Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Published: March 21, 2012 doi: 10.3791/3637
Automatic Translation
1, 1
1Anatomical Institute, Department of Biomedicine, University of Basel

Summary

نقدم البروتوكول الذي يسمح لعرض وتقويم كمي والتشكل من شجرة شجيري الخلايا العصبية الفردية التي تزرع في عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ. ويهدف هذا البروتوكول إلى تعزيز الدراسات حول آليات الخلية العصبية تنمية شجيري.

Abstract

الخلايا العصبية هي نظام نموذج جذاب لدراسة التنمية شجيري، لأن لديهم شجرة شجيري إعجاب وهو موجه بدقة في المستوى السهمي وتطوير معظمها في فترة ما بعد الولادة في القوارض الصغيرة 3. وعلاوة على ذلك، والأجسام المضادة تتوفر العديد من التي يجري الخلايا تسمية انتقائي وبشكل مكثف العصبية بما في ذلك جميع العمليات، مع المضادة للCalbindin D28K الأكثر استخداما على نطاق واسع. لمشاهدة من التشعبات في الخلايا الحية والفئران معربا عن EGFP انتقائي في الخلايا العصبية 11 هي المتاحة من خلال مختبرات جاكسون. عضوي النمط المخيخ شريحة الثقافات خلايا تسمح التلاعب التجريبية سهلة من الخلايا العصبية تنمية شجيري لأن معظم التوسع شجيري من شجيري العصبية شجرة الخلية تدور بالفعل خلال الفترة ثقافة 4. نقدم هنا باختصار، بروتوكول موثوقة وسهلة لعرض وتحليل مورفولوجيا شجيري الخلايا العصبية المزروعة في organotypiج الثقافات شريحة المخيخ. لأغراض كثيرة، والتقييم الكمي للشجيري العصبية شجرة الخلية أمر مرغوب فيه. ونحن نركز هنا على معلمتين، شجيري حجم الشجرة وأرقام النقطة فرع، والتي يمكن بسرعة وبسهولة تحديد من الألغام المضادة للcalbindin الملون الثقافات شريحة المخيخ. هذه المعلمتين تسفر عن مقياس موثوق وحساسة للتغيرات في شجرة الخلية الجذعية العصبية. باستخدام المثال من العلاجات مع بروتين كيناز C PMA المنشط (بي كي سي) ومستقبلات الغلوتامات metabotropic 1 (mGluR1) ونحن لشرح كيفية الاختلافات في التنمية شجيري هي تصور وتقييم كمي. مزيج من وجود شجرة شجيري واسعة، وأساليب المناعية انتقائية ومكثفة والثقافات شريحة عضوي النمط التي تغطي فترة من النمو شجيري ونموذج الفأر مع التعبير العصبية الخلية EGFP محددة تجعل الخلايا العصبية نظام نموذجي قوية لإبراز آليات شجيري التنمية.

Protocol

1. وضع ما يصل عضوي النمط الثقافات شريحة مخيخي

يتم إعداد الثقافات شريحة مخيخي من يوم وما بعد الولادة 8 الجراء P الماوس (8) باستخدام طريقة حضانة المرض ساكنة 10. في مختبر لدينا، ونحن نستخدم B6CF1 الفئران. في بعض التجارب كانت تستخدم الفئران المعدلة وراثيا أيضا التي تعبر عن EGFP بشكل انتقائي في على الخلايا العصبية. في ذلك إعداد من الثقافات شريحة يأخذ ما يقرب من 30 دقائق لكل الجرو الماوس، 3 ساعات أي للحصول على القمامة من الجراء الماوس 6. يتم تنفيذ جميع الخطوات بها في إطار ظروف معقمة في أ الصفحي طاولة العمل تدفق مع الأدوات الجراحية تعقيمها.

