Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

बायोमैटिरियल्स उच्च Throughput डिस्कवरी के लिए पॉलिमर माइक्रोएरे

doi: 10.3791/3636 Published: January 25, 2012

Summary

एक बहुलक माइक्रोएरे के गठन का वर्णन एक photopolymerization पर चिप तकनीक का उपयोग. उच्च throughput सतह लक्षण वर्णन परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी, पानी संपर्क कोण माप, एक्स - रे Photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी और उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री और एक सेल लगाव परख के समय का उपयोग भी वर्णित है.

Protocol

1. कम - दूषण पृष्ठभूमि की तैयारी

  1. एक 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में (hydroxyethyl methacrylate) पाली (pHEMA) (सेल संस्कृति परीक्षण सिग्मा) की 2 ग्राम वजन. 95% की 50 एमएल (v / v) पानी में इथेनॉल में भंग. यह आमतौर पर sonication के 24 घंटे लगते हैं.
  2. डुबकी epoxy कोट कार्यात्मक pHEMA समाधान के साथ कांच स्लाइड (Genetix). epoxy समूहों को तेजी से pHEMA कोटिंग के साथ सहसंयोजक संपर्क फार्म जाएगा. डुबकी कोटिंग चिमटी के साथ गिलास स्लाइड पकड़ और समाधान में स्लाइड की सूई के द्वारा हासिल की है. आमतौर पर 5 मिमी स्लाइड के छोड़ दिया है uncoated, जो स्लाइड orientating के लिए उपयोगी है और यह भी एक पालन सतह के रूप में एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में कार्य कर सकते हैं. स्लाइड तो 1 है की एक अवधि में pHEMA समाधान से वापस ले लिया है, उल्टा और एक स्लाइड धारक में रखने से पहले एक के पास 10 मिनट के लिए क्षैतिज स्थिति में सूखने के लिए छोड़ दिया.
  3. pHEMA लेपित स्लाइड तो 1 सप्ताह के लिए वातावरण की स्थिति में छोड़ दिया जाता है टी के पूरा वाष्पीकरण की अनुमति देने केवह विलायक.

2. Monomer समाधान की तैयारी

  1. Photoinitiator acetophenone 2,2 dimethoxy-2-फिनाइल के 120 मिलीग्राम वजन और dimethylformamide (DMF) के 3 एमएल को जोड़ने के लिए एक 4% (w / v) photoinitiator समाधान. यह सबसे अच्छा प्रत्येक प्रिंट चलाने से पहले ताजा किया तो, और बड़े पैमाने पर बनाया समाधान की मात्रा के अनुरूप कितना photoinitiator समाधान की आवश्यकता है अलग किया जा सकता है. समाधान स्थिर एक महीने के लिए है.
  2. Monomer समाधान photoinitiator साफ monomer की 3 भागों में समाधान का हिस्सा 1 जोड़कर बना रहे हैं. यह एक 384 अच्छी तरह से स्रोत थाली में photoinitiator समाधान और monomer के 15 μL के 5 μL pipetting द्वारा हासिल की है. 20 μL की कुल मात्रा हाजिर गठन के लिए आदर्श है. अधिक मात्रा में अतिरिक्त सोख्ता के पहले वर्दी स्पॉट का उत्पादन किया जा सकता है की आवश्यकता होती है. छोटे संस्करणों पिन का अधूरा लोडिंग में हो सकता है.
  3. वर्तमान में इस विधि acrylate / methacrylate monomers का उपयोग करें कि VI द्वारा DMF में घुलनशील हैं तक सीमित हैये केवल संयोजन पता लगाया गया है कि किया जा रहा है की rtue, acrylamides और अन्य सॉल्वैंट्स मुद्रण प्रक्रिया करने के लिए उत्तरदायी होने की संभावना हैं. Monomer एकाग्रता प्राप्त करने के लिए (75% w / w) का सुझाव दिया है तरल monomers भी आवश्यक हैं, हालांकि कम monomer सांद्रता ठोस monomers के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (कम monomer एकाग्रता प्रतिकूल परिणामी बहुलक की सतह के रसायन शास्त्र को बदल लेकिन नहीं प्रदर्शित करता है यह है संभावना है कि आणविक वजन और ग्लास संक्रमण के तापमान बदल दिया है). अत्यधिक अस्थिर monomers भी monomer के तेजी से वाष्पीकरण की वजह से पहले यूवी इलाज कदम जब polymerising उपयोग करने के लिए मुश्किल है. Monomer समाधान के एक भाग के रूप में लंबे समय के 6 घंटे के रूप में और रन अस्थिर monomers के अंत की ओर ले जा सकते हैं की संख्या पर निर्भर करता है स्रोत थाली से सुखाया जाएगा. अस्थिर monomers का प्रयोग मुद्रण चरण ठंडा और कम प्रिंट ही चलाता है का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है.
  4. कुछ अत्यधिक हाइड्रोफिलिक monomers के अपवाद के साथपाली (ethylene glycol) acrylate, जलीय buffers में परिणामी बहुलक स्पॉट के विघटन नहीं किया गया है इस तरह मनाया में, एक crosslinking monomer के उपयोग की आवश्यकता है, हालांकि शामिल नहीं है नहीं है.

3. पॉलिमर माइक्रोएरे गठन

बहुलक माइक्रोएरे गठन के लिए विशिष्ट प्रक्रिया schematically चित्र 1 में दिखाया गया है.

  1. माइक्रोएरे गठन एक संपर्क (Biodot) रोबोट एक XYZ मंच (चित्रा 2) का उपयोग कर का उपयोग कर हासिल की है. 220 सुक्ष्ममापी व्यास के Slotted पिन (96B Arrayit) किया जाता है. Sonication द्वारा dichloromethane में सभी पिन प्रिंट चलाने के लिए पहले और इसी तरह पिन धारक भी साफ किया जाना चाहिए 10 मिनट के लिए साफ किया जाना चाहिए.
  2. पिंस धारक में लोड कर रहे हैं, सोख्ता और सरणी स्लाइड लोड कर रहे हैं और फिर पूरे चैम्बर argon से भर जाता है करने के लिए 2000 पीपीएम है, जो पर्याप्त ऑक्सीजन द्वारा polymerization कण के शमन से बचने के लिए कम है नीचे ऑक्सीजन का स्तर कम है. नमी maintaine है30-40% के बीच में घ. नमी सहित pHEMA के लिए अनुमति देता है का गठन बहुलक के लिए अनुमति लिए pHEMA परत ग्रहों तक चलना और शारीरिक रूप से 2 सतह फँस हो प्रफुल्लित है.
  3. प्रिंट चलाने शुरू है. प्रत्येक रन के होते हैं:
    • स्रोत थाली से नमूना लोड हो रहा है. पिंस समाधान में 25 मिमी / s की गति 2.5 एस के लिए समाधान में आयोजित में कम कर रहे हैं और फिर 25 मिमी / (2 चित्रा) की गति से वापस ले लिया.
    • पिंस पिन के बाहर से monomer समाधान निकालने के लिए मुद्रण से पहले blotted किया जाना चाहिए. इसके बाद monomer वितरण पिन की quilled हिस्सा से संगत हाजिर गठन को प्राप्त करने के लिए होता है है. सोख्ता अनुक्रम एक साफ़ कांच की स्लाइड के साथ 33 संपर्कों के होते हैं. पहले चार पदों के लिए किए गए संपर्कों की संख्या 10, 4, 5 और 3 क्रमशः है. अगले चार पदों 2 संपर्क किया और पिछले 3 पदों में 1 से संपर्क किया है. प्रत्येक संपर्क के लिए कुल संपर्क समय 10 एमएस और दृष्टिकोण और वापसी की गति 175 हैmm / s. इस बिंदु से गठन स्पॉट एक सुसंगत आकार और ज्यामिति होना चाहिए. इस बिंदु पर विफलता अशुद्ध या monomer समाधान में धूल contaminant पिन को इंगित करता है.
    • monomer समाधान तो pHEMA लेपित गिलास स्लाइड (2 चित्रा) पर मुद्रित कर रहे हैं. एक संपर्क मौके प्रति 175 मिमी / एस के एक पिन आंदोलन में किया जाता है और 10 एमएस, जो सतह और monomer समाधान के ऊर्जा चिपचिपापन के आधार पर 400 सुक्ष्ममापी की एक औसत हाजिर व्यास देता है के समय से संपर्क करें. आमतौर पर 3 दोहराने arrays प्रत्येक गिलास स्लाइड पर मुद्रित कर रहे हैं और कुल 10 स्लाइड्स की एक एक रन पर मुद्रित कर रहे हैं. इस चक्र के अनुसार 30 स्थानों के लिए equates.
    • पिंस DMF में धोया जाता है. ताजा DMF के 2.5 एल पूरे धोने चलाने के लिए प्रदान की जाती है. Pins आंदोलन के साथ एक प्रवाह स्नान में धोया जाता है.
    • धोने के साथ समवर्ती, हौसले से मुद्रित स्लाइड्स धोने अवधि कि 30 एस रहता है की अवधि के लिए 30 mV / 2 सेमी के घनत्व में एक छोटी लहर यूवी (365 एनएम) स्रोत के साथ विकिरणित हैं.
  4. एकfter समाधान सभी monomer मुद्रित कर रहे हैं arrays यूवी (365 एनएम) के साथ अतिरिक्त 10 मिनट के लिए विकिरणित हैं.
  5. हौसले से मुद्रित arrays 1 सप्ताह के लिए कम दबाव (<50 mTorr) में रखा जाता है unpolymerized monomer और हटाने विलायक.

4. उच्च throughput सतह लक्षण वर्णन (HTSC)

HTSC तकनीकों का एक सामान्य योजना चित्रा 3 में दिखाया गया है. स्वचालित, उच्च throughput दृष्टिकोण केन्द्रीय लक्षण वर्णन तंत्र साथ बहुलक माइक्रोएरे के संरेखण है. सभी मामलों में यह एक कैमरा है कि सरणी के एक शीर्ष दृश्य देता का उपयोग कर हासिल की है. प्रारंभ में, सरणी XY आंदोलन के साथ मंच के पंक्ति में घुमाया जा रहा है. सरणी के एक कोने जगह तो स्थित है और विशिष्ट निर्देशांक नामित. प्रत्येक बहुलक स्थान की स्थिति तो सरणी के आयामों का उपयोग कर भविष्यवाणी की जा सकता है.

  1. जल संपर्क कोण माप (WCA)
    1. WCA माप एक पर अवृन्त ड्रॉप विधि का उपयोग कर लिया जाता हैस्वचालित Krüss डीएसए 100 साधन. ~ 400 PL के एक मात्रा के साथ एक एक बूंद पानी प्रत्येक बहुलक स्थान पर piezo संचालित एक प्रिंट सिर का उपयोग कर तिरस्कृत किया है. आम तौर पर एक बहुलक स्थान का व्यास 300 सुक्ष्ममापी और बहुलक मौके पर छोटी बूंद पानी के आधार व्यास आम तौर पर 100 सुक्ष्ममापी, इस प्रकार एक ही माप बहुलक हाजिर प्रति प्राप्त किया जा सकता है.
    2. एक XY मंच प्रिंट सिर 7 के तहत प्रत्येक बहुलक हाजिर के स्वचालित स्थिति के लिए अनुमति देता है. यह एक नमूना है कि सरणी के एक शीर्ष दृश्य प्रदान करता है ऊपर स्थित कैमरे का उपयोग कर हासिल की है. शुरू में, कैमरे की स्थिति छोटी बूंद पानी के वितरण के लिए कैमरे को देखने के केंद्र संरेखित करें समायोजित किया जाना चाहिए और तब सरणी प्रिंट सिर के लिए गठबंधन किया जा सकता है.
    3. एक उच्च गति कैमरे सतह मार और बाद में evaporating पर छोटी बूंद के पक्ष प्रोफ़ाइल रिकॉर्ड. फ्रेम कि ड्रॉप की प्रारंभिक प्रभाव कब्जा करने के लिए संपर्क कोण को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है. एक चक्र ड्रॉप profi के लिए फिट हैले और बाद में संपर्क कोण निर्धारित.
  2. समय की उड़ान माध्यमिक आयन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (TOF-एस)
    1. नमूना मंच पर भरी हुई है. यह शामिल है सबसे पहले साफ अल पन्नी, जो प्रभारी मुआवजे के साथ मदद करता है के साथ मंच का अस्तर, और फिर जगह में धातु पेंच टैब के उपयोग द्वारा स्लाइड धारण.
    2. नमूना मंच TOF-एस के स्थानांतरण कक्ष में रखा गया है और 1.6 × 10 mbar -6 तक नीचे पंप करने की अनुमति दी. नमूना तो मुख्य विश्लेषण कक्ष है, जो आम तौर पर 1.0 × 10 mbar -8 के एक वैक्यूम दबाव है को सौंप दिया है.
    3. TOF-एस माप आयन TOF चतुर्थ एक monoisotopic 3 द्विपक्षीय + प्राथमिक आयन "bunched मोड" में 25 केवी पर संचालित स्रोत का उपयोग कर संचालित साधन का उपयोग किया जाता है. एक स्पंदित 1 पीए प्राथमिक आयन बीम विश्लेषण क्षेत्र पर rastered सकारात्मक और नकारात्मक दोनों माध्यमिक आयनों के साथ एक 10 सेकंड के लिए एक 100 × 100 माइक्रोएरे में प्रत्येक बहुलक हाजिर के सुक्ष्ममापी क्षेत्र से एकत्रदूसरी अधिग्रहण समय. आयन जनता एक उच्च संकल्प समय की उड़ान के सटीक जन काम की अनुमति विश्लेषक का उपयोग निर्धारित किया गया है. ठेठ सामूहिक संकल्प (मीटर / z 41) 6000 से अधिक बस गया था. कम ऊर्जा इलेक्ट्रॉनों (20 eV) सतह सकारात्मक आरोप लगाया इन्सुलेट 8 सतहों पर प्राथमिक आयन बीम की वजह से चार्ज करने के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
  3. परमाणु शक्ति माइक्रोस्कोपी (AFM)
    1. एक स्वचालित मंच के साथ एक बड़ा मंच AFM गिलास स्लाइड पर arrays का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है. एक आयाम या नायक खुर्दबीन इस उद्देश्य के लिए आदर्श है.
    2. नमूना मंच पर रखा गया है और स्थिति चरण सरणी के ऊपरी दाएँ कोने में असर पड़ा है.
    3. सरणी के निचले बाएं कोने की स्थिति में पाया गया है, जो सभी अन्य स्थानों की स्थिति interpolated करने की अनुमति देता है.
    4. स्थिति सूची उत्पन्न होता है और सॉफ्टवेयर की सुविधा ऑटो नमूने में खिलाया.
    5. AFM माप एक NanoScope 3000A साधन का उपयोग आधुनिक दोहन में लिया जाता हैई. लगभग 300 kHz के एक गुंजयमान आवृत्ति और एक 40 एन मी / निरंतर बल के साथ सिलिकॉन युक्तियाँ (Tap300Al, बजट सेंसर) किया जाता है. बहुलक का 5x5 सुक्ष्ममापी क्षेत्रों 9 मापा जाता है.
    6. रूट मतलब वर्ग खुरदरापन (आरएमएस) प्रत्येक SPIP बैच संसाधन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि के लिए इस क्षेत्र भर में मापा जाता है. प्रत्येक छवि शुरू खुरदरापन माप के लिए पहले चपटा है.
    7. सभी छवियों को एक पुस्तिका देखने इमेजिंग कलाकृतियों है कि खुरदरापन माप से हटाया जा आवश्यकता हो सकती है पहचान करने की आवश्यकता है. इस चरण के दौरान छवियों को भी आम सतह 9 सुविधाओं के आधार पर वर्गीकृत किया जा सकता है.
  4. एक्स - रे Photoelectron स्पेक्ट्रोस्कोपी (XPS)
    1. एक माइक्रोएरे स्लाइड एक नमूना बार डबल पक्षीय टेप का उपयोग करने के लिए चिपका है और बाद में एक Kratos एक्सिस अल्ट्रा XPS साधन का नमूना चेंबर में भरी हुई है.
    2. नमूना कक्ष में दर्ज करें और इंतजार जब तक यह 10 -8 Torr नीचे एक दबाव तक पहुँचता है.
    3. उपयुक्त आपरेशनएक monochromated स्रोत एक्स - रे (अल, 1486.6 EV) के रूप में इस तरह के मानकों, anode संभावित और वर्तमान (10kV और 15mA), एपर्चर (110μm) आकार, पास ऊर्जा (विस्तृत और उच्च संकल्प स्कैन के लिए स्कैन 20 eV eV 80) चयनित. एक्स - रे स्रोत माइक्रोएरे के दो विपरीत कोनों का उपयोग कर और नमूने से ऑक्सीजन संकेत के अनुकूलन पर ध्यान केंद्रित है. अलग - अलग स्थलों में से एक एक्स और वाई पदों निर्धारित किया जाता है और फिर एक स्थिति सूची के रूप में लॉग इन किया है.
    4. एक कार्यक्रम चार्ट लिखा है और चौड़ा स्कैन और विशिष्ट तत्वों के लिए उच्च संकल्प स्कैन सहित डेटा, के अधिग्रहण के लिए चला तो.
  5. रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी
    1. रमन स्पेक्ट्रा प्रत्येक बहुलक जगह रमन खुर्दबीन LabRAM मानव संसाधन (Horiba Jobin Yvon) का उपयोग करने के लिए लिया जाता है. प्रारंभ में, रमन संकेत एक सिलिकॉन वफ़र और 520.7 -1 सेमी सी रमन बदलाव का उपयोग calibrated है.
    2. नमूना तो मंच पर रखा गया है और लेजर (तरंगदैर्ध्य = 523 एनएम) का ध्यान केंद्रित करने के लिए CH रमन बदलाव को अधिकतम करने के लिए निकाला जाता है2950 -1 सेमी.
    3. माइक्रोएरे के ऊपर बाईं स्थान के केंद्र की स्थिति तो मूल और माइक्रोएरे के नक्शे के रूप में सेट कर दिया जाता है labRAM एचआर सॉफ्टवेयर पर सरणी समारोह का उपयोग कर सेटअप है.
    4. 10 स्पेक्ट्रा संचयी प्रत्येक नमूने के लिए 0.5 एस के विकिरण समय के साथ हासिल किया है.

5. बैक्टीरियल परख

सरणी लगाव और स्टेम सेल, अन्य कक्षों प्रकार और 3,10,4 बैक्टीरिया के प्रसार सहित कई विभिन्न जैविक assays को उजागर किया जा सकता है. यहाँ हम एक जीवाणु लगाव परख है, जो रेखाचित्र के रूप में 4 चित्र में दिखाया गया है का वर्णन.

  1. एक जीवाणु GFP के साथ बदल तनाव व्यक्त प्लाज्मिड 37 पर रातोंरात सुसंस्कृत है ° 200 rpm पर मिलाते हुए के साथ एक 50 एमएल बाज़ ट्यूब में लेग मीडिया के 10 एमएल में सी.
  2. जीवाणु संस्कृति के आयुध डिपो 600 मापा जाता है और पर्याप्त रातोंरात संस्कृति 15 एमएल RPMI 1640 परिभाषित मीडिया में inoculated के लिए परिणाम0.01 के अंतिम 600 आयुध डिपो में.
  3. Arrays निष्फल आसुत पानी में 10 मिनट के लिए prewashed सरणियों (unpolymerised monomer, oligomers और विलायक) से किसी भी विच्छेद करने या तोड़ने योग्य घटकों को हटाने
  4. धोया सरणी स्लाइड एक साफ पेट्री डिश यूवी और 10 मिनट के लिए निष्फल में रखा जाता है.
  5. सरणी के साथ एक स्लाइड एक पेट्री डिश और inoculated RMPI +१६४० मीडिया के 15 एमएल में रखा गया है जोड़ा जाता है. समवर्ती एक और स्लाइड एक पेट्री डिश में रखा जाता है और गैर innoculatd एक नियंत्रण के रूप में RPMI 1640 के साथ incubated.
  6. स्लाइड 37 डिग्री सेल्सियस से कम 72 घंटे के लिए 60 rpm पर मिलाते हुए साथ incubated हैं.
  7. स्लाइड्स बाँझ पीबीएस के 15 एमएल के साथ दो बार धोया जाता है.
  8. स्लाइड बाँझ आसुत जल के 15 एमएल के साथ दो बार धोया जाता है.
  9. स्लाइड्स एयर सूखे हैं.
  10. स्लाइड एक 488 एनएम उत्तेजना लेजर और मानक नीले उत्सर्जन फिल्टर (510-560nm) के साथ एक GenePix autoloader 4200AL स्कैनर (आण्विक उपकरण, अमेरिका) का उपयोग imaged. एक प्रतिनिधि बहुलक autofluorescence छविचित्रा 2 में दिखाया गया है. यह जितनी जल्दी हो सके किया जाना चाहिए GFP के क्षय से बचने के. यदि यह संभव नहीं है कोशिकाओं निर्धारण से गुजरना चाहिए. इसके अलावा, एक ज्ञात बैक्टीरिया प्रतिक्रिया के साथ उपयुक्त सकारात्मक नियंत्रण के शामिल किए जाने के परिणाम सामान्य और अलग अलग दिनों पर आयोजित करने के लिए मात्रात्मक तुलनीय प्रयोगों की अनुमति के लिए सक्षम होने के लिए जरूरी है. बहुलक स्थानों से कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता GenePix प्रो 6 सॉफ्टवेयर (आण्विक उपकरण, अमेरिका) का उपयोग करते हुए हासिल कर ली है. यह दोनों बैक्टीरिया और सिर्फ मीडिया के साथ incubated स्लाइड्स के लिए किया जाता है. जीवाणुओं के विकास के कारण प्रतिदीप्ति मीडिया नियंत्रण पर प्रतिदीप्ति बैक्टीरिया के साथ incubated स्लाइड पर मापा प्रतिदीप्ति से घटाया जाता है.
  11. स्लाइड्स 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर 20 सुक्ष्ममापी SYTO17 न्यूक्लिक एसिड डाई (Invitrogen, ब्रिटेन) भी दाग ​​किया जा सकता है और ज़ेन 2009 इमेजिंग सॉफ्टवेयर (कार्ल Zeiss, जर्मनी) के साथ एक कार्ल Zeiss LSM 700 लेजर स्कैन माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged. जीवाणुओं की कवरेजसतह पर खुला स्रोत छवि जम्मू 1.44 सॉफ्टवेयर (स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान, अमेरिका) का उपयोग निर्धारित किया जाता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम

छपाई की शर्तों के लिए उच्चतम गुणवत्ता बहुलक प्रोटीन मुद्रित करने के लिए अनुकूलित किया गया है. आर्द्रता 30-40% के बीच में रखा जाना चाहिए. वातावरण में जलीय बहुलक स्पॉट 30% से नीचे नमी पर मुद्रित arrays के लिए अक्सर देखा delamination, सुझाव है कि इस नमी pHEMA परत फूल और सब्सट्रेट करने के लिए बहुलक का शारीरिक फंसाने के लिए अनुमति देने के लिए अपर्याप्त है. नमी आगे बढ़ा जा सकता है बहुलक स्पॉट के व्यास को बदलने के लिए, लेकिन इस monomer रसायन विज्ञान पर निर्भर है. उदाहरण के लिए, polymerization समाधान के बराबर मात्रा जहां मुद्रित किया गया और एक एक मो के लिए एक हाइड्रोफिलिक ethylene glycol आधा भाग बराबर मात्रा whilst युक्त monomer के लिए के रूप में नमी की वृद्धि की गई थी 40 से 80% से हाजिर व्यास 430 सुक्ष्ममापी से 370 मीटर की कमी आईएक hydrophobic aliphatic कार्बन अंगूठी संरचना युक्त nomer हाजिर व्यास 290 सुक्ष्ममापी से 350 सुक्ष्ममापी (5 चित्रा) की वृद्धि हुई.

polymerization के डिग्री रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करने के लिए सी सी = रमन बदलाव है कि +१६४० -1 सेमी में पता चला है, जो सी 1720 -1 सेमी में = हे रमन बदलाव के साथ सामान्यीकृत किया जाना चाहिए उपाय नजर रखी जा सकती है. रमन स्पेक्ट्रा बहुलक विभिन्न यूवी जोखिम (6 चित्रा) के लिए polymerized स्थानों के लिए मापा गया था. सी = C: सी = हे अनुपात के रूप में यूवी जोखिम 0 से 50 है बढ़ कम नहीं में आगे कमी जिस सी = C: सी = हे अनुपात आगे पराबैंगनी विकिरण (6 चित्रा) के साथ मनाया गया. रमन स्पेक्ट्रा भी बहुलक विभिन्न ओ 2 स्तर और सी = सी रमन बदलाव के रूप में ओ 2 स्तर 2000 पीपीएम से कम था मनाया गया, लेकिन कोई आगे की कमी इस नीचे एक ओ 2 स्तर के लिए मनाया गया (चित्रा 7A polymerized स्पॉट के लिए मापा गया ). रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी भी वैक्यूम निकासी की क्षमता का प्रदर्शन कियाtep के लिए unpolymerized monomer हटाने. वैक्यूम निष्कर्षण से पहले सी = C रमन बदलाव 2000 पीपीएम (चित्रा 7A) के साथ तुलना में 3300 पीपीएम polymerized बहुलक के लिए अधिक से अधिक था, लेकिन, वैक्यूम निकासी के बाद रमन पारी की ऊंचाई अप्रभेद्य है (चित्रा 7B), सभी unpolymerized monomer का सुझाव दे वैक्यूम निष्कर्षण चरण के दौरान हटा दिया गया है. संक्षेप में, polymerization शर्तों 30-40% की नमी, 7 दिनों के लिए मुद्रण के बाद एक वैक्यूम निष्कर्षण कदम के साथ 2000 पीपीएम से नीचे एक हे 2 स्तर पर यूवी 50 की तुलना में अधिक जोखिम शामिल हैं.

मुद्रण और वैक्यूम निष्कर्षण बहुलक स्पॉट के polymerization की सफलता के बाद साधारण प्रकाश माइक्रोस्कोपी की पहचान करने के लिए और विषम हाजिर morphologies द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है. आमतौर पर, स्पॉट परिपत्र और वर्दी दिखाई देते हैं, के रूप में बाईं तरफ चित्रा 8 में दिखाया जाना चाहिए. ज्यामिति में एक बदलाव के लिए संभावित कारण एक क्षतिग्रस्त या अशुद्ध पिन है. Monomer संयोजनों की एक छोटी संख्या के लिए हम कुरूप स्पॉट ई के लिए मनाया है,छोटे धब्बे, सही पर 8 चित्र में दिखाया गया है, या एक तली अंडे के आकार के एक उपग्रह के साथ एक केंद्रीय स्थान xample जहां वहाँ बड़े के शीर्ष पर एक केंद्रीय स्थान है, हाजिर चापलूसी. यह monomers के चिपचिपापन, hydrophilicity अस्थिरता, या सतह के तनाव में मतभेद है और पता चलता है कि monomer संयोजन इस प्रारूप के साथ संगत नहीं है के लिए संबंधित मुद्रण के लिए पहले चरण जुदाई के कारण हो सकता है. TOF-एस के रूप में इस तरह की तकनीक द्वारा बहुलक स्थानों के अतिरिक्त रासायनिक मानचित्रण भी एक महत्वपूर्ण और कभी कभी आवश्यक गुणवत्ता नियंत्रण के धब्बे और सरणी पार 'सामग्री chemistries के वितरण का निर्धारण करने के लिए कदम है. यह तकनीक कुछ प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई नहीं सामग्री के अत्यधिक के प्रसार के पहचान करने और व्यक्तिगत बहुलक स्पॉट के भीतर चरण जुदाई की पहचान कर सकते हैं.

चित्रा 1
चित्रा 1 योजनाबद्ध एक पुलिस के गठन में शामिल विभिन्न चरणों चित्रणlymer हाजिर.

चित्रा 2
चित्रा 2 पिन छपाई की पद्धति को शामिल शुरू में एक स्रोत प्लेट में monomer के साथ पिन लोड हो रहा है और फिर से संपर्क करने पर एक सब्सट्रेट monomer जमा के योजनाबद्ध. पिन एक XYZ रोबोट भुजा द्वारा नियंत्रित किया जाता है. इनसेट उत्पादन के बाद एक सरणी से autofluorescence की एक विशिष्ट छवि को दर्शाता है.

चित्रा 3
चित्रा 3 योजनाबद्ध और भी HTSC बहुलक प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए आवेदन bioassays के साथ जुड़े तकनीक पर प्रकाश डाला.

चित्रा 4
चित्रा 4 बैक्टीरियल लगाव परख की योजनाबद्ध.

चित्रा 5
चित्रा 5 पी.4-tert-butylcyclohexyl acrylate और di (ethylene glycol) एथिल ईथर methacrylate: olymer जगह व्यास दो अलग अलग monomers के लिए विविध आर्द्रता में छपी.

चित्रा 6
चित्रा 6 रमन तीव्रता के अनुपात के लिए सी सी = 1640 सेमी -1 और सी 4 tert-butylcyclohexyl acrylate के विभिन्न यूवी जोखिम के साथ बहुलक स्थानों से 1720 -1 सेमी = हे रमन बदलाव रमन पाली. त्रुटि सलाखों के बराबर एक मानक विचलन (n 3 =).

7 चित्रा
7 चित्रा 4 tert-butylcyclohexyl विभिन्न ओ 2 स्तरों पर मुद्रित acrylate, बहुलक स्थानों के लिए मापा रमन स्पेक्ट्रा प्रत्येक स्पेक्ट्रम के बाईं ओर संकेत दिया, (ए) से पहले और (ख) वैक्यूम निष्कर्षण के बाद. सी = -1 सी 1720 सेमी +१६४० सेमी -1 और सी = हे रमन बदलाव पर रमन बदलाव के लिए रमन तीव्रता के अनुपात

चित्रा 8
8 चित्रा दो बहुलक स्पॉट के प्रकाश माइक्रोस्कोपी छवि. बाईं मौके पर एक अच्छी तरह से बनाई जगह से पता चलता है, सही मौके पर ही जबकि एक जगह monomer के एक बहुत ही असमान वितरण युक्त का एक उदाहरण है. पैमाने बार 500 सुक्ष्ममापी है.

Discussion

पॉलिमर प्रोटीन सफलतापूर्वक किया गया है एक जैविक परख में उपन्यास बहुलक स्क्रीनिंग सैकड़ों द्वारा नई सामग्री की खोज के लिए प्रयोग किया जाता है और 'हिट' सामग्री है कि बाद में उपयोगी उपकरणों के लिए बढ़ाया जा सकता है की पहचान. इस मामले में, सतह लक्षण वर्णन वर्णित जैविक परख बाद नियोजित हो सकता है और विशेष रूप से 'हिट' सामग्री पर और अधिक विस्तार में उन लोगों के लिए अध्ययन सामग्री. इस रणनीति के ब्याज की हो अगर HTSC प्रयोगवादी इस दृष्टिकोण को रोजगार के लिए उपलब्ध नहीं है, हो सकता है. हालांकि, पूरी तरह से बहुलक प्रोटीन का उपयोग करने के लिए जैविक सामग्री बातचीत सामग्री के सैकड़ों के पूरे सरणी पहले जैविक assays HTSC के तरीके, जो बाद में सामान्य संरचना समारोह के रुझान का पालन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है का उपयोग करने के लिए विश्लेषण किया जाना चाहिए अध्ययन.

संपर्क मुद्रण धातु फिसलने और पिन धारक भीतर नीचे आज़ादी पिन पर निर्भर करता है. पिन और पिन धारक सफाई सर्वोपरि पी सुनिश्चित करना हैrinting सफलतापूर्वक होता है और कड़ाई से किया जाना चाहिए. एक मुद्रण शुरू पिन धारक के भीतर पिन की उचित आंदोलन चलाने से पहले एक सूखी चलाने प्रदर्शन करके परीक्षण किया जा सकता है,, कोई वर्तमान monomers के साथ. सफाई कदम जारी रखना चाहिए जब तक पिन आंदोलन reproducibly हासिल की है.

Monomer मिश्रण के डिजाइन में काफी सोचा जाना चाहिए. आदेश में आसानी से पॉलिमर के एक मिश्रित पुस्तकालय का निर्माण करने के लिए, copolymers के सैकड़ों विभिन्न अनुपात में कुछ monomers मिश्रण से बनते हैं. आमतौर पर हम 576 सदस्य पुस्तकालयों का उत्पादन के रूप में यह 24 x 24 सरणी, जो एक गिलास स्लाइड की ज्यामिति के लिए उपयुक्त है रूपों. आदेश में एक मिश्रित पुस्तकालय है कि सबसे मिश्रित अंतरिक्ष आसान तरीका एक 2:1 के अनुपात में 24 जोड़ो में monomers मिश्रण है की पड़ताल का उत्पादन करने के लिए. वैकल्पिक रूप से, सरणी के भीतर compositional gradients का समावेश प्रवृत्तियों की टिप्पणियों, जो इष्टतम monomer रचनाओं होने के लिए अनुमति देता है सक्षम करने के लिए उपयोगी होते हैंetermined. इस 22 monomers के एक उदाहरण के रूप में कि sequentially 1 6 2 घटकों के साथ पतला है एक मिश्रण सह monomer में 1 घटक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि 5 dilutions उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, 90:10, 75:25, 50:50, 25:75 और 10:90 के अनुपात में पहले और दूसरे घटकों के मिश्रण, इस 488 अद्वितीय copolymer समाधान में नतीजा होगा. 576 के लिए कुल लाने के लिए, पेश किया जा सकता इस्तेमाल किया monomers, जो अक्सर एक महत्वपूर्ण संदर्भ नमूना है homopolymers replicates. 576 monomer समाधान 2 384 अच्छी तरह प्लेटें में समाप्त किया जाना चाहिए. रोबोट प्रोग्रामिंग के लिए यह आसान है monomers की स्थिति के संदर्भ में दो समान प्लेटें है, इस प्रकार, monomer समाधान दो प्लेटों के बीच समान रूप से अलग हो जाना चाहिए.

समय का एक महत्वपूर्ण राशि के स्रोत प्लेटों की तैयारी में multichannel pipettes के उपयोग के द्वारा बचाया जा सकता है, और स्रोत प्लेटों के डिजाइन के क्रम में multichannel pipettes के उपयोग का फायदा उठाने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. </ P>

जगह arrays के स्वचालित HTSC हासिल स्थिति सफलतापूर्वक लक्षण वर्णन के उपकरण के साथ गठबंधन किया जाना चाहिए. आमतौर पर एक acrylate सरणी के पिच 500-1000 सुक्ष्ममापी और बहुलक हाजिर व्यास 300 सुक्ष्ममापी है. अधिकांश XY चरणों 10 सुक्ष्ममापी नीचे एक संकल्प है, वहाँ इस तरह सतह लक्षण वर्णन करने के लिए मज़बूती से सरणी पदों का उपयोग एक बार सही आयामों नमूना पोजीशनिंग सॉफ्टवेयर के लिए इनपुट किया गया है तंत्र के लिए पर्याप्त सहिष्णुता है. स्वचालित स्थिति के लिए सीमा वास्तव में सरणी के सही मुद्रण है. सटीक मुद्रण सुनिश्चित यह मुद्रण मंच पर सब्सट्रेट के आंदोलन को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है या तो वैक्यूम चूषण या वसंत clamps उपयुक्त स्लाइड आयाम (कृपया ध्यान दें कि दोनों एक अमेरिका और यूरोपीय संघ के मानक स्लाइड आकार मौजूद हैं) के साथ मिलकर प्रयोग.

TOF-एस एक अत्यंत सतह संवेदनशील तकनीक है कि नमूनों पर किसी भी संक्रमण का निरीक्षण करेंगे. इस प्रकार, अत्यंत ध्यान रखा जाना चाहिएसतह के साथ संपर्क से बचने के लिए. केवल नमूने, संभाला जाना चाहिए, लेकिन ब्याज की सतह स्वच्छ दस्ताने (अधिमानतः polyethylene) के साथ और हौसले से साफ चिमटी के साथ संपर्क नहीं है, के साथ. हम आम तौर पर क्लोरोफॉर्म और hexane के साथ धो लो. नमूना मापन के लिए पहले भंडारण सबसे अच्छा है कि स्लाइड को अलग रखे एक नमूना धारक में किया जाता है, उदाहरण के लिए 5 स्लाइड धारक या 20 स्लाइड धारक.

उपयोग किया सब्सट्रेट arrays कई जैविक परख स्वरूपों और readouts के साथ संगत हो सकता है, वह यह है कि विशेष रूप से डिजाइन कर रहे हैं, एक खुर्दबीन स्लाइड आदर्श प्रतिदीप्ति स्कैनर और प्रकाश माइक्रोस्कोप के लिए अनुकूल है. इसका मतलब यह है कि प्रारूप अच्छी तरह से कई सामग्री जैविक बातचीत की खोज करने के लिए अनुकूल है. इसके अलावा, स्वरूप सामग्री के सैकड़ों समानांतर में जांच करने के लिए अनुमति देता है. यह कई और अधिक सामग्री है जिससे प्रत्येक नई सामग्री रसायन शास्त्र व्यक्तिगत रूप से जांच की है पारंपरिक तरीकों की तुलना में जांच करने के लिए अनुमति देता है. जैविक सामग्री बातचीत के लिए वृद्धि की गुंजाइश अनुमति देते हैंजैविक सतह बातचीत, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से किसी दिए गए आवेदन के लिए इष्टतम सामग्री खोजने के तंत्र की व्याख्या के लिए है.

Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

वेलकम ट्रस्ट से अनुदान कृपया (अनुदान संख्या 085245/Z/08/Z) स्वीकार किया है. नॉटिंघम नैनो और नेनौसाइंस केंद्र कृपया इस उपकरण के वित्तपोषण के लिए रमन प्रणाली तक पहुँच देने के लिए और ईस्ट मिडलैंड्स विकास एजेंसी के लिए स्वीकार किया है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Epoxy slides Genetix K2652
Contact printer Biodot XYZ3060 Platform
Metal pin ArrayIt 946MP6B
ToF-SIMS instrument ION-TOF
XPS instrument Kratos Analytical
WCA apparatus Krüss DSA 100
AFM Bruker Corporation Dimension Icon
RPMI-1640 cell culture media Sigma-Aldrich R0883
SYTO17 Invitrogen S-7579

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hook, A. L., Anderson, D. G., Langer, R., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. High throughput methods applied in biomaterial development and discovery. Biomaterials. 31, 187-198 (2010).
  2. Anderson, D. G., Levenberg, S., Langer, R. Nanoliter-scale synthesis of arrayed biomaterials and application to human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 22, 863-866 (2004).
  3. Mei, Y., Saha, K., Bogatyrev, S. R., Yang, J., Hook, A. L., Kalcioglu, Z. I., Cho, S. W., Mitalipova, M., Pyzocha, N., Rojas, F., Van Vliet, K. J., Davies, M. C., Alexander, M. R., Langer, R., Jaenisch, R., Anderson, D. G. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nature Materials. 9, 768-778 (2010).
  4. Pernagallo, S., Wu, M., Gallagher, M. P., Bradley, M. Colonising new frontiers-microarrays reveal biofilm modulating polymers. Journal of Materials Chemistry. 21, 96-101 (2011).
  5. Yang, J., Mei, Y., Hook, A. L., Taylor, M., Urquhart, A. J., Bogatyrev, S. R., Langer, R., Anderson, D. G., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer surface functionalities that control human embryoid body cell adhesion revealed by high throughput surface characterization of combinatorial material microarrays. Biomaterials. 31, 8827-8838 (2010).
  6. Urquhart, A. J., Anderson, D. G., Taylor, M., Alexander, M. R., Langer, R., Davies, M. C. High throughput surface characterisation of a combinatorial material library. Advanced Materials. 19, 2486-2491 (2007).
  7. Taylor, M., Urquhart, A. J., Zelzer, M., Davies, M. C., Alexander, M. R. Picoliter water contact angle measurement on polymers. Langmuir. 23, 6875-6878 (2007).
  8. Urquhart, A. J., Taylor, M., Anderson, D. G., Langer, R., Davies, M. C., Alexander, M. R. TOF-SIMS analysis of a 576 micropatterned copolymer array to reveal surface moieties that control wettability. Analytical Chemistry. 80, 135-142 (2008).
  9. Hook, A. L., Yang, J., Chen, X., Roberts, C. J., Mei, Y., Anderson, D. G., Langer, R., Alexander, M. R., Davies, M. C. Acrylate polymers with hydro-responsive topography. Soft Matter. 7, Forthcoming 7194-9197 (2011).
  10. Pernagallo, S., Unciti-Broceta, A., Diaz-Mochon, J. J., Bradley, M. Deciphering cellular morphology and biocompatibility using polymer microarrays. Biomedical Materials. 3, (2008).
बायोमैटिरियल्स उच्च Throughput डिस्कवरी के लिए पॉलिमर माइक्रोएरे
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).More

Hook, A. L., Chang, C. Y., Yang, J., Scurr, D. J., Langer, R., Anderson, D. G., Atkinson, S., Williams, P., Davies, M. C., Alexander, M. R. Polymer Microarrays for High Throughput Discovery of Biomaterials. J. Vis. Exp. (59), e3636, doi:10.3791/3636 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter