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Bioengineering

Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials

doi: 10.3791/3636 Published: January 25, 2012

Summary

Eine Beschreibung der Bildung eines Polymers unter Verwendung eines Mikroarray-on-Chip-Technik Photopolymerisation. Der hohe Durchsatz Oberflächencharakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie, Wasser Randwinkelmessungen, Röntgen-Photoelektronenspektroskopie und Flugzeit-Sekundärionen-Massenspektrometrie und einer Zellanhaftung-Assay wird auch beschrieben.

Abstract

Mischen ist eine Grundoperation, die zwei oder mehr Komponenten kombiniert zu einer homogenen Mischung. Diese Arbeit umfasst Mischen von zwei viskosen flüssigen Ströme unter Verwendung eines statischen Inline-Mischer. Der Mischer ist ein Split-and-rekombinieren Design, Scher-und Dehnströmung beschäftigt, um die Grenzflächen Kontakt zwischen den Bauteilen zu erhöhen. Ein Prototyp Split-and-rekombinieren (SAR)-Mischer wurde durch Ausrichten einer Reihe von dünnen lasergeschnittenen Poly (Methylmethacrylat) (PMMA) Platten an seinem Platz gehalten in einem PVC-Rohr ausgebildet ist. Mischen in dieser Vorrichtung ist in der Photographie in Abb. Ein. Rote Farbstoff wurde zu einem Abschnitt der Testflüssigkeit hinzugefügt und als Nebenkomponente in die größeren (ungefärbten)-Komponente gemischt. Am Eingang des Mischers wird der eingespritzte Schicht aus Tracer Fluid in zwei Schichten aufgeteilt, während es durch die Mischstrecke mündet. Bei jeder nachfolgenden Mischabschnitt, wird die Anzahl der horizontalen Schichten dupliziert. Letztlich wird die einzelnen Strom von Farbstoff gleichmäßig dispergiert throughout den Querschnitt der Vorrichtung.

Verwendung einer nicht-Newtonschen Prüffluid von 0,2% Carbopol und einem dotierten Tracer Fluid von ähnlicher Zusammensetzung, das Mischen in der Einheit visualisiert mittels Magnetresonanztomographie (MRT). MRT ist eine sehr mächtige experimentelle Sonde molekularen chemischen und physikalischen Umwelt sowie Probe-Struktur auf der Längenskala von Mikrometern bis Zentimetern. Diese Empfindlichkeit hat in breiten Anwendung dieser Techniken führte zu physikalischen, chemischen und / oder biologischen Eigenschaften von Materialien, angefangen von Menschen Lebensmittel zu porösen Medien 1, 2 charakterisieren. Die Anlagen und Bedingungen welche hier eignen sich zum Abbilden enthaltenden Flüssigkeiten erhebliche Mengen an mobilen NMR 1 H wie gewöhnliches Wasser und organische Flüssigkeiten, einschließlich Ölen. Traditionell MRI hat supraleitenden Magneten, die nicht geeignet sind für industrielle Umgebungen und nicht tragbaren innerhalb eines Labors (Abb. 2) eingesetzt. Jüngste Fortschritte in-Magnet-Technologie haben den Bau von großvolumigen industrietaugliche Magneten für bildgebende Prozessabläufe gestattet. Dabei sieht MRI räumlich aufgelösten Komponente Konzentrationen an verschiedenen axialen Stellen während des Mischprozesses. Diese Arbeit dokumentiert Echtzeit Mischen von hochviskosen Flüssigkeiten über distributive Mischen mit einem Antrag auf Körperpflegeprodukte.

Protocol

Ein. Herstellung von niedrig-Fouling Hintergrund

  1. Man wiegt 2 g Poly (hydroxyethylmethacrylat) (PHEMA) (Sigma - Zellkultur getestet) in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen. Man löst in 50 ml 95% (v / v) Ethanol in Wasser. Dies dauert in der Regel 24 Stunden nach Beschallung.
  2. Dip-coat epoxyfunktionelle Glasobjektträger (Genetix) mit dem pHEMA Lösung. Die Epoxidgruppen rasch bilden kovalente Bindungen mit dem pHEMA Beschichtung. Tauchbeschichtung durch Halten des Glasobjektträger mit Pinzette und Eintauchen der Folie in die Lösung erzielt. Typischerweise 5 mm des Schiebers ist unbeschichtet, was nützlich ist, zur Ausrichtung der Folie und kann auch als eine positive Kontrolle als haftende Oberfläche handeln. Der Schieber wird dann aus dem pHEMA Lösung über einen Zeitraum von 1 s zurückgezogen, invertiert und links, in einer nahezu waagerechten Position für 10 min vor dem Einbringen in eine Gleithalter trocknen.
  3. Die pHEMA beschichtete Objektträger werden dann unter atmosphärischen Bedingungen für 1 Woche links, um die vollständige Verdampfung t erlaubenEr Lösungsmittel.