  1. يتم تشريح المخيخ من الجراء الماوس P8 من الدماغ في المتوسطة إعداد الجليد-الباردة (MEM (Gibco كتالوج رقم 11٬012) مع glutamax 1:100، ودرجة الحموضة 7.3) باستخدام stereomicroscope.
  2. هو قطع المخيخ إلى شرائح 350 سميكة ميكرومتر في التوجه السهمي باستخدام المروحية الأنسجة McIlwain.
  3. يتم وضعها على شرائح على ميليبور يقوم بإدراج الثقافة الخلية (approx.6 شريحةيتم تحضين في الثانية لكل إدراج، ميليبور PICM03050) وفي 6-بشكل جيد لوحات مع 0،75 [مل] لكل بئر من المتوسطة حضانة المرض (48،35 [مل] MEM، 25 [مل] النسر متوسطة، 25 [مل] حصان حجر السامة في مصل الدم، 1ML glutamax I، 0.65 مل من أ نسبة الجلوكوز في العقيمة 10٪ حل، ودرجة الحموضة 7.3) في جو مرطب مع CO 5٪ 2 عند 37 ° C. كانوا جميعا الكواشف زراعة الأنسجة من Gibco، إينفيتروجن.
  4. يتم بدء تشغيل عادة ما العلاجات الدوائية في مدة 3 أيام في المختبر (DIV3) عن طريق إضافة المخدرات في تركيز المطلوب إلى المتوسطة الثقافة. Phorbol 12-ميريستات 13-خلات (PMA) و(RS) كانت -3،5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG) من Tocris، UK. منذ العديد من الأدوية تتطلب استخدام من DMSO أو الإيثانول لإعداد محلول المخزون (على سبيل المثال PMA) وينبغي أن الرعاية أن تؤخذ أن المبلغ الإجمالي من المذيب وأضاف للثقافة المتوسط ​​لا تتجاوز 1٪ (7.5 ميكرولتر لكل بئر). يتم تجديد هذه العقاقير جنبا إلى جنب مع التغيير من ثقافة المتوسط ​​كل بدون تاريخ 2 أو لمدة 3 أيام الثالثة و.

2. التثبيت وImmunosالحتفاظ من عضوي النمط الثقافات شريحة مخيخي

ومن المزايا المهمة لالمخيخ هو أن الأجسام المضادة هي المتاحة التي على وجه التحديد والزاهية وصمة عار الخلايا العصبية الرئيسي مخيخي، وخلايا أي بركينيي والخلايا الحبيبية. ويمكن كشفت عن مورفولوجيا شجيري من على الخلايا العصبية من قبل المناعية مع المضادة للcalbindin D28K.

  1. لتثبيت للالثقافات، تتم إزالة على المديين المتوسط ​​الثقافة ويتم إضافة 3 مل من الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في 0.1M الفوسفات المخزن المؤقت (درجة الحموضة 7.4) بعناية لكل التي تحتوي على بشكل جيد في الإدراج Millicell مع شرائح مخيخي التي تعلق على الغشاء. يتم إصلاحها الثقافات بين عشية وضحاها، ثم تتم إزالة على تثبيتي، ويوجد يتم تشطف على الثقافات مع المخزن المؤقت الفوسفات.
  2. لالمناعية يتم استخدام الأجسام المضادة التالية: أرنب المضادة للcalbindin D-28K (Swant، بيلينزونا، سويسرا) في 1:1000 لتصور بشكل انتقائي على الخلايا العصبية ووحيدة النسيلة المضادة للNeuN (Chemicon، ميليبور) في 1:500 لتصور بشكل انتقائي granuالخلايا جنيه 12. كان أرنب المضادة للGFP من Abcam، UK. كانت الفلورسنت الثانوي الأجسام المضادة اليكسا من مجسات الجزيئية، إينفيتروجن.
  3. يتم permeabilized على الثقافات وسدت عن طريق إضافة 3٪ في مصل الدم الماعز العادي + 0.3٪ TritonX100 في 0.1 المخزن المؤقت الفوسفات M (عرقلة الحل). يتم المخفف المضادة للcalbindin D28K ومضادة للNeuN-في انه قطع الحل ويتم تحضين على الثقافات مع الحل عرقلة التي تحتوي على الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في تمام الساعة 4 ° C تحت الانفعالات طفيفة. يتم الإشارة إلى جميع التخفيفات كنسبة مئوية (V / V)، يتم أخذ تريتون X100 من أ محلول المخزون 10٪ في أجل لتسهيل pipetting.
  4. يتم تشطف على الثقافات 3X مع 0.1 المخزن المؤقت الفوسفات M ويتم تحضين بعد ذلك مع الأجسام المضادة 2 الاقتضاء، على سبيل المثال الماعز المضادة للأرنب اليكسا 568 و الماعز المضادة للالماوس اليكسا 488 المخفف 1:500 في المخزن المؤقت الفوسفات 0.1M + 0.1٪ TritonX100 لمدة 2 ساعات في درجة حرارة الغرفة. يتم تشطف ثم الثقافات 3x مع المخزن المؤقت الفوسفات 0.1M.
  5. يتم إزالة شرائح الملون من الثقافةبشكل جيد مع أ فرشاة الرسام وهي التي شنت على Superfrost زائد الشرائح والزجاج، وcoverslipped مع وسيلة المناسبة تصاعد مستمر، وعلى سبيل المثال Mowiol. ويمكن الآن على الثقافات أن ينظر إليها على المجهر منتظمة مع المعدات epifluorescence أو مع المجهر مبائر.

