Summary
우리는 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에서 자란 개별 Purkinje 세포의 수지상 나무의 형태를 확인하고 양적 엉덩이에 할 수 있습니다 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 Purkinje 세포 수지상 개발의 메커니즘에 대한 연구를 촉진하기위한 것입니다.
Abstract
사람들이 시상면에서 엄격하게 지향하고 작은 설치류 3 출생 후의 시대에 주로 개발하고 인상적인 수지상 트리를 가지고 있기 때문에 Purkinje 세포는 수지상 개발을 공부하기위한 매력적인 모델 시스템입니다. 또한, 여러 가지 항체 안티 Calbindin의 D28K있는 모든 프로세스를 포함 선택적으로하고 집중적으로 라벨 Purkinje 세포가 가장 널리 사용되는 어떤 사용할 수 있습니다. 살아있는 세포에서 수석의보고를 들어, Purkinje 세포 11 선택적으로 EGFP을 표현 마우스 잭슨 실험실을 통해 사용할 수 있습니다. Purkinje 세포 수지상 나무의 수지상 확장의 대부분은 실제로 문화 기간 4 동안 진행되기 때문에 Organotypic 소뇌 슬라이스 문화 전지는 Purkinje 세포 수지상 개발을 쉽게 실험 조작 할 수 있습니다. 여기 organotypi에서 재배 Purkinje 세포의 수지상 형태를보고하고 분석을위한 짧은 신뢰할 수있는 쉬운 프로토콜을 제시C 소뇌 슬라이스 문화. 다양한 용도를 들어, Purkinje 세포 수지상 나무의 양적 평가는 바람직하다. 우리는 신속하고 쉽게 방지 calbindin 스테인드 소뇌 슬라이스 문화로부터 결정될 수있다 두 개의 매개 변수, 수지상 나무의 크기와 분기점 번호에 여기에 집중. 이 두 매개 변수는 Purkinje 세포 수지상 나무의 변경 안정적이고 민감한 측정을 얻을 수 있습니다. 단백질 키나제 C (PKC) 활성 PMA 우리는 수지상 개발의 차이를 시각적으로 그리고 양적 평가 방법을 보여줍니다 metabotropic glutamate 수용체 1 (mGluR1)와 트리트먼트 예를 사용합니다. 다양한 수지상 나무, 선택과 강렬한 immunostaining 방법, 수지상의 메커니즘을 공개에 대한 Purkinje 세포 강력한 모델 시스템을 Purkinje 세포 특정 EGFP 발현과 수지상 성장과 마우스 모델의 기간을 커버 organotypic 슬라이스 문화의 존재의 결합 개발.
Protocol
1. Organotypic 소뇌 슬라이스 문화 설정
소뇌 슬라이스 문화가 출생 후의 일에서 정적 부화 방법 (10)을 사용하여 8 P (8) 마우스 새끼를 준비하고 있습니다. 저희 연구실에서는, 우리는 B6CF1 마우스를 사용합니다. 일부 실험에서도 유전자 변형 생쥐는 Purkinje 세포에 선택적으로 EGFP을 표현하는 데 사용되었습니다. 슬라이스 문화의 준비는 6 마우스 새끼의 쓰레기에 마우스 새끼, 즉 3시간 당 약 30 분 정도 소요됩니다. 모든 단계를 소독 수술기구와 층류의 작업대에서 무균 조건 하에서 수행됩니다.
- P8 마우스 새끼의 소뇌는 stereomicroscope를 사용하여 얼음처럼 차가운 준비 매체 (가상 (Gibco 카탈로그 번호 11012) glutamax 1:100, 산도 7.3 포함)의 뇌 분석하던됩니다.
- 소뇌는 McIlwain 조직 헬기를 사용하여 시상 방향으로 350 μm 두께의 조각으로 절단됩니다.
- 조각은 Millipore 세포 배양 삽입 (approx.6 슬라이스에 배치됩니다삽입, Millipore PICM03050) 당 s와는 0.75 ML 당 잘의 부화 매체 (48.35 ML 가상, 25 ML 이글 보통, 25 ML 말 혈청, 1ml glutamax I, 살균 10 % 포도당의 0.65 ML과 6 잘 접시에 incubated 아르 37 번 5 % CO 2 humidified 분위기 속에서 솔루션 산도 7.3) ° C. 모든 조직 문화 시약은 Gibco, Invitrogen에서 있었다.
- 약리 치료는 일반적으로 문화 매체에 원하는 농도로 약물을 추가하여 체외 (DIV3)에서 3 일 시작됩니다. Phorbol 12 myristate의 13-아세테이트 (PMA)와 (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (DHPG)는 Tocris, 영국에서 있었다. 많은 마약이 주식 솔루션 (예 : PMA)를 준비 DMSO 또는 에탄올의 사용을 필요로하기 때문에 용매의 총 금액은 (물론 당 7.5 μl) 1 %를 초과하지 않는 문화 매체에 추가 한주의주의해야한다. 약물은 문화 매체 매 2 차 또는 3 일의 변화와 함께 갱신됩니다.
2. 고정 및 ImmunosOrganotypic 소뇌 슬라이스 문화의 taining
소뇌의 중요한 장점은 항체가 특별히 밝은 교장 소뇌 뉴런, 즉 Purkinje 세포와 과립 세포를 금방 치료하실 수 있습니다 것입니다. Purkinje 세포의 수지상 형태는 반 calbindin의 D28K과 immunostaining에 의해 공개 할 수 있습니다.
- 문화의 고정은 문화 매체가 제거되고 0.1M 인산 버퍼 (산도 7.4)에서 추운 4 % paraformaldehyde 3 ML 잘 막에 부착 된 소뇌 슬라이스로 Millicell 삽입을 포함하는 당 신중 추가됩니다. 문화는 하루 아침에 해결되는 다음 정착액이 제거되고 문화가 인산염 버퍼로 헹구어 있습니다.
- immunostaining를 들어 다음과 같은 항체를 사용합니다 : 토끼 반 calbindin D-28K을 (Swant, Bellinzona, 스위스) 1:1000에서 선택적으로 선택적으로 granu를 시각화에 대한 1:500에서 Purkinje 세포와 단클론 항 NeuN (Chemicon, Millipore)를 시각화에 대한르 세포 12. 토끼 반 GFP는 Abcam, 영국에서왔다. 형광등 보조 알렉사 항체는 분자 프로브, Invitrogen에서 있었다.
- 문화는 0.1 M 인산 버퍼 (솔루션을 차단)에 3% 정상 염소 혈청 + 0.3 % TritonX100을 추가하여 permeabilized 및 차단됩니다. 안티 calbindin D28K 및 안티 NeuN이 솔루션을 차단에 희석되고 문화가 약간의 동요에 따라 4에 밤새 항체 ° C를 포함하는 차단 솔루션을 incubated 수 있습니다. 모든 dilutions가 % (V / V)로 표시됩니다, 트리톤의 X100은 pipetting을 촉진하기 위해 10 %의 재고 솔루션에서 가져옵니다.
- 문화는 0.1 M 인산 버퍼로 3 배 헹구어 된 다음 적절한 초 항체, 예를 들어 염소 안티 - 토끼 알렉사 568과 염소 안티 - 마우스 알렉사 488와 incubated 아르는 + 0.1 % TritonX100에서 2 시간 동안 0.1M 인산 버퍼에 1:500을 희석 실내 온도. 문화 그런 다음 0.1M 인산 버퍼로 3 배 헹구어 있습니다.
- 스테인드 조각은 문화에서 삭제됩니다잘 붓으로하고 Superfrost 플러스 유리 슬라이드에 장착하고 적절한 장착 매체, 예를 들어 Mowiol과 coverslipped. 문화는 이제 epifluorescence 장비를 갖춘 일반 현미경 또는 공 촛점 현미경으로 볼 수 있습니다.