2. Herstellung Monomerlösung

  1. Wiegen 120 mg der Photoinitiator 2,2-Dimethoxy-2-phenylacetophenon und fügen den 3 ml Dimethylformamid (DMF), um ein 4% (w / v) Photoinitiator Lösung herzustellen. Dies geschieht am besten frisch gemacht, bevor Sie den Druck beginnen, so dass die Masse und das Volumen der Lösung aus variiert werden, um anzupassen, wie viel Photoinitiatorlösung erforderlich ist. Die Lösung ist stabil bis zu einem Monat.
  2. Monomerlösungen werden durch Zugabe von 1 Teil des Photoinitiator-Lösung auf 3 Teile des reinen Monomer hergestellt. Dies wird durch Pipettieren 5 ul Photoinitiator Lösung und 15 ul Monomer in einen 384-Well-Source-Platte erreicht. Ein Gesamtvolumen von 20 ul ist ideal für Spot-Bildung. Höhere Volumina erfordern zusätzliche Blotting vor einheitliche Spots produziert werden können. Kleinere Mengen können in unvollständiger Beladung des Stiftes führen.
  3. Dieses Verfahren wird derzeit für die Verwendung von Acrylat / Methacrylat-Monomeren, die löslich in DMF durch vi begrenztRTUE davon die einzigen Kombinationen, die untersucht worden sind, Acrylamide und anderen Lösungsmitteln sind wahrscheinlich zugänglich des Druckprozesses. Zur Erreichung der Monomerkonzentration vorgeschlagen (75% w / w) flüssige Monomere sind auch erforderlich, wenn auch geringeren Monomerkonzentrationen für feste Monomere verwendet werden können (die reduzierte Monomerkonzentration scheint nicht nachteilig verändern die Oberflächenchemie des resultierenden Polymers ist es jedoch wahrscheinlich, dass das Molekulargewicht und die Glasumwandlungstemperatur wird verändert). Leichtflüchtige Monomere sind auch schwierig auf Grund der schnellen Verdunstung des Monomers vor zu verwenden, um die UV-Härtung Schritt bei der Polymerisation. Abhängig von der Anzahl der Monomerlösungen ein Lauf solange 6 Stunden und gegen Ende der Laufzeit flüchtigen Monomere nehmen kann, wird von der Quellenplatte verdampft. Verwendung von flüchtigen Monomere können durch Abkühlen der Druckvorstufe und mit kurzen Auflagen nur dann erreicht werden kann.
  4. Mit Ausnahme einiger weniger stark hydrophilen Monomerenwie Poly (ethylenglycol) acrylat, die Auflösung der resultierenden Polymer-Spots in wässrigen Puffern wurde nicht beobachtet, so ist die Verwendung eines vernetzenden Monomers nicht erforderlich, obwohl nicht ausgeschlossen ist.

3. Polymer Microarray Bildung

Die typische Vorgehensweise für Polymer Microarray Bildung ist schematisch in Abbildung 1 dargestellt.

