Die Analyse von Purkinje Zelle Dendritische Morphologie in organotypischen Kulturen

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll, das zu sehen und zur quantitativen Beurteilung der Morphologie der dendritischen Baumes der einzelnen Purkinje-Zellen im Kleinhirn organotypischen Slice-Kulturen angebaut erlaubt. Dieses Protokoll soll Studien zu den Mechanismen der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung zu fördern.

Abstract

Purkinje-Zellen sind ein attraktives Modell für die Untersuchung dendritischen Entwicklung, weil sie eine beeindruckende Dendritenbaum die streng ausgerichtet ist in der Sagittalebene und entwickelt vor allem in der postnatalen Phase bei kleinen Nagern ³ haben. Darüber hinaus sind mehrere Antikörper zur Verfügung, die gezielt und intensiv Label Purkinje Zellen, einschließlich aller Prozesse, mit anti-Calbindin D28K die am meisten verbreitet. Zum Betrachten von Dendriten in lebenden Zellen sind Mäuse, die EGFP selektiv in Purkinje-Zellen ¹¹ bis Jackson Labs zur Verfügung. Organotypische Kleinhirn Slice-Kulturen Zellen ermöglichen eine einfache experimentelle Manipulation der Purkinje-Zellen dendritische Entwicklung, weil die meisten der dendritischen Ausbau der Purkinje Zelle Dendritenbaum tatsächlich stattfindet während der Anzucht ^4. Wir stellen Ihnen hier eine kurze, zuverlässige und einfach Protokoll für Ansicht und Analyse der dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen im organotypi gewachsenc Kleinhirn Slice-Kulturen. Für viele Zwecke ist eine quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum wünschenswert. Wir konzentrieren uns hier auf zwei Parameter, Größe und Dendritenbaum Verzweigungspunkt Zahlen, die sich schnell und einfach von anti-Calbindin gebeizt zerebelläre Schnittkulturen bestimmt werden kann. Diese beiden Parameter ergeben eine zuverlässige und empfindliche Messung der Veränderungen des Purkinjezelle Dendritenbaum. Am Beispiel der Behandlungen mit der Proteinkinase C (PKC) und der Aktivator PMA metabotropen Glutamat-Rezeptor 1 (mGluR1) zeigen wir, wie Unterschiede in der dendritischen Entwicklung visualisiert und quantitativ bewertet werden. Die Kombination des Vorhandenseins eines umfangreichen Dendritenbaum, selektive und intensive Immunfärbung Methoden organotypischen Kulturen, die die Periode des dendritischen Wachstums und einem Mausmodell Deckel mit Purkinje zellspezifische Expression EGFP machen Purkinjezellen ein leistungsfähiges Modellsystem für enthüllt die Mechanismen der dendritischen Entwicklung.

Protocol

Ein. Einrichten Organotypische Cerebellar Scheibe Kulturen

Cerebellar Slice-Kulturen aus postnatalen Tag 8 P (8) mit der Maus Welpen mit der statischen Inkubation Verfahren ¹⁰ hergestellt. In unserem Labor verwenden wir B6CF1 Mäusen. In einigen Experimenten auch transgene Mäuse wurden verwendet, ausdrücken EGFP selektiv in Purkinje-Zellen. Die Aufstellung von Slice-Kulturen dauert etwa 30 Minuten pro Maus pup, dh 3 Stunden für einen Wurf von 6 Maus Welpen. Alle Schritte werden unter sterilen Bedingungen in einer Laminar-Flow-Werkbank mit sterilisierten chirurgischen Instrumente durchgeführt.