3. الذين يعاينون من على الخلايا العصبية فردية في الثقافات شريحة عضوي النمط

  1. بعد المناعية مع D28k Calbindin اتسخت الزاهية السيتوبلازم كاملة من على الخلايا العصبية بما في ذلك التشعبات ومحور عصبي على. يرجع ذلك إلى المحاذاة كثيفة من على الخلايا العصبية في طبقة الخلية بركينيي، والعرش شجيري من الخلايا معظم بركينيي يتم متداخلة مما يجعل من الصعب لدراسة أربور كاملة من خلية واحدة الفردية. ومع ذلك، ويرجع ذلك حتى الموت خلية من خلايا بعض على الخلايا العصبية أثناء عملية إعداد، في العديد من الثقافات بعض المناطق هي الحاضر مع أ الكثافة انخفاض من على الخلايا العصبية. في مثل هذه المناطق أنه من الممكن للعثور على على الخلايا العصبية مع أ أربور شجيري كاملة الذي لا تتداخل مع غيرها من جells. في هذه الخلايا يمكن أن، أن ينظر إلى أربور شجيري والتي تم تحليلها في أ الجودة قابلة للمقارنة إلى أحد تلطيخ جولجي. لأنه في المخيخ على على الخلايا العصبية هي نوع من الخلايا فقط معربا عن Calbindin D28K يتم التي تم تحديدها أيضا الخلايا كما على الخلايا العصبية.
  2. طريقة بديلة هو لاستخدام الثقافات المستمدة من B6؛ FVB-تيراغرام من (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J الفئران (هنا دعا Pcp2-EGFP الفئران، التي تتوفر من مختبرات جاكسون) التي تعبر عن EGFP تحت الخلية بركينيي محددة L7 المروج 11. في الثقافات شريحة مثل هذه يمكن أن الذين يعيشون على الخلايا العصبية يمكن تصور من قبل التعبير من EGFP. فإنه هو الممكن أيضا أن اتبع مورفولوجيا شجيري من خلية واحدة مع مرور الوقت. بدلا من ذلك، بعد التثبيت، يمكن immunostained EGFP-معربا عن على الخلايا العصبية مع جسم مضاد المضادة للGFP. على حد سواء أساليب هي مناسبة لالتشعبات تلطيخ، والهيئات الخلية ومحاور عصبية من على الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط. لأنه لم يتم أعربت عن المروج L7 في الفئران Pcp2-EGFP في كل خلية بركينيي وهناك هي Variations في وتيرة للتعبير عن على الخلايا العصبية بين الفئران (Kapfhammer، والبيانات لا معروضة) شريحة الثقافات المستمدة من هذه الفئران تجعل من أسهل لتصور وقياس على الخلايا العصبية التي لديها الأشجار شجيري التي تتداخل مع غيرها من الأشجار بركينيي شجيري الخلية. يمكن أن أن ينظر إليها الأشجار شجيري مثل هذه بشكل فردي عندما الخلايا بركينيي مجاور، مع متداخلة الأشجار شجيري لا نبدي GFP (الشكل 1A، B).