  1. Microarray Bildung wird durch eine Berührung Roboter (Biodot) mit einem XYZ Stufe (Abbildung 2). Spannstifte von 220 Mikrometer Durchmesser verwendet werden (Arrayit 96B). Alle Pins sollten durch Beschallung in Dichlormethan für 10 Minuten vor dem Auflagendruck und ebenso die Pin-Halter sollte auch gereinigt werden gereinigt werden.
  2. Stifte werden in den Halter geladen ist, Blotting und Array Folien eingelegt und dann die gesamte Kammer ist mit Argon gefüllt, um den Sauerstoffgehalt auf unter 2000 ppm, der ausreichend niedrig, um Quenchen der Polymerisation Reste durch Sauerstoff zu vermeiden. Die Luftfeuchtigkeit ist maintained bei 30-40%. Einschließlich Feuchtigkeit ermöglicht die pHEMA anzuschwellen Berücksichtigung des gebildeten Polymers die pHEMA Schicht durchdringen und sich physikalisch an der Oberfläche 2 eingeschlossen.
  3. Die Auflage ist begonnen. Jeder Lauf besteht aus:
    • Lädt Probe von Source-Platte. Die Stifte werden in die Lösungen mit einer Geschwindigkeit von 25 mm / s, in Lösung für 2,5 s gehalten abgesenkt und dann zurückgezogen bei einer Geschwindigkeit von 25 mm / s (Abbildung 2).
    • Stifte müssen vor der Ausgabe auf Monomerlösung von der Außenseite des Zapfens zu entfernen geblottet. Anschließend Monomer Lieferung erfolgt aus dem quilled Teil des Stiftes, um konsistente Spot-Bildung zu erreichen. Das Blotting Sequenz verwendet besteht aus 33 Kontakte mit einem sauberen Objektträger aus Glas. Für die ersten vier Positionen die Anzahl der Kontakte hergestellt ist 10, 5, 4 bzw. 3 dargestellt. Die nächsten vier Positionen 2 Kontakte geknüpft und in den letzten 3 Positionen 1 Kontakt hergestellt ist. Insgesamt Kontaktzeit für jeden Kontakt ist 10 ms, Ansatz und Abzugsgeschwindigkeit beträgt 175mm / s. Von diesem Punkt die Flecken gebildet haben sollte eine einheitliche Form und Geometrie. Failure an diesem Punkt zeigt unsauberen Nadeln oder Staub Verunreinigung in den Monomer-Lösungen.
    • Die Monomerlösungen werden dann auf den pHEMA beschichtete Glasobjektträger (Abbildung 2) gedruckt. Ein Kontakt wird pro Spot an einem Pin Bewegung von 175 mm / s durchgeführt und Kontaktzeit von 10 ms, die in Abhängigkeit von der Viskosität und Oberflächenspannung der Monomerlösung ergibt eine durchschnittliche Fleckdurchmesser von 400 um. Typischerweise 3 replizieren Arrays sind auf jedem Objektträger gedruckt und insgesamt 10 gleitet auf einem einzigen Durchlauf gedruckt. Dies entspricht 30 Punkten pro Zyklus.
    • Pins werden in DMF gewaschen. 2,5 l frischem DMF wird für den gesamten Wasch Lauf bereitgestellt. Pins sind in einem Flow Bad mit Agitation gewaschen.
    • Gleichzeitig mit dem Waschen werden die frisch bedruckte Objektträger mit einer kurzwelligen UV (365 nm)-Quelle mit einer Dichte von 30 mV / cm 2 für die Dauer der Periode, die der Wäsche 30 s dauert bestrahlt.
  4. Aach alle Monomerlösungen gedruckt die Arrays mit UV (365 nm) werden für weitere 10 min bestrahlt.
  5. Die druckfrische Arrays werden bei niedrigem Druck (<50 mTorr) für 1 Woche gehalten, um unpolymerisierten Monomeren und Lösungsmittel zu entfernen.

4. Hoher Durchsatz Charakterisierung von Oberflächen (HTSL)

Ein allgemeines Schema der HTSL-Techniken ist in Abbildung 3 dargestellt. Zentral für die automatisierte, Hochdurchsatz Ansatz ist die Ausrichtung des Polymers Microarray mit der Charakterisierung Vorrichtung. In allen Fällen wird durch eine Kamera, die eine Draufsicht des Arrays gibt. Anfänglich ist die Anordnung gedreht wird, um mit der XY-Bewegung der Bühne auszurichten. Eine Ecke Stelle des Array wird dann entfernt und bezeichnet bestimmte Koordinaten. Die Position jedes Polymer Spot kann dann unter Verwendung der vorhergesagten Abmessungen des Arrays werden.