1. Das Kleinhirn der Maus P8 Jungtieren wird aus dem Gehirn in eiskaltem Herstellungsmedium (MEM (Gibco Katalog Nr. 11012) mit Glutamax 1:100, pH 7,3) mit einem Stereomikroskop seziert.
2. Das Kleinhirn ist in 350 um dicke Scheiben in der sagittalen Ausrichtung mit Hilfe eines McIlwain Gewebe Chopper geschnitten.
3. Die Scheiben werden auf Millipore Zellkultur-Inserts (ca.6 Slice platzierts pro Einsatz, Millipore PICM03050) und werden in 6-well Platten mit 0,75 ml pro Vertiefung der Inkubationsmedium (48,35 ml MEM, 25 ml Eagle Medium, 25 ml Pferdeserum, 1ml Glutamax I, 0,65 ml einer sterilen 10% Glucose inkubiert Lösung, pH 7,3) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO ₂ bei 37 ° C. Alle Reagenzien Zellkultur wurden von Gibco, Invitrogen.
4. Pharmakologische Behandlungen sind in der Regel nach 3 Tagen in vitro (DIV3) durch Zugabe des Wirkstoffes in der gewünschten Konzentration zu dem Kulturmedium gestartet. Phorbol 12-myristat 13-Acetat (PMA) und (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycin (DHPG) stammten von Tocris, UK. Da viele Arzneistoffe die Verwendung von DMSO oder Ethanol zur Herstellung einer Stammlösung (zB PMA) erfordern sollte darauf geachtet werden, daß die Gesamtmenge des Lösungsmittels zu dem Kulturmedium zugegeben nicht mehr als 1% (7,5 ul pro Vertiefung) werden. Die Wirkstoffe werden zusammen mit der Änderung des Kulturmediums alle ^2. oder ^3. Tag erneuert.

2. Fixierung und ImmunosTaining der Organotypische Cerebellar Scheibe Kulturen

Ein wichtiger Vorteil ist, dass das Kleinhirn Antikörper verfügbar sind, die spezifisch und helle Verfärbung die prinzipiellen Kleinhirnneuronen, dh Purkinje-Zellen und Körnerzellen. Die dendritischen Morphologie der Purkinje-Zellen können durch Immunfärbung mit Anti-Calbindin D28K enthüllt werden.

1. Zur Fixierung der Kulturen wird das Kulturmedium entfernt und 3 ml kaltem 4% Paraformaldehyd in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,4) pro Vertiefung werden sorgfältig mit dem Einsatz mit der Millicell zerebelläre Scheiben an der Membran aufgenommen. Die Kulturen werden über Nacht fixiert dann das Fixiermittel entfernt und die Kulturen werden mit Phosphatpuffer gespült.
2. Immunfärbung für folgende Antikörper verwendet: Kaninchen-anti-D-Calbindin 28K (Swant, Bellinzona, Schweiz) bei 1:1000 zum selektiven Visualisierung Purkinje-Zellen und monoklonalen Anti-NeuN (Chemicon, Millipore) bei 1:500 zum selektiven Visualisierung Granulatmenle Zellen ^12. Rabbit anti-GFP war von Abcam, UK. Fluoreszierenden sekundären Alexa Antikörper wurden von Molecular Probes, Invitrogen.
3. Die Kulturen werden permeabilisiert und durch Zugabe von 3% normales Ziegenserum + 0,3% Triton X100 in 0,1 M Phosphatpuffer (Blockierungslösung) blockiert. Anti-Calbindin D28K und Anti-NeuN in Blockierungslösung verdünnt, und die Kulturen werden mit der Lösung, welche die blockierenden Antikörpern über Nacht bei 4 ° C unter leichtem Rühren inkubiert. Alle Verdünnungen in% (v / v) angegeben, erfolgt Triton X100 aus einer 10% Stammlösung genommen, um Pipettieren erleichtern.
4. Die Kulturen werden gespült 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer und werden dann mit entsprechenden zweiten Antikörper, z. B. Ziege anti-Kaninchen-Alexa 568 und Ziegen-Anti-Maus-Alexa 488 inkubiert verdünnt 1:500 in 0,1 M Phosphat-Puffer + 0,1% Triton X100 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Kulturen werden dann gespült 3x mit 0,1 M Phosphatpuffer.
5. Die gefärbten Scheiben werden aus der Kultur entferntauch mit einem Pinsel und auf Superfrost Plus Objektträger montiert und eingedeckt mit einem geeigneten Eindeckmedium, z. B. Mowiol. Die Kulturen können nun auf einer regelmäßigen Epifluoreszenz-Mikroskop mit Geräten oder mit einem konfokalen Mikroskop betrachtet werden.

3. Anzeigen einzelner Purkinje Zellen in organotypischen Kulturen

1. Nach Immunfärbung mit Calbindin D28k die komplette Zytoplasma der Purkinje-Zellen ist hell einschließlich der Dendriten und dem Axon gefärbt. Aufgrund der dichten Ausrichtung Purkinje Zellen in der Purkinje-Zellschicht werden die dendritischen Dornen von höchstens Purkinjezellen überlappenden was es schwierig macht, das komplette Dorn einer Einzelzelle zu studieren. Aufgrund Zelltod einiger Purkinjezellen während des Herstellungsverfahrens, in vielen Kulturen einige Bereiche vorhanden sind, mit einer reduzierten Dichte von Purkinje-Zellen. In solchen Gebieten ist es möglich, Purkinje-Zellen mit einem vollständigen dendritischen Dorn, der nicht mit anderen c überlappt findenEllen. In diesen Zellen kann die dendritischen arbor betrachtet und analysiert werden in einer Qualität vergleichbar mit einem Golgi-Färbung. Da im Kleinhirn die Purkinje-Zellen der einzige Zelltyp Ausdruck Calbindin D28K sind die Zellen werden auch als Purkinje-Zellen identifiziert.
2. Ein alternatives Verfahren ist es, aus Kulturen B6 abgeleitet verwenden; FVB-Tg (pCP2-EGFP) 146.244Yuza / J-Mäusen (hier genannt pCP2-EGFP Mäusen, erhältlich von Jackson Laboratories), die unter dem Ausdruck EGFP Purkinje zellspezifischen Promotor L7 ^11. In solchen Slice-Kulturen leben Purkinje Zellen visualisiert werden durch die Expression von EGFP. Es ist auch möglich, die dendritische Morphologie einer einzelnen Zelle mit der Zeit folgen. Alternativ können nach Fixation kann EGFP-exprimierende Purkinje-Zellen mit einem Anti-GFP-Antikörper immungefärbt werden. Beide Verfahren eignen sich zur Färbung Dendriten, Zellkörper und Axone der Purkinje-Zellen in organotypischen Kulturen. Weil der L7-Promotor in den pCP2-EGFP Mäusen ist nicht in jedem Purkinje-Zelle exprimiert und es gibt variationen im Frequenzbereich auszudrücken Purkinjezellen zwischen Mäusen (Kapfhammer, Daten nicht gezeigt) schneiden Kulturen von diesen Mäusen abgeleitet erleichtern, zu visualisieren und zu messen Purkinje-Zellen, die dendritischen Bäumen, die mit anderen Purkinjezelle Dendritenbäume überlappen. Solche dendritischen Bäume können einzeln betrachtet werden, wenn die benachbarten Purkinje Zellen mit überlappenden Dendritenbäumen nicht exprimieren GFP (Abbildung 1A, B).

4. Messung der Purkinje Zelle Dendritische Baum Größe und Branch Punkte

1. Dendritenbaum Größe. Mit der Fluoreszenzmarkierung Purkinjezellen die Größe des Dendritenbaum einer gegebenen Zelle kann leicht gemessen werden, wenn der Baum nicht überlappenden mit anderen Zellen werden. Da die Etiketten Calbindin Immunfärbung alle Purkinje-Zellen, kann es schwierig sein, um Zellen mit nicht überlappenden Dendritenbäume identifizieren. In diesem Fall ist die Verwendung des pCP2-EGFP ist empfehlenswert, um die Identifizierung von ausreichender Purkinjezelle vereinfachens bei nichtüberlappenden Dendritenbäume. Sobald ein Purkinje-Zelle mit einem nicht-überlappenden dendritischen Baumes identifiziert wird, wird es mit dem 20fach-Objektiv gesehen wird und ein Bild mit einer Digitalkamera aufgezeichnet. Dieses Bild kann dann mit einem Bildanalyse-Programms analysiert. Wir verwenden Image Pro Plus, das umreißt die Dendritenbaum der Zelle mit einem einzigen Mausklick mit dem Zauberstab-Werkzeug im Messbetrieb (2A) ermöglicht. Das Programm berechnet dann den durch die dendritischen Baumes abgedeckt und exportiert sie in MS Excel. Die statistische Analyse der Daten mit GraphPad Prism Software (siehe unten) erfolgen.
2. Anzahl der Verzweigungspunkte. Aufgrund der stark verzweigten und feine Morphologie der Purkinje-Zellen dendritische Ast Punkte müssen manuell gezählt werden. Die 20x-Image-Datei der Purkinjezellen ist so, dass es die meisten der Bildschirm mit Adobe Photoshop deckt erkennen. Dann wird jeder Verzweigungspunkt wird gezählt und mit einem hellen Punkt (Abbildung 2B).

Überwachung der Entwicklung der Purkinje Zelle Dendritenbaum während der Anzucht
Organotypischen Kulturen aus pCP2-EGFP-Mäusen, die EGFP exprimieren spezifisch in Purkinje-Zellen abgeleitet ermöglichen, um die Morphologie der einzelnen Zellen während mehrerer Tage in Kultur zu untersuchen. Auf diese Weise das Wachstum und die Entwicklung des Dendritenbaum während der Anzucht kann schön dokumentiert. Wohnzimmer identifiziert Purkinje Zellen wurden fotografiert jeden ^2. oder ^3. Tag während der Anzucht mit dem Objektiv 10x. Diese Low-Power-Ziel wurde gewählt, um zu vermeiden und phototoxische Schädigung der Zellen durch die Beleuchtung mit Leuchtstoffröhren. Abbildung 3 zeigt zwei Beispiele von Purkinje-Zellen im lebenden Kulturen fotografiert. Die erste Zelle wurde aus 2 Tagen in vitro bis zu 7 Tagen in vitro (Abb. 3, AC) gefolgt. Es ist offensichtlich, dass die dendritic Baum dieser Zelle während dieser Zeit wächst mehrere neue Filialen und expandiert in Größe. In dem zweiten Beispiel wurde ein Purkinje-Zelle 4 bis 11 Tagen in vitro (Abb. 3, DF) gefolgt. Der kleine Dendritenbaum anwesend DIV4 expandiert im Wesentlichen während dieser Zeit. Beide Beispiele zeigen, dass die meisten der dendritischen Struktur der Purkinje-Zellen am Ende der Kulturperiode präsentieren tatsächlich in der Kultur zu entwickeln.

Entwicklung der Purkinje-Zellen dendritische Baum wird durch PKC oder mGluR1 Stimulation inhibiert
Organotypischen zerebelläre Slice-Kulturen wurden für 11 Tage kultiviert. Ab dem ^2. Tag in vitro, einige der Kulturen wurden mit entweder PMA (50 nM), einem Phorbolester Stimulieren PKC oder DHPG (10 uM), ein mGluR1 Agonist, behandelt, bis die Kulturen wurden fixiert. Beide Verbindungen wurden bereits zu hemmen und begrenzen Purkinjezelle dendritisches Wachstum ^{7, 8, 9, 5} dargestellt.In der unbehandelten Kontrolle Scheiben Purkinje Zellen entwickelten eine typische große und hochverzweigte dendritische Baum, visualisiert entweder durch anti-Calbindin Immunfärbung (4A) oder in Kulturen mit EGFP-exprimierende Purkinje-Zellen wurde durch Immunfärbung mit Anti-GFP (4D). In Kulturen mit PMA behandelt die Morphologie der dendritischen Baum wurde grundlegend verändert. Die Dendriten erschien verdickt und hatte nur wenige Seitenzweige. Viele Purkinje-Zellen, anders als in Kontrollkulturen, waren nicht mehr unipolar, mit einer primären Dendrit ausgehenden vom Zellkörper, sondern entwickelt zwei oder noch mehr primären Dendriten (4B, E). Das Gebiet der dendritischen Baumes abgedeckt wurde deutlich reduziert (siehe unten). Eine ähnliche Situation war in DHPG-behandelten Kulturen. Die Dendritenbaum der Purkinje-Zellen wurde stark verkleinert und die Verzweigung wurde deutlich reduziert (4C, F). Allerdings gibt es auch einige qualitative Unterschiede zu PMA-behandelten Kulturen verglichen. Es gab keine Verdickung der dendritischen Äste, und die primären Dendriten durchgeführt vielen sehr kurzen sekundären Dendriten (4C, F) darauf hindeutet, dass die Signalisierungsereignisse los in PMA-behandelten und DHPG Purkinjezellen kann ähnlich, aber nicht identisch.

Quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum Größe und Branche Punkten Zur quantitativen Auswertung wird die Größe der Purkinje Zelle Dendritenbaum und die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Purkinje Zelle wie oben beschrieben gemessen. Ergebnisse von mindestens drei unabhängigen Experimenten sind zusammen gepoolt und ein Minimum von 20 Zellen analysiert werden müssen. Der Mittelwert des durch die dendritischen Bäume für den Kontrollexperimenten abgedeckt wird bestimmt und als 100% gesetzt und die Werte für die anderen Versuche werden als prozentuale Werte entsprechend ausgedrückt. Die statistische Analyse der Daten mit GraphPad Prism Software durchgeführt. Weil wir nichtangenommen, dass alle Werte bestimmt Teil einer Gaußverteilung sind, verwenden wir statistische Tests, die nicht davon ausgehen kann eine solche Verteilung der gemessenen Werte. Für den Vergleich mehrerer Bedingungen und Tests für die statistische Signifikanz, verwenden wir Kruskal-Wallis-Test nach einem geeigneten Verfahren für Post-Hoc-Tests für Rang-basierte Statistiken folgte, wie z. B. in der Dunns Post-Test in GraphPad Prism umgesetzt. Die Ergebnisse werden in der Regel als Balkendiagramme dargestellt. Ein Beispiel für eine solche statistische Auswertung ist in Abbildung 5 gegeben. Sowohl die Analyse der dendritischen Baumes Größe (5A) und die Anzahl der Verzweigungspunkte pro Purkinje Zelle (5B) zeigen deutliche Unterschiede zwischen der Kontrollgruppe und DHPG oder PMA Behandlung. Beide Parameter waren unterschiedlich mit einer statistischen Signifikanz von p <0,001 nach dem Kruskal-Wallis-Test.

FiguRE 1. EGFP-markierten Purkinje Zelle. In pCP2-EGFP Mäusen nicht alle Purkinje-Zellen exprimieren EGFP. Daher kann Dendritenbäume einiger Purkinjezellen einzeln betrachtet werden, wenn sie ausdrücklich EGFP (EGFP Kanal in A) und die benachbarten Purkinjezellen mit überlappenden Dendritenbäume nicht (negativ in EGFP Kanal in A gezeigt, positiv in die Anti-Färbung gezeigt Calbindin im roten Kanal in B). Maßstab = 50 um.

Abbildung 2. Messung der Parameter des dendritischen Purkinjezellen. (A). Die Größe des dendritischen Baumes können durch Rückverfolgung der Umriss des Purkinje Zelle mit einem einzigen Mausklick in der Bildanalyse-Software Image Pro plus mit dem Zauberstab-Werkzeug gemessen werden. Der Zauberstab wird so verwendet, dass die gesamte Dendritenbaum einschließlich des Zellsoma und alle dendritischen Zweigen vollständig umgeben von der Linie. (B). Die Zahl der Verzweigungspunkte ist coumanuell in Bilder Purkinjezellen nted. Jeder Knotenpunkt ist mit einem gelben Punkt markiert. Maßstab = 50 um.

Abbildung 3. Überwachung der Entwicklung der Purkinje Zelle dendritischen Baumes. Identifizierte Purkinje Zellen wurden wiederholt, um das Wachstum der Dendriten zu überwachen fotografiert. (AC): Dendritische Baum einer Purkinje Zelle wächst und entwickelt sich von Tag in vitro (DIV) 2 bis DIV7. Es gibt kontinuierliche Wachstum und Verzweigung der Dendriten während dieser Kulturperiode. (DF): Dendritische Baum einer Purkinje-Zelle wächst und entwickelt von DIV4 bis DIV11. Die dendritische Struktur erweitert Wesentlichen während dieser Kultur Zeitraum. Maßstab = 50 um.

Abbildung 4. Entwicklung der Purkinje-Zellen dendritische Baum wird durch PKC oder mGluR1 stimulati gesperrtauf (A), (D):. Unbehandelte Kontrollzellen mit einem gut entwickelten Dendritenbaum. (B), (E): Nach 9 Tagen nach PMA-Behandlung Dendriten erscheinen verdickt und der Dendritenbaum ist stark in Größe verringert. Cells verlieren oft ihre Polarisation und werden bipolar (E). (C), (F): Nach 9 Tagen nach DHPG Behandlung das dendritische Baum stark verkleinert. Anders als in der PMA-Behandlung, sind viele sehr feinen und kurzen vorliegende Seitenäste an den primären und sekundären Dendriten. Cells verlieren oft ihre Polarisation und werden bipolar (F). Purkinje Zellen wurden durch Anti-Calbindin Immunfärbung visualisiert (A - C) und durch EGFP-Expression in Kulturen aus pCP2-EGFP Mäuse in (D - F) abgeleitet wird. Maßstab = 50 um.

Abbildung 5. Quantitative Auswertung der Purkinje Zelle Dendritenbaum Größe und Verzweigung. Quantitative Messungen zeigen, dass sowohl Dendritenbaum Größe (obere Balken) und die number von Verzweigungspunkten (untere Balken) sind stark nach PMA oder DHPG Behandlung reduziert. Unterschiede zwischen Kontroll-Dendritenbäumen und dendritischen Bäume Purkinje Zellen von behandelten Kulturen waren signifikant mit p <0,001.

Discussion

Die hier vorgestellten Verfahren ermöglichen Purkinjezelle dendritische Entwicklung in organotypischen zerebelläre Schnittkulturen studieren und quantitativ auszuwerten Purkinjezelle dendritischen Expansion durch Messen Dendritenbaum Größe und die Anzahl der dendritischen Verzweigungspunkte. Natürlich ist ein umfangreicher und ausgefeilte quantitative Analyse von Purkinje-Dendriten möglich, z. B. durch Bestimmung der gesamten dendritischen Länge, Durchführen einer Analyse oder Sholl Bestimmung der fraktalen Dimension des dendritischen Baumes. Für diese Art der Analyse ist in der Regel erforderlich, um manuell den gesamten Trace Purkinjezelle Dendritenbaum in ein Analyseprogramm beispielsweise Neuro-Lucida. Während diese verfeinerte Methoden sicherlich ergeben ein überlegenes Niveau der Analyse (siehe z. B. ^{1, 6),} sind sie zeitaufwändig und erfordern mehr spezialisierte Ausrüstung und Analyse-Software im Vergleich zu den hier vorgestellten Methoden. Für die meisten Anwendungen, insbesondere in Situationen, wo die Änderungenin den Purkinje-Dendriten sind beträchtlich und qualitativ sichtbar, wurden die einfachen Methoden vorgestellt wird ausreichend sein. Es sollte beachtet werden, dass die organotypische zerebelläre Schnittkulturen aus P8 Mäusen abgeleitet wird nur die spätere Phase der Purkinje-Zelle dendritischen Entwicklung durch rasche Expansion gekennzeichnet dendritischen abzudecken. Für das Studium der früheren Stadien, muss der Kokultur Methode, um Scheiben von Neugeborenen oder embryonalen Tieren, die dann die früheren Phasen der dendritischen Entwicklung (z. B. ²⁾ bestimmt werden angepasst.

Die Anti-Calbindin Immunfärbung und die Verwendung von Mäusen mit EGFP exprimieren Purkinjezellen: für die Visualisierung von Purkinje-Zellen des Kleinhirns in organotypischen Kulturen Scheibe haben wir nur auf zwei Routineverfahren fokussiert. Natürlich mehr Methoden zur Verfügung, insbesondere biolistischen oder virale Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen, diolistic Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen und intrazellulären Farbstoff-Injektionen in einzelne Purkinjezellen. Je nach den Anforderungen der Studie und der verfügbaren Ausrüstung im Labor diese Verfahren erheblich verbessern kann das Niveau der Analyse der Purkinje-Zelle dendritische Morphologie, beispielsweise durch eine Analyse mit Hilfe einer konfokalen dendritischen Dornen oder zwei Photonen-Mikroskopie.