胎児マウスから海馬ニューロンの単離および培養

Summary

私達は非常にフィーダーグリア細胞層を使用せずに出生マウスの脳から海馬神経細胞の精製培養のためのプロトコルを提供しています。

Abstract

ラットおよびマウスの海馬ニューロンの初代培養は広く神経生物学で細胞メカニズムを明らかにするために使用されています。個々のニューロンを分離し、成長させることにより、研究者は細胞輸送、細胞の構造と生化学的な様々な技術を使用して、個々のタンパク質の局在化に関連するプロパティを分析することができます。このような実験の結果から、記憶や学習の神経基盤を扱う理論をテストするために重要である。しかし、実験のこれらの形態から明白な結果は、他の脳細胞の種類によって最小汚染と神経細胞の培養物を成長させる能力を前提としています。このプロトコルでは、我々は、汚染の細胞タイプ（すなわち、アストロサイト）を最小限に抑えながら、健全な神経細胞の成長を最適化するために、ニューロンの成長と胚の海馬組織を慎重に解剖用に設計された特定のメディアを使用しています。マウス胎児海馬組織は、ジのサンプルの大きさのために類似したげっ歯類の組織より単離することが難しくなる可能性がありますssection。我々は、胚性19日目（E19）仔マウスから海馬の詳細な解剖の技術を示しています。一度海馬組織が分離されている個々のセルに最小ダメージを提供しながら、神経細胞の穏やかな解離は、トリプシンと結合組織から独立した細胞に設計された機械的破壊の希釈濃度で達成されます。混乱に使用するピペットを準備する方法の詳細な説明が含まれています。最適なメッキ密度が成功した細胞培養を最大化するための免疫蛍光のプロトコルのために用意されています。プロトコルは、マウス海馬組織から神経細胞の培養のための、高速（約2時間）と効率的な手法を提供しています。

Protocol

1。収穫前のセットアップ

1. ニューロンの収穫のために出生前の子犬を生成するために、前ニューロンの分離日〜19日成体マウスの間で繁殖をスケジュールします。 （C57BL / 6マウスの年齢2から8月は、このプロトコルを開発する目的のために交配に使用された）。成功した交配、妊娠中の女性、動悸や視覚的な確認に膣栓を検出することによって確認することができます。
2. ニューロンの分離に先立っ日：
   1. のために免疫蛍光アプリケーション、3:1コラーゲン1、ラットテールの光コーティングを施した24ウェルプレートにコートカバーガラス：ポリ-D-リジンソリューションを提供します。
   2. 細胞培養アプリケーションのための、3:1コラーゲン1、ラットテールの光コーティングを施したコート、適切なサイズの組織培養プラスチック食器：ポリ-D-リジンソリューションを提供します。
3. 一晩紫外光下での組織培養フード内で明らかにプレートを置きます。
4. 前の無菌ハンクスバランス塩溶液（HBSS）でプレートを洗浄使用します。コー​​トしたプレートをHBSSで満たされ、暗闇の中で4℃で一週間まで保存することができます。

2。組織の収穫

1. 不妊は、常にプライマリ培養細胞の成長因子であり、そのように、最大​​限の注意は、ほとんどの無菌環境を可能に確保するために行使されるべきである。無菌操作には十分注意して、このプロトコルのための神経組織の最初の解剖と収穫は、汚染の最小限のリスクで層流フードの外側に完了することができます。最初の収穫後、後続のすべてのステップは、細胞培養の定格ボンネット内の最大無菌条件下で行われるべきである。
2. 断頭により約19日後に受精で妊娠したマウスを安楽死させる。麻酔が（Stratmannら、2010）脳の細胞死を引き起こすことが知られているように妊娠したメスを安楽死させるために麻酔の使用は推奨されていません。滅菌解剖ハサミとピンセットを使用して、の中間腹側の開口部を作成するマウスは完全に体腔を明らかにする。インスツルメンツは、アルコールと火気を使用して滅菌することができる。
3. 出生仔マウスの体腔の後部に向かって配置され、子宮に簡単に表示されるはずです。オートクレーブ滅菌したピンセットで、子宮を開いて、子犬を削除します。解剖顕微鏡下で滅菌ガーゼで頭を除去し、新鮮な滅菌はさみと場所で子犬を首をはねる。滅菌、高圧蒸気滅菌装置は、炎、アルコールとの前に裸火を使用して洗浄し、使用中にすることができます。
4. 首の後ろから鼻に滅菌ハサミまたは子犬のメスは、オープン頭蓋を使用します。この手順は、通常、椎孔にはさみのワンチップを挿入して、前方に進んで完了することができます。慎重にピンセットで脳全体を削除します。滅菌ガーゼ上に脳を配置します。滅菌メスを用いて、小脳を取り外し、2つの半球（ 図1）にそれを分離するために脳の正中線を切開 。
5. 滅菌ピンセットで海馬を取り巻く髄膜の小さなセクションをつかみ、静かに引き出します。これは厳密には海馬を分離する前に、髄膜を除去する必要はありませんが、髄膜の存在は、膜の靭性に起因する海馬の解剖がより困難にすることができます。髄膜が除去された後、いずれの場合も、海馬がより明確に見えるようになります。海馬は半球と腹曲げます（ 図2）の遠位部で開始され湾曲した構造である。内側の、凹面側（尾）が心室に直面しているとして、それはすでに無料です。したがって、海馬を分離するために、1つは、凸の外側に沿って切断する必要があります。解剖した後、穏やかに細胞培養フードの下（37℃）HBSS温め小さな組織培養皿に無菌の組織鉗子、転送、各海馬を持ち上げます。脳組織は、複数の子犬を組み合わせることができます。

"> 3。組織解離

1. 滅菌メスを用いて、穏やかに100mmの組織培養ディッシュの滅菌HBSS 3ml中で脳組織をミンチ。
2. 15 mlコニカルチューブにみじん切りにした組織とHBSSを転送します。 HBSS 1.5 mlおよび5 mlの全体積の0.25％トリプシン溶液0.5mlを追加します。
3. キャップと穏やかに4-5回は、混在させるチューブを反転させます。消化された組織から放出されるDNAは気泡に付着し、みじん切りにした組織が ​​チューブの底部（ 図3）へのセトリングの代わりにフロートするようになりますように気泡を生成しないようにしてください。
4. 5分ごとに上記のように、15分間37℃で反転チューブを海馬組織をインキュベートします。
5. 組織がチューブの底に沈殿することができます。
6. 慎重にチューブの底に邪魔されずに組織を残して、滅菌ピペットを用いて余分な溶液を除去します。
7. 5分間37℃HBSS 5mlで組織ペレットを洗浄します。合計3回繰り返します。組織が完全に解決することができ次の洗浄工程に進む前に、毎回チューブの底に。
8. 組織ペレットから最終的な洗浄を削除し、新鮮なHBSS 2mlのと交換してください。

4。ニューロン粉砕

1. 粉砕の手順を開始する前に、火災洗練されたパスツールピペットを準備する必要があります。 Bunsonバーナーを使用して、ピペットの開口部の直径が（ 図4b）わずかに四捨五入されているサイズとピペットの開口部の縁に約0.5 mmになるまで火炎中で無菌の9インチのパスツールピペットの先端（ 図4a）を保持する 。粉砕プロセスを開始する前に、完全にクールにピペットを許可します。
2. 通常の滅菌9インチのパスツールピペットを使用して、そっとティッシュを7回の合計をひいて粉にする。大きい組織片は、この時点で正常であり、前の次のステップに移動するにチューブの底に沈降させなければなりません。
3. 新鮮な滅菌50 mlコニカルチューブに上清を移します。
4. 残りのすべての大きい組織片がチューブの底に沈殿し、4ミリリットル解離神経細胞の合計は、前の上清上清組み合わせることができます。