  1. Wasser Randwinkel (WCA) Messungen
    1. WCA Messungen durchgeführt werden unter Verwendung der Methode des liegenden Tropfens auf einerautomatisierte Krüss DSA 100 Instrument. Eine einzelne Wassertropfen mit einem Volumen von ~ 400 pL abgegeben wird unter Verwendung eines piezogetriebenen Druckkopf auf jedem Polymer Spot. Der Durchmesser eines Polymers Ort ist typischerweise 300 um und der Basisdurchmesser des Wassertropfens auf dem Polymer Ort ist typischerweise 100 um somit nur eine Messung pro Polymer Ort erhalten werden können.
    2. Einen XY-Tisch ermöglicht die automatisierte Positionierung jedes Polymer Stelle unter dem Druckkopf 7. Dies wird erreicht durch eine Kamera oberhalb der Probe, die eine Draufsicht auf die Anordnung bietet gelegen. Zunächst muss der Kameraposition verstellt, um die Abgabe des Wassertropfens auf die Mitte der Kameraansicht auszurichten und dann das Array kann zu dem Druckkopf auszurichten.
    3. Ein Hochgeschwindigkeits-Kamera das Seitenprofil des Tröpfchens beim Auftreffen auf die Oberfläche und anschließendes Eindampfen. Der Rahmen, der die anfängliche Wirkung der Tropfen erfasst wird verwendet, um den Kontaktwinkel zu messen. Ein Kreis wird auf den Rückgang profi ausgestattetle und der Kontaktwinkel anschließend bestimmt.
  2. Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry (ToF-SIMS)
    1. Die Probe wird auf die Bühne geladen. Dies beinhaltet zunächst säumen die Bühne mit sauberen Al-Folie, die mit Ladungsausgleich hilft, und dann hält die Folie an Ort und Stelle durch die Verwendung von Metall-Schraube Registerkarten.
    2. Probentisch in die Schleusenkammer der ToF-SIMS gegeben und zu pumpen, bis 1,6 × 10 -6 mbar. Die Probe wird dann auf die Hauptanalyse Kammer, die typischerweise einen Vakuumdruck von 1,0 × 10 -8 mbar übertragen.
    3. ToF-SIMS Messungen werden durchgeführt unter Verwendung eines Ionen-ToF IV Instrument betrieben Verwendung eines monoisotopische Bi 3 + Primärionenquelle bei 25 kV im "gebündelten Mode" betrieben. Gepulster 1 pA primären Ionenstrahls über dem Analysebereich gerastert, mit positiven und negativen Sekundärionen von einem 100 × 100 um Fläche jedes Polymer Fleck in dem Mikroarray für eine 10-Sekunden gesammeltzweiten Messzeit. Ion Massen wurden mit einer hohen Auflösung Time-of-Flight-Analysator ermöglicht genaue Masse Zuordnung. Der typische Massenauflösung (bei m / z 41) knapp über 6000. Niederenergetischen Elektronen (20 eV) wurden verwendet, um für Oberflächen Ladung durch die positiv geladene primären Ionenstrahls auf den isolierenden Oberflächen 8 zu kompensieren.
  3. Atomic Force Microscopy (AFM)
    1. Eine große Bühne AFM mit einem automatisierten Stufe wird zum Analysieren der Arrays auf dem Glasobjektträger erforderlich. Eine Dimension oder ICON-Mikroskop ist ideal für diesen Zweck.
    2. Die Probe wird auf der Bühne platziert und Bühne Position auf rechten oberen Ecke des Arrays referenziert.
    3. Die Position der unteren linken Ecke des Arrays gefunden wird, ermöglicht, die die Position aller anderen Spots zu interpolieren.
    4. Eine Position Liste erzeugt und in das Auto-Sampling-Funktion der Software.
    5. AFM Messungen durchgeführt werden mit einem Nanoscope 3000A Instrument bei der Erschließung modE. Siliziumspitzen mit einer Resonanzfrequenz von etwa 300 kHz und einer Kraftkonstante von 40 N / m verwendet werden (Tap300Al, Budget-Sensoren). 5x5 um Regionen des Polymers werden 9 gemessen.
    6. Der root mean square (RMS) Rauheit in dieser Region wird für jedes Bild mit SPIP Stapelverarbeitung Software gemessen. Jedes Bild wird zunächst abgeflacht vor Rauheitsmessungen.
    7. Alle Bilder erfordern eine manuelle Betrachtung zur Bildgebung Artefakte, die müssen von Rauheitsmessungen entfernt werden, zu identifizieren. Während dieses Schrittes Bilder können auch auf der Grundlage gemeinsamer Oberflächenmerkmale 9 kategorisiert werden.
  4. Röntgen-Photoelektronenspektroskopie (XPS)
    1. Ein Mikroarray Folie wird auf eine Probe bar mit doppelseitigem Klebeband befestigt und anschliessend in die Probenkammer aus einem Kratos Achse ultra XPS Instrument geladen.
    2. Geben Sie in den Probenraum und warten, bis es einen Druck unter 10 -8 Torr erreicht.
    3. Die entsprechende OperationParameter, wie beispielsweise ein monochromatischer Röntgenquelle (Al, 1486,6 eV), Anodenpotential und Strom (10kV und 15mA) sind Öffnungsgröße (110μm), Durchgangsenergie (80 eV für breiter Strahlschwenkung und 20 eV für Auflösungsscan) ausgewählt ist. Die Röntgenquelle fokussiert ist mit zwei gegenüberliegenden Ecken des Mikroarrays und Optimierung der Sauerstoff Signals von der Probe. Die x-und y-Positionen der einzelnen Spots wird dann bestimmt und aufgezeichnet als Positionsliste.
    4. Ein Programm chart geschrieben und führen Sie dann für die Erfassung von Daten, einschließlich Breitbild-Scans und Scans in hoher Auflösung für bestimmte Elemente.
  5. Ramanspektroskopie
    1. Raman-Spektren werden für jedes Polymer vor Ort mittels einer Raman-Mikroskop LabRAM HR (Horiba Jobin Yvon) aufgenommen. Anfänglich wird das Raman-Signal unter Verwendung eines kalibrierten Siliziumwafer und die Raman-Verschiebung von Si bei 520,7 cm -1.
    2. Die Probe wird dann auf der Stufe angeordnet, und der Fokus des Lasers (Wellenlänge = 523 nm) wird eingestellt, um die Raman-Verschiebung CH maximierenbei 2950 cm -1.
    3. Die Position der Mitte der oberen linken Stelle auf dem Mikroarray wird dann als Ursprung und einer Karte des Mikroarrays eingestellt ist Setup mit dem Array-Funktion auf der LabRAM HR-Software.
    4. 10 Spektren sind kumulativ für jede Probe mit einer Belichtungszeit von 0,5 s erworben.