3. Organotypic 슬라이스 문화에서 개인 Purkinje 세포보기
- Calbindin D28k과 immunostaining 후 Purkinje 세포의 전체 세포질는 밝은 수석과 축삭 등의 얼룩이 있습니다. Purkinje 세포 레이어에 Purkinje 세포의 조밀 한 배열로 인해, 대부분의 Purkinje 세포의 수지상 울타리, 나무는 힘들 개별 셀의 전체 아버을 공부하고 중복되어 있습니다. 그러나 준비 과정에서 일부 Purkinje 세포의 세포 사망으로 인해, 많은 문화에 일부 지역은 Purkinje 세포의 감소 밀도 존재한다. 이러한 지역에서는 다른 C와 중복되지 않는 완전한 수지상의 아버와 Purkinje 세포를 발견 할 수 있습니다ells. 이러한 세포에서 수지상 식목일을 볼 수 있으며, Golgi의 착색에 필적하는 품질 분석했다. 소뇌에 Purkinje 세포가 Calbindin D28K을 표현하는 유일한 세포 유형입니다 때문에 세포도 Purkinje 세포로 표시되어 있습니다.
- 다른 방법은 B6에서 파생 문화를 사용하는 것입니다, FVB-TG (Pcp2-EGFP) 146.244Yuza / J 마우스 (여기서 Pcp2-EGFP 마우스라는, 잭슨 실험실에서 사용할 수)은 Purkinje 세포 특정 L7 발기인 11에서 EGFP을 표현된다. 이러한 슬라이스 문화에 살고있는 Purkinje 세포는 EGFP의 표현으로 시각화 할 수 있습니다. 그것은 시간이 지남에 따라 하나의 세포의 수지상 형태를 따라하는 것도 가능합니다. 또는 고정 후, EGFP-표현 Purkinje 세포는 안티 - GFP 항체와 immunostained 할 수 있습니다. 두 방법은 착색의 수석, 세포 기관 및 organotypic 문화의 Purkinje 세포의 axons에 적합합니다. Pcp2-EGFP 마우스의 L7 발기인은 모든 Purkinje 세포에 표현 및 V가 있습니다 있지 않기 때문에마우스 (Kapfhammer, 데이터가 표시되지 않음) 사이의 Purkinje 세포를 표현의 주파수에 ariations이 마우스에서 파생 된 문화가 쉽게 다른 Purkinje 세포 수지상 나무와 중복 수지상 나무를 Purkinje 세포를 시각화하고 측정 할 수 있도록 잘라. 수지상 나무를 중복으로 이웃 Purkinje 세포는 명시 적 GFP (그림 1A, B) 안하면 이러한 수지상 나무는 개별적으로 볼 수 있습니다.
4. Purkinje 세포 수지상 트리 크기 및 지점 포인트의 측정
- 수지상 나무 크기입니다. 나무가 다른 세포와 중복되지 않는 경우 Purkinje 세포의 형광 라벨과 함께 주어진 셀의 수지상 나무의 크기는 쉽게 측정 할 수 있습니다. Calbindin의 immunostaining 라벨 모든 Purkinje 세포 있기 때문에 수지상 나무를 겹치지와 세포를 식별하기 어려울 수 있습니다. 이 경우 Pcp2-EGFP의 사용은 충분한 Purkinje 세포의 식별을 단순화하는 것이 좋습니다겹치지 수지상 나무들. 겹치지 수지상 나무와 Purkinje 세포가 확인되면,이 20x 렌즈 조회되고 이미지는 디지털 카메라로 기록됩니다. 이 이미지는 다음 이미지 분석 프로그램 분석 할 수 있습니다. 우리는 모드 (그림 2A)를 측정 마술 지팡이 도구를 사용하여 한 번의 마우스 클릭으로 세포의 수지상 트리를 요약 할 수 있습니다 이미지 프로 플러스를 사용합니다. 이 프로그램은 다음 수지상 트리에 포함하고 MS 엑셀로 수출 영역을 계산합니다. 데이터의 통계 분석은 GraphPad의 프리즘 소프트웨어 (아래)로 이루어집니다.
