCult NSC Proliferation Supplements (Human)	Medium supplement	Stem Cell Technologies	05753
%0.05 trypsin-EDTA	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25300-062
*MEM	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	41500-018	HEM component
*HEPES	Reagent	Sigma-Aldrich	H4034	HEM component
*Distilled water	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15230-147
**DNase I	Reagent	Roche Group	104159
**Soybean trypsin inhibitor	Reagent	Sigma-Aldrich	T6522
Pen/Strep	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
No. 10 scalpel blade	Surgical tool	BD Biosciences	371610
Petri Dish	Culture ware	BD Biosciences	353003
Small forceps	Surgical tools	Fine Science Tools	11050-10
Cell strainer	Sieve	BD Biosciences	352340
T25 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	136196
T80 flask	Culture ware	Nalge Nunc international	178905
15 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352096
50 ml tubes	Culture ware	BD Biosciences	352070
EGF	Growth factor	R&D Systems	2028-EG
b-FGF	Growth factor	R&D Systems	3139-FB
Heparin	Growth factor	Sigma-Aldrich	H4784	Reconstituted in PBS
* To make HEM, mix 1x10L packet of MEM and160ml of 1M HEPES and bring the volume to 8.75 L using distilled water. Set the final PH to 7.4 and store it at 4°C.
** To prepare trypsin inhibitor solution, first make 10 ml of DNase I solution (100 mg DNase dissolved in 100 ml of HEM) and then add 0.14 g of trypsin inhibitor to DNase solution and finally make the volume up to 1 Liter using HEM. Keep aliquots of the final products in -20°C freezer.