5. Bakterielle Assay

Die Anordnung kann auf viele verschiedene biologische Tests einschließlich der Anhaftung und der Proliferation von Stammzellen, andere Zelltypen und Bakterien 3,10,4 ausgesetzt werden. Hier beschreiben wir ein bakterielles Befestigung Assay, das schematisch in 4 gezeigt.

  1. Ein Bakterienstamm mit GFP transformierte Plasmid exprimiert wird über Nacht bei 37 ° C in 10 ml LB-Medium in einem 50 ml-Falcon-Röhrchen unter Schütteln bei 200 UpM.
  2. Die OD 600 der Bakterienkultur wird gemessen und ausreichende Übernachtkultur wird in 15 ml RPMI-1640 definierten Medien inokuliert zu führenin einer endgültigen OD 600 von 0,01.
  3. Arrays werden in sterilisiertem destilliertem Wasser für 10 Minuten vorgewaschen, um alle löslichen Bestandteile aus den Arrays (unpolymerisierten Monomer, Oligomere und Lösungsmittel) entfernen
  4. Washed array Objektträger sind in einem sauberen Petrischale und UV für 10 min sterilisiert platziert.
  5. Eine Folie mit dem Array in eine Petrischale und 15 ml der inokulierten RMPI-1640 Medium gegeben wird hinzugefügt. Gleichzeitig ein weiterer Schieber in eine Petrischale gegeben und inkubiert mit nicht innoculatd RPMI-1640 als Kontrolle.
  6. Objektträger werden bei 37 ° C für 72 Stunden unter Schütteln bei 60 Upm inkubiert.
  7. Objektträger werden zweimal mit 15 ml steriler PBS gewaschen.
  8. Objektträger werden zweimal mit je 15 ml sterilem destilliertem Wasser gewaschen.
  9. Slides sind luftgetrocknet.
  10. Folien abgebildet werden unter Verwendung einer GenePix Autoloader 4200AL Scanner (Molecular Devices, USA) mit einem 488 nm Laser und Standard Anregung blaue Emission Filter (510-560nm). Ein Vertreter Polymer Autofluoreszenzbildes istin 2 gezeigt. Dies sollte so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Zerfall des GFP zu vermeiden. Wenn dies nicht möglich die Zellen sollten unterziehen Fixierung. Weiterhin ist die Aufnahme geeigneter positive Kontrollen mit bekanntem bakterielle Reaktion zwingend in der Lage sein, um die Ergebnisse zu normalisieren und erlauben Experimenten an verschiedenen Tagen durchgeführt, um vergleichbare quantitativ. Die Gesamtmenge Fluoreszenzintensität aus Polymer Flecken erfasst mithilfe GenePix Pro 6 Software (Molecular Devices, US). Dies ist für die beiden Schlitten mit Bakterien und nur Medien inkubiert getan. Um die Fluoreszenz aufgrund des Wachstums von Bakterien finden, die Fluoreszenz auf dem media control wird von der Fluoreszenz auf der Folie mit Bakterien inkubiert gemessenen Werten abgezogen.
  11. Dias können auch durch 20 uM SYTO17 Nukleinsäurefarbstoff (Invitrogen, UK) bei Raumtemperatur für 30 Minuten gefärbt und bebildert mit einem Carl Zeiss LSM 700 Laser Scanning Mikroskop mit ZEN 2009 Imaging-Software (Carl Zeiss, Deutschland). Die Berichterstattung von Bakterienauf der Oberfläche wird mit Open-Source-Image J 1,44 Software (National Institute of Health, USA).

6. Repräsentative Ergebnisse

Die Bedingungen des Buchdrucks wurden optimiert, um die höchste Qualität Polymers Microarrays drucken. Die Luftfeuchtigkeit sollte bei 30-40% gehalten werden. Das Polymer Stellen in wässrigen Umgebungen wurde häufig für Arrays bei einer Luftfeuchte unter 30% beobachtet gedruckten Delaminierung, was darauf hindeutet, dass diese ausreicht, um die Feuchtigkeit pHEMA Schicht aufquellen und erlauben die physikalischen Einschluss des Polymers auf dem Substrat ist. Die Feuchte kann weiter erhöht werden, um den Durchmesser der Polymerteilchen Spots verändern, aber dies hängt von der Monomer Chemie. Wo zum Beispiel gleiche Volumina Polymerisationslösung gedruckt wurden und als Feuchtigkeit wurde erhöhte sich von 40 bis 80% der Fleckdurchmesser von 430 um bis 370 um für eine verringerte Monomer, das eine hydrophile Gruppierung Ethylenglykol gleichen Volumens, während er bei monomer enthaltend eine hydrophobe aliphatische Kohlenstoff Ringstruktur der Fleckdurchmesser von 290 um bis 350 um (5) erhöht.

Der Polymerisationsgrad kann überwacht unter Verwendung der Raman-Spektroskopie, die C = C Ramanverschiebung, die bei 1640 cm -1 festgestellt wird, die mit der C = O Ramanverschiebung bei 1720 cm -1 normalisiert werden soll messen. Die Raman-Spektren wurde für Polymer-Spots für unterschiedliche UV-Bestrahlung (6) polymerisiert gemessen. Die C = C-C = O-Verhältnis verringert, wie UV-Belichtung von 0 bis 50 s erhöht wird, worauf keine weitere Abnahme der C = C-C = O-Verhältnis wurde mit weiteren UV-Bestrahlung (6) beobachtet. Raman-Spektren wurden auch für Polymer-Spot in unterschiedlichen O 2-Gehalt und der C = C Ramanverschiebung beobachtet als die O 2-Niveau zu 2000 ppm gesenkt wurde, jedoch keine weitere Reduktion wurde für einen O 2-Niveau unterhalb dieser beobachtet (Abbildung 7A polymerisiert gemessene ). Raman-Spektroskopie zeigte auch die Fähigkeit der Vakuumextraktionsleitung step um unpolymerisierten Monomer zu entfernen. Vor Vakuumextraktionsleitung die C = C Ramanverschiebung größer für das Polymer bei 3300 ppm im Vergleich zu 2000 ppm (7A) polymerisiert wurde, aber nach Vakuumextraktionsleitung die Höhe der Ramanverschiebung ununterscheidbar (7B), was nahe legt alle unpolymerisierten Monomer während das Vakuum Extraktionsschritt entfernt. Zusammenfassend umfassen Polymerisationsbedingungen eine Feuchtigkeit von 30-40%, UV-Belichtung von mehr als 50 s bei einem O 2-Niveau unter 2000 ppm mit einem Vakuum Extraktionsschritt nach dem Drucken für 7 Tage.

Nach dem Drucken und Vakuumextraktion der Erfolg der Polymerisation von Polymer Spots können durch einfache Lichtmikroskopie zu identifizieren und anomale Morphologien Spot beurteilt werden. Normalerweise sollte Flecken kreisförmigen und gleichmäßig, wie in Abbildung 8 auf der linken Seite angezeigt. Die wahrscheinliche Ursache für eine Änderung der Geometrie ist ein beschädigtes oder unrein Pin. Für eine kleine Anzahl von Monomer-Kombinationen haben wir unförmig Flecken beobachtet wird, für EXample eine zentrale Stelle mit einem Satelliten von kleinen Flecken, in Abbildung 8 auf der rechten Seite dargestellt, oder einem gebratenen Ei-Form, wo es um einen zentralen Platz an der Spitze der großen, flacheren Stelle. Dies kann durch Phasentrennung vor dem Drucken in Bezug auf Unterschiede in der Viskosität, Hydrophilie, Flüchtigkeit oder Oberflächenspannung der Monomeren und legt nahe, dass das Monomer-Kombination ist nicht kompatibel mit diesem Format verursacht werden. Zusätzliche chemische Abbildung der Flecken Polymer durch Techniken wie ToF-SIMS ist auch ein wichtiger und manchmal notwendig Qualitätskontrolle Schritt, um die Verteilung der Materialien Chemien für die Flecken und der Anordnung zu bestimmen. Diese Technik kann identifizieren übermäßige Ausbreitung von manchen Materialien nicht sichtbar durch Lichtmikroskopie und identifizieren Phasentrennung innerhalb einzelner Polymer Flecken.

Abbildung 1
Abbildung 1. Schematische Darstellung der verschiedenen Schritte bei der Bildung einer po involviertLymer Ort.