5。細胞のプレーティング

1. 血球計算板を用いた解離細胞をカウントします。
2. 一般的なルールとして、一度セル番号が決定されている、メッキ後に発生する可能性があり、任意の細胞死を考慮して最終的な数値から20％を減算します。
3. 細胞は、以下の推奨事項を使用してめっきすることができる。
   24ウェルプレートでカバースリップのために- 6×10 ⁴細胞/ウェル0.5mlの
   3ミリリットルの4×10 ⁵細胞/プレート- 60mmの組織培養プレート用
   100mmの組織培養プレートのために- 6×10 ⁶細胞/プレート6 mlの
4. Neurobasalめっきメディア（Neurobasalの指定されたボリュームで適切な細胞数を混在させるB27サプリメントを含む培地[1ミリリットル/ 50ミリリットル]は、0.5 mMのグルタミン溶液、25μMグルタミン酸（氏は147.13グラム/モル）、ペニシリン（10,000単位/ ml）/ストレプトマイシン（10,000μg/ ml）を[250 /μlの50ミリリットル] 、1mMのHEPES（氏は238.3グラム/モル）、10％の熱不活性化ドナーウマ血清）、プレートにセルを追加。渦巻板は穏やかに均等に細胞を分散します。 HI-ドナーウマ血清、成長の最初の24時間の間に細胞を濃縮するめっきメディアに追加されます。細胞は、その後、血清から引き離されると、各メディア交換時の血清のシリアル還元することにより無血清環境に戻りました。それが高濃度でグルタミン酸はここで追加された低濃度で、神経細胞の培養に有毒であるが、それは非神経細胞¹¹の付着を阻害することにも留意すべきである。しかし、それは唯一の細胞の神経毒性を防止するために、任意の餌メディアから取り残さ文化やその後の最初の24時間のめっきメディアに追加する必要があります。
5. P5％CO ₂インキュベーターで一晩37℃でニューロンを、レース。
6. 細胞からのメディアの半分のボリュームを削除しNeurobasal摂食媒体の同じボリュームに置き換えます（B27サプリメントを含むNeurobasalメディア[1ミリリットル/ 50ミリリットル]は、0.5 mMのグルタミン溶液、ペニシリン（10,000単位/ ml）/ストレプトマイシン（10,000μgの/ ml）を[250 /μlの50ミリリットル]、1 mMのHEPES（氏は238.3グラム/モル）。
7. ニューロンは、古いメディアの半分を除去し、新鮮なNeurobasal摂メディアの同じボリュームでそれを置き換えることにより、4日ごとに供給する必要があります。神経プロセスは、1日目（ 図5a）の上に見えると10日目（ 図5b）によって普及を開始する必要があります。

6。代表的な結果

成長する能力と文化の主要な神経細胞は、神経科学の不可欠な一部となっています。初代培養では、研究者は、特定の細胞経路を分析するために化学修飾と治療、ターゲットLOCを許可する制御された環境でalizationと成長パターン。これらの手順の多くは、細胞応答における特定の変化を視覚化するための洗練された方法論を活用しています。このケースでは、海馬ニューロンは、無傷の脳で分析することは困難、不可能でないと証明する特定の神経経路を研究するために使用されています。脳の特定の領域からのニューロンの近くに均質な集団の調製は、脳機能を研究するために重要です。個々のニューロン内の分子の影響は、メモリや学習などの高次の経路の輪郭を描くに尽力することができます。このプロトコルは、グリア細胞のフィーダー層を必要とせず、海馬ニューロンの比較的純粋な文化をもたらしたように、これらのニューロンは、簡単に免疫蛍光研究のために利用されています。ただし、複数の細胞型を含む臓器からのすべての初代培養と同様に、以下の所望の細胞によっていくつかの汚染が発生する可能性があります。神経細胞の分離では、グリア細胞による汚染は、一般的な問題になる可能性があります。グリア細胞Cその形態は、ターゲットニューロン（ 図6）から大幅に異なるため、容易に文化の顕微鏡可視化時に検出することができます。グリア細胞の混入の影響は、文化の計画された使用に依存します。細胞は、免疫蛍光検査のために使用されている場合は、グリア細胞の汚染は、個々のニューロンを撮影しようとして不便以外の何ものでもすることはできません。神経細胞の培養が生化学分析のために使用される場合は、グリア細胞による有意な汚染が結果に大きな変化を引き起こす可能性があります。グリア細胞の汚染に対処する方法は、議論の中でさらに説明されています。

一度神経細胞が正常に分離し、培養で増殖されているが、1典型的なアプリケーションでは、免疫蛍光技術の細胞過程を調べることです。 図7に示すように、このようなミトコンドリアなどの細胞小器官は、修正する前に培地に追加された重要な染料を用いて染色することができますation。内因性細胞タンパク質は、標準的な免疫蛍光技術（ 図8）を使用して固定された細胞から視覚化することができます。一度神経細胞が固定され、目的のタンパク質に特異的な抗体は、細胞に導入することができ、これらのタンパク質は蛍光顕微鏡を用いて可視化することができます。培養神経細胞はまた、神経機能の個々のタンパク質の影響を調べるために手段を研究者を提供しています。 DNAトランスフェクション、エレクトロポレーションまたはウイルスの伝達などの様々な技術を使用して、タンパク質は神経細胞（ 図9）で過剰発現することができます。どのように神経細胞が過剰発現したタンパク質の影響に対応する脳が応答して薬物治療のための細胞標的を識別するための可能性を提供することがどのように直接的な推論をすることができます。実験でこれらの種類の詳細については本稿の範囲を越えて行くが、彼らはこの技術により調製文化がダウンsの広い配列に適していることを示していないtreamアプリケーション。しかし、このプロトコルの全体的なシンプルさは、同様に、これらの神経細胞の培養を準備するために必要な短い期間は、この今日の神経科学研究室で使用するための理想的な方法を確認します。

図1出生前のマウスの脳の解剖。最初の切開は、2つの半球にそれを分離脳の正中線ダウンしています。

図2出生前のマウス脳内の海馬の場所。線条体、海馬を可視化するために脇に移動され、各半球の遠位領域内の湾曲した "インゲン豆"タイプの構造によって記載されています。

図3。トリプシン溶液中での海馬組織の解離。

図4：パスツールピペットのヒントは、海馬組織の粉砕に使用されます。 （1）通常のパスツールピペットの先端。 （b）のファイアーポリッシュパスツールピペットの先端。丸みを帯びたエッジとピペットの開口部の大きさの約50％の減少に注意してください。

図5は、この手順およびNBメディアでメッキを用いて単離海馬ニューロン。 （a）細胞の増殖1日後にメッキ。神経プロセスは、1日目に見えるように開始します。 （b）セルの成長10日後にメッキ、神経突起は分岐と重複している。

図6。7日間培養したグリア細胞で汚染されたとオルガネラマーカーMitoTrackerのレッドCM-H2XRos（Invitrogen社＃M7515）とtransfeで染色した海馬ニューロンリポフェクトアミン2000（Invitrogen社＃11668019）を用いてGFP-LC3とCTED。ミトコンドリアはすべてのセルで表示されているしかし、単一のニューロンが正常に蛍光構築物でトランスフェクトした。グリア細胞の混入を視覚化するのが難しい神経突起におけるGFP-LC3の発現解析を行います。

図7海馬ニューロンは、7日間増殖させ、細胞小器官マーカーMitoTrackerのレッドCM-H ₂ XRos（Invitrogen社＃M7513）で染色した。この重要な色素は、組織培養細胞に積極的にミトコンドリアを染色するために使用されます。細胞を4％パラホルムアルデヒド/ PBSで固定し、蛍光顕微鏡により可視化した。ミトコンドリアで酸化されるまで色素自体は非蛍光性である。アクティブなミトコンドリアは、ニューロンのプロセスを通して見ることができます。

図8。

図9。海馬ニューロンの培養は5日間成長し、リポフェクトアミン2000（Invitrogen社製＃11668019）を使用して構築したGFP-LC3βDNAトランスフェクションした。 7日目に、細胞は、その外膜に組み込まれたGFPタグ付きのLC3βで4％パラホルムアルデヒド/ PBSとaggresomesを使用して固定した蛍光顕微鏡を用いて可視化した。 Aggresomesは細胞体と神経突起全体に配置されており、矢印で示されます。

Discussion

海馬の培養は20年以上分子生物学で使用されている。原理的には、神経細胞培養物は、脳のどの部分から作ることができますが、海馬の培養物は、海馬⁷の神経細胞集団の比較的単純なアーキテクチャにより、最も人気があることが実証されています。海馬培養は、通常、後期胚組織から作られています。この組織は解離しやすくなり、成熟した脳組織¹よりも少ないグリア細胞が含まれています。胚組織からの海馬ニューロンの分離も少なく密着性の接触³に起因する軸索と樹状突起への剪断損傷を減少させます。海馬の培養は最も頻繁に海馬の比較的容易に分離によるラットから生成されていますが、マウスは、適切なケアは、組織の分離中に撮影された場合と同じプロトコルを使用することができます。かつてニューロンは、細胞内Lを分析するために高度な分子技術を使用する能力を培養するocalizationや人身売買を採用することができる。胚性致死トランスジェニックマウスを解析するときに、胚の死をもたらすでしょう蛋白質相互作用を研究するための機能を提供しますので、これは特に有利であることができます。

海馬は、空間や文脈学習の⁵とメモリ^6の両方に関与している。海馬からの初代培養の成長は、細胞内の生物学的事象と学習と記憶する脳の能力に及ぼす影響との相関関係を許可することができます。

すべての神経細胞と同様に、海馬の培養液から成長したニューロンが重要な成長因子、ホルモン、アミノ酸を必要とします。脳では、これらの要因は、グリア細胞によって提供されています。この共生関係は、培養神経細胞とともにグリア細胞の "フィーダー"層を成長させることにより培養環境に行うことができます。しかし、グリア細胞はまた、彼らの寿命は¹¹ワット時の細胞傷害性因子が生成されます。HICHは、培養神経細胞への毒性することができます。これを回避するためには、ニューロンがそのようなB27を添加したNeurobasal培地として無血清培地で栽培されています。 B27サプリメントは、海馬ニューロンの生存のために最適化されていますが、同様に他の^4つの神経細胞の培養物の増殖をサポートします。 L-グルタミンは、細胞培養でのエネルギー生産と蛋白質合成に必須のアミノ酸である。しかし、グルタミンはアンモニアと一度培地に追加されたカルボン酸の副生成物に分解する、時間をかけて不安定にすることができます。グルタミン、Invitrogen社から細胞培養サプリメントは、必要に応じてL-グルタミンの直接の代替として使用することができます。グルタミンは、メディアで、より安定したが、やや高価です。無血清培地におけるニューロンの成長は、神経細胞の成長と分化に及ぼす成長因子およびホルモンの影響の研究を可能にします。

我々はNeurobasalメディアを用いたマウス出生前の胚からの海馬ニューロンの迅速な分離のためのプロトコルとB27 supplemを提出フィーダー細胞を使用せずに、無血清環境でのニューロンの成長のためENT。すべての培養初代細胞のプロトコルと同様に、非所望の細胞タイプ（すなわち、グリア細胞）の増殖を最小限に抑えるために有利である。これは最も容易に脳の領域を周囲から海馬を慎重に解剖することによって達成される。出生前の細胞はまた、この目標を補助するグリア細胞の比較的小規模な番号が含まれています。しかし、グリア細胞の汚染は依然として発生する可能性があります。文化^8,9の初期の時点でのシトシンアラビノシド（AraCの）で処理することにより、グリア細胞の混入を低減することができる。 AraCのは、DNA合成が可能な非神経細胞の集団を減らすために抗有糸分裂剤として使用することができます。しかし、神経細胞の治療の可能性の毒性作用を避けるために、それは（5μM）を行い、その最小有効で使用し、文化¹¹の3-4日後に追加すべきではない。別のオプションでは、5 - フルオロ-2'-デオキシウリジン（FUDR）12月に治療の使用であろう線維芽細胞の反応性ミクログリア細胞¹⁰の割合をrease。

一度収穫し、海馬組織は、接着細胞を解離/非集計するために希薄トリプシン溶液で処理することができます。トリプシン溶液で時間が最も頻繁に3-5分の間に制限されていますので、しかし、トリプシンの高濃度に長時間曝露は、細胞の継代培養に有害であることができます。このプロトコルで使用されているトリプシンの希釈濃度は、酵素のインキュベーション時間が長くなり、個々の細胞の解離を増やすことができないが、注意が厳密に提供する時点に従うように注意する必要があります。パパインは、代替酵素として使用することができ、より効果的で、例えば¹⁰網膜神経細胞などの特定の組織と少ない破壊であることが証明されています。

細胞解離は、組織の粉砕が続いている。これは、一貫性のあるニューロンの文化の中で最も重要なステップであることが証明されており、二つの重要なpoinで強調表示されますTS。最初に、二つの滅菌パスツールピペットは、このプロセス中に使用されます。最初はひどく組織/細胞の関連付けを混乱させるために使用されます。この最初のピペットの開口部のサイズは1.0〜1.5ミリメートルの間でなければなりません。直接ベンダのパッケージからピペットを慎重に選択するには、通常、この最初の粉砕のために適切なピペットになる可能性があります。使用される第二パスツールピペットは、直径約0.5 mmの開口部のサイズを小さくするためにブンゼンバーナーの上に "ファイアーポリッシュ"です。彼らが通過するように細胞に機械的損傷を減少させる滑らかな表面に開口部のガラスリングを "研磨"で、これも結果。第二に、ピペットを介して粉砕の速度/力は非常に重要である。細胞は全体の組織から解離するように、彼らはもちろん、より脆弱である。したがって、この点は "ラフ"治療は、神経細胞の生存に有害であると思います。トリプシン処理した組織は、一貫したけど事務所の流量でピペットを介して継代する必要があります。目でよくある間違いeの研究者は残りのない識別可能な構造がなくなるまで完全に組織の関連付けを解除しなければならないという考え方です。細胞は、あまりにも繰り返し機械的操作によって損傷されるように、ほとんどの場合、これは巨大な神経細胞死になります。ピペットを介して組織を通過する回数の指定された数は、人口の総ダメージをもたらすことなく、神経細胞の十分な数になります。

一度細胞が解離するとプールされている、トリパンブルーは細胞のアリコートの染色死んだ細胞に住んでいるとの比を提供します。一般的に、細胞の75〜80％が収穫プロセスを生き残るべきであり、めっきに使用することができます。トリパンブルー染色は、血球計算板で行われ、正確な細胞数を取得するために使用することができます。実際には、総細胞数が達成されれば、合計20％を追加し、細胞死のおおよその量を考慮して、めっき、そのセル番号を使用します。上記のプロトコルで提供される番号が良いstartiです。ニューロンの良い密度を達成するためにNGポイント。ニューロン密度がメッキで低すぎる場合、播種密度は、細胞集団の増殖に重要な変数であるように、細胞の成長はおそらく十分ではありません。細胞はB27/Neurobasalフィードメディアと4日ごとに供給する必要があります。これらの条件下で神経細胞の成長は容易に文化の中で10-14日に行うことができ、80細胞/ mm ²で播種し培養で30日にニューロン^のうち^2つを伝播するために使用されています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rat Tail Collagen 1	BD Biosciences	354236
Poly-D-lysine Solution	Chemicon	A-003-E
Hanks Balanced Salt Solution	Invitrogen	14175-095
Trypsin Solution (1X) 0.25%, liquid	Invitrogen	15050-065
NeuroBasal Medium (1X) liquid	Invitrogen	21103-049
B27 Supplement (50X) liquid	Invitrogen	17504-044
L-Glutamine 200 mM (100X) liquid	Invitrogen	25030-149
Penicillin (10,000 units/ml) / Streptomycin (10,000 μg/ml)	Invitrogen	15140-148
HI-Donor Horse Serum	Atlanta Biologicals	S12150H