4. القياس من الخليوي بركينيي شجيرى الحجم شجرة ونقاط فرع

  1. شجيري شجرة الحجم. يمكن أن مع وضع العلامات الفلورسنت من على الخلايا العصبية بسهولة حجم من شجرة شجيري من خلية نظرا أن تقاس إذا كان شجرة لم يتم متداخلة مع الخلايا الأخرى. وذلك لأن التسميات المناعية Calbindin جميع على الخلايا العصبية، فإنه يمكن أن يكون من الصعب لتحديد الخلايا مع المنظمات غير متداخلة الأشجار شجيري. في هذه الحالة ويوصى استخدام من Pcp2-EGFP لتبسيط في ذلك تحديد من الخلية بركينيي ما يكفي من ليالي مع المنظمات غير متداخلة الأشجار شجيري. مرة واحدة يتم التي تم تحديدها خلية بركينيي مع شجرة غير-متداخلة شجيري، فإنه يتم عرضها مع عدسة 20X ويتم تسجيل صورة مع كاميرا الرقمية. ويمكن بعد ذلك هذه الصورة يتم تحليلها مع صورة برنامج التحليل. التي نستخدمها صورة برو زائد، والذي يسمح توجز شجرة وشجيري للخلية مع بنقرة وماوس واحدة باستخدام أداة عصا سحرية في قياس واسطة (الشكل 2A). البرنامج يحسب ثم المنطقة التي تغطيها شجرة وشجيري وتصدير فإنه إلى Excel MS. ويتم ذلك تحليل الإحصائي للالبيانات مع برنامج بريزم GraphPad (انظر أدناه).
  2. عدد من النقاط فرع. يرجع ذلك إلى مورفولوجيا متفرعة للغاية وغرامة من شجيري الخلية بركينيي نقاط فرع شجرة بحاجة أن يكون عددت يدويا. يتم مكبرة أو مصغرة ملف الصورة 20X من على الخلايا العصبية في مثل هذه أن أنه يغطي معظم من الشاشة باستخدام أدوبي فوتوشوب. ثم يتم حساب كل نقطة فرع ووضع علامة مع نقطة مشرق (الشكل 2B).

= "jove_title"> 5. ممثل النتائج

رصد التنمية التي تضطلع بها شجيري بركينيي شجرة الخلية خلال الفترة الثقافة
الثقافات شريحة عضوي النمط المستمدة من Pcp2-EGFP الفئران التي تعبر عن EGFP على وجه التحديد في على الخلايا العصبية تسمح لدراسة مورفولوجيا من الخلايا الفردية خلال عدة أيام في الثقافة. يمكن أن بهذه الطريقة لطيف في نمو والتنمية التي تضطلع بها شجرة شجيري خلال الفترة الثقافة تكون موثقة. تم تصويرها الذين يعيشون التي تم تحديدها على الخلايا العصبية كل يوم RD 2 بدون تاريخ أو 3 خلال الفترة الثقافة مع ويتمثل الهدف 10X. وقد تم اختيار هذا الهدف السلطة من الأقل إلى تجنب وتقليل الضرر سمي ضيائي إلى الخلايا يرجع ذلك إلى الإضاءة مع ضوء الفلورسنت. ويبين الشكل 3 مثالين من على الخلايا العصبية تصويرها في الثقافات الذين يعيشون. وأعقب الخلية الأولى في الفترة من 2 أيام في المختبر حتى 7 أيام في المختبر (الشكل 3، AC). فإنه هو واضح أن dendritiج شجرة من هذه الخلية خلال هذه الفترة الزمنية ينمو فروع جديدة عدة ويوسع في الحجم. في المثال الثاني، وأعقب خلية بركينيي 4 حتي 11 أيام في المختبر (الشكل 3، DF). شجرة وشجيري الصغيرة حاضرا في DIV4 يوسع إلى حد كبير خلال هذه الفترة الزمنية. على حد سواء أمثلة تظهر أن معظم من شجرة شجيري من على الخلايا العصبية الحاضرة في نهاية من الفترة الثقافة لم تطوير في الواقع في الثقافة.