Abbildung 2
Abbildung 2. Schematische der Methodik von Stift-Druck mit ersten Einlegen der Stift mit Monomer in einer Quellenplatte und dann Abscheiden des Monomers auf ein Substrat, indem ein Kontakt. Der Stift wird durch einen XYZ Roboterarm gesteuert. Der Einschub zeigt ein typisches Bild der Autofluoreszenz aus einem Array nach der Produktion.

Abbildung 3
Abbildung 3. Schematische Hervorhebung der Techniken mit HTSL und Bioassays angewendet auf das Studium der Polymer Mikroarrays zugeordnet.

Abbildung 4
Abbildung 4. Schematische Darstellung des bakteriellen Anlage Assay.

Abbildung 5
Abbildung 5. P4-tert-Butylcyclohexylacrylat und Di (ethylenglycol) ethylether Methacrylat: olymer Fleckdurchmesser in unterschiedlichen Feuchtigkeit für zwei verschiedene Monomere gedruckt.

Abbildung 6
Abbildung 6. Das Verhältnis der Raman-Intensität für die C = C Ramanverschiebung bei 1640 cm -1 und der C = O Ramanverschiebung bei 1720 cm -1 von Polymer Stellen aus 4-tert-Butylcyclohexylacrylat mit verschiedenen UV-Exposition. Die Fehlerbalken gleich eine Standardabweichung (n = 3).

Abbildung 7
Abbildung 7. Die Raman-Spektren für das Polymer Stellen aus 4-tert-Butylcyclohexylacrylat in unterschiedlichen Ebenen O 2 gedruckt, gemessen angedeutet links von jedem Spektrum, (A) vor und (B) nach Vakuumextraktion. Das Verhältnis der Raman-Intensität für die C = C Ramanverschiebung bei 1640 cm -1 und der C = O Ramanverschiebung bei 1720 cm -1

Abbildung 8
Abbildung 8. Eine lichtmikroskopische Aufnahme von zwei Polymeren Flecken. Der Fleck auf der linken Seite zeigt eine wohlgeformte Ort, während die Stelle auf der rechten Seite ist ein Beispiel für einen Ort mit einer sehr ungleichmäßig Verteilung der Monomer. Der Maßstab beträgt 500 um.

Discussion

Polymer-Microarrays wurden erfolgreich für die Entdeckung neuer Materialien durch Screening Hunderte von neuartigen Polymer in einem biologischen Assay verwendet und Identifizierung "Treffer" Materialien, die anschließend bis zu nützlichen Geräten skaliert werden kann. In diesem Fall kann die Charakterisierung von Oberflächen beschrieben eingesetzt anschließenden werden, um die biologische Assays und ausschließlich auf den "Hit"-Materialien, die Materialien genauer zu untersuchen. Diese Strategie kann von Interesse sein, wenn HTSL nicht verfügbar ist der Experimentator Verwendung dieses Ansatzes. Jedoch voll auszunutzen Polymer Mikroarrays zu studieren biologische Material-Interaktionen das gesamte Array von Hunderten von Materialien ist vor der biologischen Assays mit HTSL Methodiken, die anschließend verwendet werden, um Struktur-Funktions allgemeinen Trends beobachten sein können analysiert werden.

Kontakt Drucken basiert auf den Metallstift Schiebetüren oben und unten frei im Stifthalter. Pin-und Stifthalter Sauberkeit ist von größter Bedeutung ist die Gewährleistung pRUCKEN tritt erfolgreich und sollten konsequent durchgeführt werden. Vor Beginn ein Druckvorgang ausgeführt passende Bewegung des Stiftes innerhalb des Stifthalters kann durch Ausführen eines Testlaufs getestet werden, ohne vorhandenen Monomeren. Der Reinigungsschritt ist fortzusetzen, bis der Stift Bewegung reproduzierbar erreicht wird.

Beträchtliche Gedankens soll in das Design des Monomergemisches gehen. Um leicht eine kombinatorische Bibliothek von Polymeren sind Hunderte von Copolymeren durch Mischen einige Monomere in unterschiedlichen Verhältnissen gebildet. Typischerweise produzieren wir 576 Mitgliedsbibliotheken da dies bildet eine 24 x 24-Array, das geeignet für die Geometrie eines Glasobjektträger ist. Um eine kombinatorische Bibliothek, die meisten kombinatorischen Raum ist es am einfachsten zu 24 Monomere im Verhältnis 2:1 mischen paarweise untersucht produzieren. Alternativ sind die Einbeziehung der Gradienten der Zusammensetzung innerhalb der Anordnung zur Freigabe der Beobachtungen von Trends, die optimale Monomerzusammensetzungen bis d sein können nützlichetermined. Als ein Beispiel für diese 22 Monomere können als erste Komponente in einem Co-Monomer-Mischung, die nacheinander mit 1 von 6 ist die zweite Komponente verdünnt verwendet werden. Wenn 5 Verdünnungen eingesetzt werden, beispielsweise Mischen der ersten und zweiten Komponenten in Verhältnissen von 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 und 10:90, würde dies zu 488 einzigartige Copolymerlösungen führen. Um die gesamte bringen bis zu 576, repliziert der Homopolymerisate der Monomeren verwendet eingeführt werden kann, was oft ein wichtiger Referenzprobe. 576 Monomerlösungen sollte in 2 384-Well-Platten verzichtet werden. Für die Programmierung des Roboters es einfacher ist, zwei identische Platten in Bezug auf die Position der Monomere haben somit die Monomerlösungen gleichmäßig zwischen den zwei Platten aufgeteilt werden.

Eine erhebliche Menge an Zeit können bei der Herstellung der Source Platten durch die Verwendung von Mehrkanal gespeichert werden, und das Design der Quelle Platten sollte bestimmt werden, um die Verwendung der Mehrkanalpipetten auszunutzen. </ P>

Um maschinelle und automatische HTSL der Arrays erreichen die Kassaposition muss erfolgreich mit der Charakterisierung Vorrichtung ausgerichtet werden. Typischerweise wird die Tonhöhe einer Acrylat-Array ist 500-1000 um und das Polymer Fleckdurchmesser von 300 um. Die meisten Kreuztische haben eine Auflösung von weniger als 10 um, damit eine ausreichende Toleranz für die Charakterisierung von Oberflächen Vorrichtung zur zuverlässigen Zugriff auf die Array-Positionen, wenn die richtigen Abmessungen eingegeben wurden, um die Positionierung der Probe Software. Die Beschränkung auf die automatisierte Positionierung ist in der Tat das genaues Drucken des Arrays. Um genaue Drucken zu gewährleisten ist es wichtig, um die Bewegung des Substrats auf dem Drucktisch verhindern entweder mittels Vakuumansaugung oder Federklemmen zusammen mit entsprechenden Abmessungen Schieber (beachte, dass sowohl ein US-Standard und EU Foliengröße existieren).

ToF-SIMS ist ein extrem oberflächensensitive Technik, eine Kontamination von Proben beobachten können. Somit muss darauf geachtet werden, upmostden Kontakt mit der Oberfläche zu vermeiden. Die Proben sollten nur bearbeitet werden, aber die Oberfläche von Interesse nicht kontaktiert, mit sauberen Handschuhen (vorzugsweise Polyethylen) und mit frisch gereinigten Pinzetten. Wir in der Regel mit Chloroform und Hexan waschen. Probenspeicher vor den Messungen wird am besten in einem Probenhalter mit den Folien auseinander hält geschieht beispielsweise das 5 Objektträgerhalter oder 20 Objektträgerhalter.

Die Arrays sind speziell auf Kompatibilität mit vielen biologischen Testformate und Auslesungen, dh entworfen, ist das verwendete Substrat ein Objektträger idealerweise zur Fluoreszenz-Scanner und Lichtmikroskopen geeignet. Dies bedeutet, das Format ist gut zu erkunden vielen Material-biologischen Wechselwirkungen geeignet. Weiterhin erlaubt das Format Hunderte von Materialien parallel gescreent werden. Dies ermöglicht viele weitere Materialien als herkömmliche Methoden, wobei jede neue Materialchemie einzeln abgeschirmt abgeschirmt werden. Die erhöhte Spielraum für biologisch-Materie-Wechselwirkungen ermöglichens für die Aufklärung der Mechanismen der biologischen Oberflächen-Wechselwirkungen sowie das Finden der optimalen Material für eine bestimmte Anwendung.

Disclosures

Wir haben nichts zu offenbaren.

Acknowledgments

Mittel aus dem Wellcome Trust wird freundlicherweise bestätigt (Förderkennzeichen 085245/Z/08/Z). Nottingham Nanotechnologie und Nanowissenschaften Centre freundlicherweise für den Zugang zu den Raman-System und für die East Midlands Development Agency für die Finanzierung dieser Geräte anerkannt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epoxy slides Genetix K2652
Contact printer Biodot XYZ3060 Platform
Metal pin ArrayIt 946MP6B
ToF-SIMS instrument ION-TOF
XPS instrument Kratos Analytical
WCA apparatus Krüss DSA 100
AFM Bruker Corporation Dimension Icon
RPMI-1640 cell culture media Sigma-Aldrich R0883
SYTO17 Invitrogen S-7579

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Polymer Microarrays für High Throughput Discovery of Biomaterials
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Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).More

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).

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