- 지점 지점의 개수입니다. Purkinje 세포 수지상의 나뭇 가지 포인트의 높은 분지와 훌륭한 형태로 인해 수동으로 계산해야합니다. Purkinje 세포의 20x 이미지 파일은 어도비 포토샵을 사용하여 화면의 대부분을 포함하는 등 확대됩니다. 그런 다음 모든 지점 지점 계산하고 밝은 점 (그림 2B)로 표시됩니다.
문화 기간 동안 Purkinje 세포 수지상 나무의 개발을 모니터링
Purkinje 세포에 구체적으로 EGFP을 표현 Pcp2-EGFP 마우스에서 파생 Organotypic 슬라이스 문화는 문화에 몇 일 동안 개별 셀의 형태를 연구 할 수 있습니다. 이 방법은 문화 기간 동안 수지상 나무의 성장과 발전은 멋지게 문서화 할 수 있습니다. 생활 식별 Purkinje 세포는 10 배 목적과 문화 기간 동안 매 2 차 또는 3 일 촬영했다. 이 저전력 목적은 형광등과 조명으로 인해 셀에 phototoxic 손상을 방지하고 최소화하기 위해 선정되었습니다. 그림 3은 생활 문화에 사진 Purkinje 세포의 두 가지 예를 보여줍니다. 첫 번째 셀은 체외 (그림 3, AC) 7 일까지 체외에서 2 일에서졌습니다. 그것은 분명입니다 dendriti이 기간 동안 세포의 C 트리은 다음과 같은 여러 가지 새로운 지점을 증가하고 크기가 확장됩니다. 두 번째 예에서, Purkinje 세포는 체외 (그림 3, DF)에 4-11일에서졌습니다. DIV4에 참석 작은 수지상 나무는이 기간 동안 실질적으로 확장됩니다. 두 예는 Purkinje 세포의 수지상 나무의 대부분은 실제로 문화 발전 않은 문화 시대의 끝 부분에 제시 보여준다.
Purkinje 세포 수지상 나무의 개발은 PKC 또는 mGluR1 자극에 의해 저해된다
Organotypic 소뇌 슬라이스 문화는 11 일 동안 배양 하였다. 문화의 일부가 문화가 해결 될 때까지 PMA (50 NM), PKC 또는 DHPG (10 μM), mGluR1 작용제을 자극 phorbol 에스테르, 하나와 대우, 체외에서 2 차 일에 시작합니다. 두 화합물은 Purkinje 세포 수지상의 성장 7, 8, 9, 5을 억제하고 제한하는 이전에 표시되어 있습니다.치료 컨트롤에 조각 Purkinje 세포는 안티 GFP (그림 4D)로 immunostaining에 의해, 항 Calbindin immunostaining (그림 4A) 또는 EGFP - 표현 Purkinje 세포와 문화의 중 시각화 된 전형적인 크고 높은 분기 수지상 나무를 개발했다. PMA로 치료 문화에서 수지상 나무의 형태는 뿌리깊은 변경되었습니다. 수석이 두꺼워 나타나 단 몇 짧은 사이드 가지를했다. 많은 Purkinje 세포는, 컨트롤 문화 달리, 하나의 기본 dendrite는 전지 본체에서 냄새가 나는데과 함께 더 이상 유니 폴라 없었하지만, 두 개 더 주 수석 (그림 4B, E)를 개발했다. 수지상 나무의 적용 영역이 현저하게 (아래) 감소했다. 비슷한 상황은 DHPG - 처리 문화에 존재했다. Purkinje 세포의 수지상 나무는 크게 크기 감소 및 브랜칭이 현저하게 (그림 4C, F) 감소했다. 그러나 일부 qualitat도있었습니다필자의 차이는 PMA-처리 문화를 비교했다. 이 수지상 가지의 더 두꺼워은 없었고 차 수석이 신호 이벤트가 유사하지만 동일하지 수 있습니다 PMA와 DHPG - 처리 Purkinje 세포에가는 것을 제안합니다 (그림 4C, F) 많은 아주 짧은 보조 수석를 실었다.
위에서 설명한 Purkinje 세포 수지상 나무의 크기와 정량 평가를위한 지사 지점의 정량 평가, Purkinje 세포 수지상 나무와 Purkinje 세포 당 분기 지점의 수의 크기가 측정됩니다. 적어도 세 독립적 인 실험의 결과는 함께 풀링, 20 셀의 최소 분석 할 필요가있다. 제어 실험을위한 수지상 나무의 적용 영역의 평균이 결정에서 100 %로 설정하고, 다른 실험의 값이 그에 따라 %의 값으로 표현됩니다 있습니다. 데이터의 통계 분석은 GraphPad의 프리즘 소프트웨어와 함께 이루어집니다. 우리는하지 때문에결정 모든 값이 가우스 분포의 일부 가정, 우리는 측정 값의 이러한 분포를 가정하지 않는 통계 테스트를 사용합니다. 통계적 유의미성에 대해 여러 조건과 테스트를 비교를 들어, 우리는 GraphPad의 프리즘에서 던의 포스트 테스트에 구현 예를 들어, 같은 순위 기반의 통계에 대한 게시물 임시 검사에 대해 적절한 절차에 이어 Kruskal-월리스 테스트를 사용합니다. 결과는 일반적으로 막대 그래프로 표시됩니다. 이러한 통계 평가의 예는 그림 5에 있습니다. 수지상 나무 크기의 분석 (그림 5A)와 Purkinje 세포 당 분기 포인트 (그림 5B)의 수를 모두 제어 상태와 DHPG 또는 PMA 치료 사이의 명확한 차이를 보여줍니다. 두 매개 변수는 Kruskal-월리스 시험에 따라 P <0.001의 통계적 유의미성과 달랐다.
Figu1 다시. Purkinje 세포 EGFP - 라벨. Pcp2-EGFP 쥐 모든 Purkinje 세포 특급 EGFP. 따라서 일부 Purkinje 세포의 수지상 나무 (긍정적, A에 표시된 EGFP 채널에 부정적인 표시된 방지 Calbindin 착색의 사람들이 표현 EGFP (A에서 EGFP 채널)와 수지상 나무를 중복으로 이웃 Purkinje 세포 안 때 개별적으로 볼 수 있습니다 B의 붉은 색 채널에). 스케일 바 = 50 μm.
그림 2. Purkinje 세포의 수지상 매개 변수의 측정. (A). 수지상 나무의 크기는 쉽게 이미지 분석 소프트웨어 이미지 프로에서 하나의 마우스 클릭으로 Purkinje 세포의 윤곽을 추적 플러스 마술 지팡이 도구를 사용하여 측정 할 수 있습니다. 마법 지팡이 도구는 셀 소마 모든 수지상 지점을 포함하여 전체 수지상 트리가 완전히 라인들로 둘러 쌓여 있고 그러한 사용됩니다. (B). 지점 지점의 수는 불은입니다Purkinje 세포의 이미지를 수동으로 nted. 모든 분기점은 노란색 점으로 표시됩니다. 스케일 바 = 50 μm.
그림 3. Purkinje 세포 수지상 나무의 개발을 모니터링. 확인 된 Purkinje 세포는 수지상 나무의 성장을 모니터링하기 위해 반복적으로 촬영되었다. (AC) : Purkinje 세포의 수지상 나무가 DIV7 때까지 체외 (DIV) 2 일부터 성장과 개발. 이 문화 기간 동안 수석의 지속적인 성장과 분기가 있습니다. (DF) : Purkinje 세포의 수지상 나무가 DIV11까지 DIV4에서 성장과 개발. 수지상 나무는이 문화 기간 동안 실질적으로 확장됩니다. 스케일 바 = 50 μm.
4 그림. Purkinje 세포 수지상 나무의 개발은 PKC 또는 mGluR1 stimulati에 의해 저해된다의 (A), (D) :. 잘 개발 수지상 나무 치료 제어 세포. (B), (E) : PMA 처리 수석 9 일이 지나면 두꺼워 표시하고 수지상 나무는 강력 크기에 감소된다. 세포는 종종 자신의 분극을 잃게 양극성 (E)됩니다. (C), (F) : DHPG 치료의 9 일 후 수지상 나무는 크게 크기로 줄어 듭니다. PMA 처리는 달리, 많은 아주 좋아하고 짧은 사이드 가지 기본 및 보조 수석에 존재한다. 세포는 종종 자신의 분극을 잃게 양극성 (F)이된다. (- F D)에 Pcp2-EGFP 마우스에서 파생 된 문화에서 - (C)와 EGFP 표현의 Purkinje 세포는 안티 Calbindin immunostaining으로 시각화했다. 스케일 바 = 50 μm.
그림 5. Purkinje 세포 수지상 나무의 크기와 가지. 수량 측정을의 양적 평가는 보여주고 수지상 나무 크기 (상단 막대 그래프)와 numbe 모두지점 포인트 (낮은 막대 그래프)의 연구가 크게 PMA 또는 DHPG 치료 후 감소된다. 제어 수지상 나무와 치료 문화의 Purkinje 세포의 수지상 나무 사이의 차이는 P로 크게 <0.001이었다.
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Discussion
방법은 organotypic 소뇌 슬라이스 문화에 Purkinje 세포 수지상 개발을 연구하고 양적 수지상 나무의 크기와 수지상 지점 지점의 수를 측정하여 Purkinje 세포 수지상 확장을 평가할 수 있습니다 여기에 소개했다. 물론, Purkinje 세포 수석의 더 광범위하고 정교한 정량 분석은 총 수지상의 길이를 결정하는 Sholl 분석을 수행하거나 수지상 나무의 프랙탈 차원을 결정하여 예를 들어, 수 있습니다. 분석이 유형의 위해 일반적으로 수동으로 예를 들어 신경 Lucida에 대한 같은 분석 프로그램에 전체 Purkinje 세포 수지상 트리를 추적하는 데 필요합니다. 이 더 세련된 방법을 확실히 분석의 높은 레벨 (예를 들면 1, 6 참조) 얻을 수 있지만, 더 많은 시간이 소요되어 있으며 여기에 제시된 방법에 비해보다 전문적인 장비와 분석 소프트웨어를 필요로합니다. 대부분의 응용 프로그램에 대한, 경우에 특히 위치 변경Purkinje 세포 수석에 상당한와 질적 볼 수 있습니다, 제시된 간단한 방법은 충분한 수 있었다. 그것은 P8 마우스에서 파생 된 organotypic 소뇌 슬라이스 문화가 빠른 수지상 확장을 특징으로 Purkinje 세포 수지상 개발 만 나중에 상을 충당 할 수 있다는 것을 알아야한다. 초기 단계의 연구를 들어, 슬라이스 문화 방법은 다음 수지상 발전의 초기 단계 (예 2) 충당 할 신생아 나 태아의 동물 조각에 적응해야합니다.
반 Calbindin immunostaining와 Purkinje 세포를 표현 EGFP와 마우스의 사용 : organotypic 소뇌 슬라이스 문화의 Purkinje 세포의 시각화를 위해, 우리는 두 일상적인 방법에 초점을 맞추고 있습니다. 물론 더 많은 방법은 형광 단백질, 단일 Purkinje 세포에 형광 염료와 염료 세포 주사와 diolistic 라벨과 함께 특정 biolistic 또는 바이러스 transfection에 사용할 수 있습니다. 연구와 이러한 방법이 상당히 공 촛점 또는 두 개의 광자 현미경을 사용하여 수지상 쪽을 분석하여 예를 들어, Purkinje 세포 수지상의 형태의 분석 수준을 향상시킬 수 있습니다 실험실에서 사용할 수있는 장비의 요구 사항에 따라.
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Disclosures
동물 실험은 1986년 11월 24일 (86/609/EEC)의 유럽 커뮤니티위원회 지침에 따라 수행되었으며, 검토 및 스위스 당국에 의해 허가되었습니다. 저자는 공개 할 수 없어요.
Acknowledgments
이 작업은 바젤 (Basel) 대학 생물 의약 부, 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation) (31003A-116624)에 의해 지원되었다.
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