هو تحول دون التنمية التي تضطلع بها شجرة الخلية شجيري بركينيي من قبل PKC أو التحفيز mGluR1
تم مثقف عضوي النمط الثقافات شريحة مخيخي لمدة 11 يوما. ابتداء من الساعة في اليوم بدون تاريخ 2 في المختبر، وبعض من الثقافات تم علاج مع إما PMA (50 نانومتر)، عبارة عن ملح عضوي phorbol تحفيز PKC أو DHPG (10 ميكرومتر)، وهو ناهض mGluR1، حتى كانت ثابتة على الثقافات. وقد ثبت على حد سواء مركبات في السابق، هدفها ثنيه وتحد من بركينيي النمو شجيري الخلية 7 و 8 و 9، 5.في السيطرة غير المعالجة المتقدمة شرائح الخلايا العصبية نموذجية شجرة شجيري كبير ومتفرع للغاية التي تم تصور إما عن طريق مكافحة Calbindin المناعية (الشكل 4A) أو في الثقافات مع الخلايا EGFP، معربا عن العصبية، من خلال المناعية مع GFP مكافحة (الشكل 4D). في الثقافات تعامل مع سلطة النقد الفلسطينية تم تغيير عميق في التشكل من شجرة شجيري. يبدو أن التشعبات سميكة، وكان عدد قليل فقط الفروع الجانبية قصيرة. الخلايا العصبية كثيرة، خلافا لما حدث في الثقافات السيطرة، لم تعد القطب الواحد، مع واحد التغصنات الأولية الصادرة عن جسم الخلية، ولكن وضعت اثنين أو حتى التشعبات أكثر الابتدائي (الشكل 4B، E). انخفضت بشكل ملحوظ في الأراضي التي تغطيها الأشجار شجيري (انظر أدناه). كان هناك حالة مماثلة موجودة في DHPG المعالجة الثقافات. وقد تقلص إلى حد كبير الشجرة شجيري الخلايا العصبية من حيث الحجم وانخفض بشكل ملحوظ المتفرعة (الشكل 4C، F). ولكن كانت هناك أيضا بعض qualitatالاختلافات إيف مقارنة PMA المعالجة الثقافات. لم يكن هناك أي سماكة من فروع شجيري، والتشعبات الأولية التي العديد من التشعبات الثانوية قصيرة جدا (الشكل 4C، F) مما يدل على أن الأحداث يشير يجري في سلطة النقد الفلسطينية وDHPG المعالجة الخلايا العصبية قد تكون مشابهة، ولكن ليست متطابقة.

التقييم الكمي من الخلايا العصبية الجذعية حجم الشجرة ونقاط فرع للتقييم الكمي، يتم قياس حجم شجيري العصبية شجرة الخلية وعدد من النقاط فرع لكل خلية العصبية كما هو موضح أعلاه. يتم تجميع النتائج على الأقل من ثلاث تجارب مستقلة معا، والحد الأدنى من 20 زنزانة تحتاج إلى تحليل. يتم تحديد متوسط ​​للمنطقة التي تغطيها أشجار شجيري لتجارب السيطرة وتعيين إلى 100٪، ويتم التعبير عن القيم لتجارب أخرى كقيم في المئة وفقا لذلك. ويتم التحليل الإحصائي للبيانات باستخدام برنامج بريزم GraphPad. لأننا لانفترض أن جميع القيم التي تحدد هي جزء من توزيع جاوس، ونحن نستخدم الاختبارات الإحصائية التي لا تحمل مثل هذا التوزيع من القيم المقاسة. لمقارنة ظروف متعددة واختبار الدلالة الإحصائية، ونحن نستخدم كروسكال-اليس اختبار تليها إجراءات ملائمة لاجراء اختبارات خاصة آخر لرتبة القائم على الإحصاءات، كما، على سبيل المثال، نفذت في الاختبار البعدي ودان في بريزم GraphPad. وتعرض عادة النتائج على النحو الرسوم البيانية. واعطى مثلا على تقييم مثل هذه الإحصائية في الشكل 5. كل من تحليل حجم شجرة شجيري (الشكل 5A) وعدد من النقاط فرع لكل خلية العصبية (الشكل 5B) تظهر اختلافات واضحة بين حالة السيطرة والعلاج DHPG أو سلطة النقد الفلسطينية. وكانت كل من معلمات مختلفة مع دلالة إحصائية ع <0.001 وفقا لاختبار كروسكال-اليس.

الشكل 1
فيقوإعادة 1. EGFP التي تحمل علامات العصبية الخلية. في Pcp2-EGFP الفئران ليس كل الخلايا العصبية صريحة EGFP. ولذلك، يمكن عرض الأشجار شجيري من بعض الخلايا العصبية بشكل فردي عندما عبر عن EGFP (EGFP قناة في A) والخلايا العصبية المجاورة مع تداخل الأشجار شجيري لا (سلبي في EGFP قناة هو موضح في A، إيجابيا في تلطيخ مكافحة Calbindin أظهرت في القناة الحمراء في B). شريط النطاق = 50 ميكرومتر.

الشكل 2
الشكل 2. قياس المعلمات شجيري الخلايا العصبية. (A). يمكنك بسهولة حجم الشجرة شجيري أن تقاس عن طريق تتبع الخطوط العريضة للخلية العصبية بنقرة ماوس واحدة في برو تحليل صورة البرنامج بالإضافة إلى استخدام أداة العصا السحرية. يتم استخدام أداة العصا السحرية بحيث يتم تماما الشجرة شجيري بأكمله بما في ذلك سوما الخلية وجميع فروع شجيري محاطة الخط. (B). عدد النقاط فرع فصول التوجيه الجامعيnted يدويا في الصور من الخلايا العصبية. تم وضع علامة كل نقطة الفرع مع النقطة الصفراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر.

الشكل 3
الشكل 3. رصد تطور من شجرة الخلية الجذعية العصبية. المحددة الخلايا العصبية صورت مرارا وتكرارا لمراقبة نمو الشجرة شجيري. (AC): شجرة شجيري من خلية العصبية ينمو ويتطور من يوم في المختبر (DIV) 2 حتى DIV7. هناك نمو مستمر والمتفرعة من التشعبات خلال هذه الفترة الثقافة. (DF): شجرة شجيري من خلية العصبية ينمو ويتطور من DIV4 حتى DIV11. شجرة شجيري توسع بشكل كبير خلال هذه الفترة الثقافة. شريط النطاق = 50 ميكرومتر.

الشكل 4
الشكل 4. هو تحول دون تطوير شجرة الخلية الجذعية العصبية من قبل PKC أو stimulati mGluR1على (A)، (D): خلايا السيطرة غير المعالجة مع شجرة شجيري متطورة. (B)، (E): بعد 9 أيام من التشعبات العلاج PMA تظهر سميكة ويتم تقليل بقوة شجرة شجيري في الحجم. الخلايا غالبا ما تفقد الاستقطاب ويصبح ثنائي القطب (E). (C)، (F): بعد 9 أيام من العلاج DHPG تقلص إلى حد كبير الشجرة شجيري في الحجم. خلافا في علاج سلطة النقد الفلسطينية، العديد من الفروع الجانبية ناعم جدا وقصيرة موجودة على التشعبات الابتدائية والثانوية. الخلايا غالبا ما تفقد الاستقطاب ويصبح ثنائي القطب (F). وكانت الخلايا العصبية تصور عن الألغام المضادة للCalbindin المناعية في (A - C) والتعبير عن EGFP في الثقافات المستمدة من Pcp2-EGFP الفئران في (D - F). شريط النطاق = 50 ميكرومتر.

الشكل 5
الشكل 5. التقييم الكمي من الخلايا العصبية الجذعية حجم الشجرة والمتفرعة. القياسات الكمية تبين أن كلا من حجم الشجرة شجيري (العلوي الرسم البياني بار) وnumbe للوتقلص إلى حد كبير R من النقاط فرع (أقل الرسم البياني بار) بعد العلاج PMA أو DHPG. وكانت الخلافات بين الأشجار شجيري السيطرة والأشجار شجيري الخلايا العصبية من الثقافات تعامل كبير مع ع <0.001.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

عرض الأساليب هنا تسمح لدراسة العصبية تنمية شجيري خلية في عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ وتقييم كمي العصبية التوسع شجيري الخلايا عن طريق قياس شجيري حجم الشجرة وكانت عدد من النقاط فرع شجيري. بطبيعة الحال، على تحليل أكثر شمولا وتطورا كميا من التشعبات الخلية العصبية من الممكن، على سبيل المثال من خلال تحديد إجمالي طول شجيري، إجراء تحليل Sholl أو تحديد البعد كسورية من شجرة شجيري. لهذا النوع من التحليل هو مطلوب عادة لتعقب يدويا الخلية العصبية بأكملها شجرة شجيري في برنامج التحليل كما هو الحال مثلا العصبية سدا. في حين أن هذه الأساليب أكثر دقة تسفر بالتأكيد أعلى مستوى من التحليل (على سبيل المثال انظر 1، 6)، هم أكثر تستغرق وقتا طويلا وتتطلب المزيد من المعدات المتخصصة وبرامج التحليل بالمقارنة مع الأساليب المعروضة هنا. بالنسبة لمعظم التطبيقات، لا سيما في الحالات التي تكون فيها تغيراتتم في التشعبات الخلية العصبية هي كبيرة وواضحة من الناحية النوعية، فإن أساليب بسيطة قدمت يكون كافيا. تجدر الإشارة إلى أن عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ المستمدة من P8 الفئران لن تغطي إلا مرحلة لاحقة من الخلايا العصبية تنمية شجيري تتميز التوسع شجيري السريع. لدراسة المراحل السابقة، وطريقة ثقافة شريحة تحتاج إلى أن تتكيف مع شرائح من الحيوانات حديثي الولادة أو الجنينية التي ثم سوف تغطي المراحل السابقة من تنمية شجيري (على سبيل المثال 2).

لتصور من الخلايا العصبية في عضوي النمط الثقافات شريحة المخيخ، فقد ركزنا فقط على طريقتين الروتينية: والمناعية المضادة للCalbindin واستخدام الفئران مع EGFP معربا عن الخلايا العصبية. بالطبع مزيدا من الوسائل المتاحة، ولا سيما ترنسفكأيشن biolistic أو الفيروسية مع البروتينات الفلورية، ووضع العلامات diolistic مع الأصباغ الفلورية وحقن صبغة داخل الخلايا إلى الخلايا العصبية واحدة. اعتمادا على متطلبات الدراسة والتجهيزات المتوفرة في المختبر هذه الأساليب يمكن أن تعزز بشكل كبير من مستوى التحليل من الخلايا العصبية التشكل شجيري، على سبيل المثال عن طريق تحليل العمود الفقري شجيري باستخدام المجهر الفوتون مبائر أو اثنين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وأجريت التجارب على الحيوانات وفقا للتوجيهات المجلس الأوروبي المجتمعات من 24 تشرين الثاني 1986 (86/609/EEC) وجرى استعراض ويسمح به السلطات السويسرية. الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل جامعة بازل، قسم الطب الحيوي، واللجنة الوطنية السويسرية مؤسسة العلوم (31003A-116624).

References

  1. Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
  2. Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J. Retinoid-related orphan receptor alpha controls the early steps of Purkinje cell dendritic differentiation. J. Neurosci. 26, 1531-1538 (2006).
  3. Kapfhammer, J. P. Cellular and molecular control of dendritic growth and development of cerebellar Purkinje cells. Prog. Histochem. Cytochem. 39, 131-182 (2004).
  4. Kapfhammer, L. C. Cerebellar slice cultures. Protocols for Neural cell culture. Doering, J. P. , 4th edition, Springer Protocols Handbooks. 285-298 (2010).
  5. Gugger, O. S., Kapfhammer, J. P. Reduced size of the dendritic tree does not protect Purkinje cells from excitotoxic death. J. Neurosci. Res. 88, 774-783 (2010).
  6. Li, J., Gu, X., Ma, Y., Calicchio, M. L., Kong, D., Teng, Y. D., Yu, L., Crain, A. M., Vartanian, T. K., Pasqualini, R., Arap, W., Libermann, T. A., Snyder, E. Y., Sidman, R. L. mediates Purkinje cell dendritic development via lysyl oxidase propeptide and NF-κB signaling. Neuron. 68, 45-60 (2010).
  7. Metzger, F., Kapfhammer, J. P. Protein kinase C activity modulates dendritic differentiation of rat Purkinje cells in cerebellar slice cultures. Eur. J. Neurosci. 12, 1993-2005 (2000).
  8. Schrenk, K., Kapfhammer, J. P., Metzger, F. Altered dendritic development of cerebellar Purkinje cells in slice cultures from protein kinase C?-deficient mice. Neuroscience. 110, 675-689 (2002).
  9. Sirzen-Zelenskaya, A., Zeyse, J., Kapfhammer, J. P. Activation of class I metabotropic glutamate receptors limits dendritic growth of Purkinje cells in organotypic slice cultures. Eur. J. Neurosci. 24, 2978-2986 (2006).
  10. Stoppini, L., Buchs, P. -A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 37, 173-182 (1991).
  11. Tomomura, M., Rice, D. S., Morgan, J. I., Yuzaki, M. Purification of Purkinje cells by fluorescence-activated cell sorting from transgenic mice that express green fluorescent protein. Eur. J. Neurosci. 14, 57-63 (2001).
  12. Weyer, A., Schilling, K. Developmental and cell type-specific expression of the neuronal marker NeuN in the murine cerebellum. J. Neurosci. Res. 73, 400-409 (2003).

Tags

علم الأعصاب، العدد 61، التنمية شجيري، المتفرعة الجذعية، المخيخ والخلايا العصبية
على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The … More

Kapfhammer, J. P., Gugger, O. S. The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures. J. Vis. Exp. (61), e3637, doi:10.3791/3637 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter