Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Summary

Мы представляем протокол, который позволяет просматривать и количественно ослов морфологии дендритных деревьев отдельных клеток Пуркинье, выращенных в культурах мозжечка органотипических срез. Этот протокол предназначен для поощрения исследований о механизмах развития Пуркинье дендритные клетки.

Abstract

Клетки Пуркинье являются привлекательной модельной системой для изучения дендритных развития, потому что они имеют впечатляющие дендритных дерева, строго ориентированы в сагиттальной плоскости и развивается в основном в послеродовой период в мелких грызунов ^3. Кроме того, некоторые антитела, которые избирательно и интенсивно этикетке клеток Пуркинье, включая все процессы, с анти-кальбиндин D28K настоящее время наиболее широко используется. Для просмотра дендритов в живых клетках мышей, экспрессирующих EGFP выборочно в клетках Пуркинье ¹¹ доступны через Джексона лабораторий. Органотипической мозжечка срез культуры клеток позволяет легко экспериментальные манипуляции Пуркинье развития дендритных клеток, потому что большинство из дендритных расширения дендритных клеток Пуркинье дерево на самом деле происходит в культуре периода ^4. Мы приведем здесь краткий, надежный и простой протокол для просмотра и анализа морфологии дендритных клеток Пуркинье, выращенных в organotypiС мозжечка культур срез. Для многих целей количественной оценки дендритных клеток Пуркинье дерево является желательным. Мы сосредоточимся на двух параметров: размер дендритных деревьев и номера точки ветвления, которые могут быть быстро и легко определяется из анти-кальбиндин окрашенных мозжечка культур срез. Эти два параметра дают надежной и чувствительной мерой изменения Пуркинье дерево дендритные клетки. На примере процедуры с протеинкиназы С (ПКС) активатор PMA и метаботропных рецептора глутамата 1 (mGluR1) мы покажем, как различия в дендритных развития визуализировать и количественно оценить. Сочетание наличия обширного дерева дендритные, селективный и интенсивный методы иммуноокрашивания, органотипических культур срез которой охватывают период рост дендритов и мышь модели с клеток Пуркинье конкретное выражение EGFP сделать клетки Пуркинье мощная модель системы для выявления механизмов дендритные развития.

Protocol

1. Настройка органотипической мозжечка культур Slice

Мозжечка культур срез получают из 8-й день послеродового P (8) мышь щенков с помощью статического метода инкубации ^10. В нашей лаборатории мы используем B6CF1 мышей. В некоторых экспериментах также трансгенных мышей были использованы, которые выражают EGFP выборочно в клетках Пуркинье. Подготовка срез культуры занимает около 30 минут на мышь щенка, то есть 3 часа на подстилке из 6 щенков мыши. Все действия проводятся в стерильных условиях в верстаке ламинарного потока с стерилизованных хирургических инструментов.

1. Мозжечка P8 щенков мыши разрезали из мозга в ледяной подготовки среде (MEM (Gibco № по каталогу 11012) с Glutamax 1:100, рН 7,3) использованием стереомикроскопа.
2. Мозжечок нарезать 350 мкм ломтики толщиной в сагиттальной ориентацию с помощью вертолета McIlwain ткани.
3. Ломтиками размещены на Millipore культуре клеток вставками (около 6 ломтикс на вставку, Millipore PICM03050) и инкубируют в 6-луночные планшеты с 0,75 мл на лунку среде инкубации (48,35 мл MEM, 25 мл Eagle Medium, 25 мл лошадиной сыворотки, 1 мл Glutamax I, 0,65 мл стерильного 10% раствора глюкозы раствор, рН 7,3) во влажной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° C. Все реагенты культуре ткани были от Gibco, Invitrogen.
4. Фармакологические методы лечения, как правило, начался в 3 дня в пробирке (DIV3) путем добавления препарата в необходимой концентрации в культуральной среде. Форболового 12-миристат 13-ацетат (PMA) и (RS) -3,5-Dihydroxyphenylglycine (ДХПГ) были из Tocris, Великобритания. Поскольку многие препараты требуют использования ДМСО или этанола для приготовления раствора (например, PMA) следует позаботиться о том, что общее количество растворителя добавляют к культуральной среде не превышает 1% (7,5 мкл на лунку). Препаратов обновляется вместе с изменением культуры средних каждый ^2-й или ^3-й день.

2. Фиксация и Immunosсодержащие в органотипической мозжечка культур Slice

Важным преимуществом мозжечка является то, что антитела, которые специфически и яркие пятна основной нейронов мозжечка, то есть клетки Пуркинье и гранулярных клеток. Дендритной морфологии клеток Пуркинье может быть обнаружено иммунной анти-кальбиндин D28K.

1. Для фиксации культуры, культуральную среду удаляют и 3 мл холодной 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (рН 7,4) осторожно добавляют в лунку, содержащую вставку Millicell с мозжечковой ломтиками прикреплены к мембране. Культуры фиксируются ночи, затем фиксатор удаляется и культуры промывали фосфатным буфером.
2. Для иммунной следующие антитела используются: кроличьих анти-кальбиндин D-28K (Swant, Bellinzona, Швейцария) в 1:1000 для выборочной визуализации клеток Пуркинье и моноклональных анти-NeuN (Chemicon, Millipore) в 1:500 для выборочной визуализации гранулированноголе клетки ^12. Кролик анти-GFP был из Abcam, Великобритания. Флуоресцентные вторичными антителами Alexa были из Molecular Probes, Invitrogen.
3. Культур и их проницаемость, добавляя 3% нормальной козьей сывороткой + 0,3% TritonX100 в 0,1 М фосфатного буфера (блокирующий раствор). Anti-кальбиндин D28K и анти-NeuN разводят в блокировании решения и культуры инкубируют с блокирующим раствором, содержащим антитела в течение ночи при 4 ° С при небольшом волнении. Все разведения обозначаются как% (V / V), Triton X100 взята из 10% раствора в целях содействия пипетки.
4. Культуры промывают 3 раза с 0,1 М фосфатного буфера, а затем инкубировали с соответствующими вторыми антителами, например, козий анти-кроличий Alexa 568 и антимышиного Alexa 488 разбавляли 1:500 в буфере 0,1 М фосфатного + 0,1% TritonX100 течение 2 часов при комнатной температуре. Культуры затем промывали 3 раза с 0,1 М фосфатного буфера.
5. Окрашенных кусочков удаляют из культурыа с кистью и установлены на Superfrost плюс стеклах и coverslipped с соответствующей монтажной среды, например Mowiol. Культурах теперь может быть просмотрен на регулярной микроскоп с эпифлуоресцентной оборудования или с конфокальной микроскопии.

3. Просмотр отдельных клеток Пуркинье в органотипической культур Slice

1. После иммунной с кальбиндин D28k полной цитоплазме клеток Пуркинье ярко окрашенных в том числе дендритов и аксонов. В связи с плотным выравнивание клеток Пуркинье в слое клеток Пуркинье, дендритных беседки большинства клеток Пуркинье накладываются друг на друга, что затрудняет изучение полного беседки одной отдельной клетки. Однако в связи с гибелью клеток некоторых клеток Пуркинье в процессе подготовки, во многих культурах некоторых районах присутствуют с пониженной плотности клеток Пуркинье. В таких местах можно найти клетки Пуркинье с полным дендритных беседки, которая не пересекается с другими слоктей. В этих клеток, дендритных беседки могут быть просмотрены и проанализированы в качество, сравнимое с окрашиванием Гольджи. Потому что в мозжечок клетки Пуркинье являются единственным типом клеток, экспрессирующих кальбиндин D28K клетки также определены как клетки Пуркинье.
2. Альтернативным методом является использование культур, полученных от B6; FVB-Tg (PCP2-EGFP) 146.244Yuza / J мышей (здесь называется PCP2-EGFP мыши, доступны Джексон лабораторий), которые выражают EGFP под клеток Пуркинье конкретных L7 промоутер ^11. В таких культурах кусочек живой клетки Пуркинье может быть визуализированы с помощью выражения EGFP. Также можно следить за дендритных морфологии одну ячейку с течением времени. Кроме того, после фиксации, EGFP-экспрессирующих клеток Пуркинье может быть иммуноокрашиванию с анти-GFP антител. Оба метода подходят для окрашивания дендритов, клеточных тел и аксонов клеток Пуркинье в органотипических культур. Поскольку L7 промоутер в PCP2-EGFP мышей выражается не в каждой клетке Пуркинье и есть Variations в частотном выражения клеток Пуркинье между мышами (Kapfhammer, данные не приведены) нарезать культур, полученных из этих мышей сделать его проще для визуализации и измерения клеток Пуркинье, которые имеют дендритных деревьев, которые пересекаются с другими деревьями дендритных клеток Пуркинье. Такие деревья дендритных можно рассматривать индивидуально, когда соседние клетки Пуркинье с перекрытием дендритных деревьев не экспрессируют GFP (рис. 1а, б).

4. Измерение дендритных клеток Пуркинье размера дерева и точек ветвления

1. Дендритные размера дерева. С флуоресцентные маркировки клеток Пуркинье размер дендритных дерева данную ячейку можно легко измерить, если дерево не перекрываются с другими клетками. Потому что кальбиндин иммуноокрашивания этикетки всех клеток Пуркинье, это может быть трудно идентифицировать клетки с неперекрывающимися дендритных деревьев. В этом случае использование PCP2-EGFP рекомендуется для упрощения идентификации достаточно клеток Пуркиньес с неперекрывающимися дендритных деревьев. После клеток Пуркинье с неперекрывающимися дендритных дерева определена, она воспринимается с 20-кратным объективом и записи изображения с цифровой камеры. Это изображение может быть проанализирован с программой анализа изображений. Мы используем Image Pro Plus, которая позволяет с изложением дендритных дерева клетки с помощью одного щелчка мыши, используя инструмент Magic Wand Tool в режиме измерения (рис. 2A). Затем программа вычисляет площадь, покрытая дендритных деревьев и экспортирует его в MS Excel. Статистический анализ данных производится с GraphPad Prism программы (см. ниже).
2. Количество точек ветвления. В связи с сильно разветвленными и тонкой морфологии клеток Пуркинье дендритных пунктов ветки дерева нужно считать вручную. 20x файл изображения клеток Пуркинье, увеличивается масштаб такой, что она охватывает большую часть экрана с помощью Adobe Photoshop. Тогда каждая точка ветвления считается и отмечена яркая точка (рис. 2В).

Мониторинг развития дендритных клеток Пуркинье дерево в культуре периода
Органотипической культур срез полученных из PCP2-EGFP мышей, которые выражают EGFP в частности, в клетках Пуркинье позволяют изучать морфологию отдельных клеток в течение нескольких дней в культуре. Таким образом, рост и развитие дендритных дерева во время периода культивирования может приятно быть задокументированы. Жизнь определены клеток Пуркинье были сфотографированы каждый ^2-й или ^3-й день в культуре период с 10-кратным цели. Такой низкий цель власти была выбрана, чтобы избежать и минимизировать фототоксических повреждение клеток из-за освещения с лампой дневного света. 3 показаны два примера клеток Пуркинье снято в живых культур. Первая ячейка последовало от 2 дней в пробирке до 7 дней в пробирке (рис. 3, AC). Очевидно, что dendritiС деревом этой ячейки в этот период времени растет несколько новых филиалов и расширяется в размерах. Во втором примере, клетки Пуркинье последовало от 4 до 11 дней в пробирке (рис. 3, DF). Небольшое дерево дендритных присутствовать на DIV4 существенно расширяет течение этого периода времени. Оба примера показывают, что большинство дендритные дерево клеток Пуркинье представят в конце периода культивирования действительно развиваются в культуре.

Развитие Пуркинье дерево дендритных клеток подавляется PKC или mGluR1 стимуляции
Органотипической мозжечка культур срез культивировали в течение 11 дней. Начиная с ^2-й день в пробирке, некоторые из культур обрабатывали либо PMA (50 нМ), форболового эфира стимулирования PKC или ДХПГ (10 мкМ), mGluR1 агонистов, пока культурами были исправлены. Оба соединения были показаны ранее подавлять и ограничивать клеток Пуркинье рост дендритов ^{7, 8, 9, 5.}В необработанного контроля ломтиками клеток Пуркинье разработали типичные большие и сильно разветвленные дендритных дерева, которые были визуализированы либо анти-кальбиндин иммуноокрашивания (рис. 4а) или в культурах с EGFP-экспрессирующих клеток Пуркинье, по иммунным с анти-GFP (рис. 4D). В культурах, обработанных PMA морфологии дендритных деревьев была глубоко изменена. Дендритов появилась утолщена и было только несколько коротких боковых ответвлений. Многие клетки Пуркинье, в отличие от управления культуры, уже не однополярный, с одной первичных дендритов, исходящих из тела клетки, но разработаны два или даже больше первичных дендритов (рис. 4, б, E). Территории, на которую дендритные дерево было заметно снижается (см. ниже). Аналогичная ситуация присутствует в ДХПГ обработанных культур. Дендритные дерево клеток Пуркинье была значительно уменьшена в размерах и ветвление было заметно уменьшается (рис. 4C, F). Однако, были также некоторые QualitatIve различия по сравнению с PMA-обработанных культур. Существовал нет утолщения дендритных ветвей и первичных дендритов проводится много очень коротких вторичных дендритов (рис. 4C, F), что свидетельствует о том, что сигнализация событий, происходящих в PMA и ДХПГ обработанных клеток Пуркинье могут быть похожи, но не идентичны.

Количественная оценка дендритных клеток Пуркинье размера дерева и точек ветвления Для количественной оценке, размер дендритные клетки Пуркинье дерево и число точек ветвления на клетку Пуркинье измеряют, как описано выше. Результаты, по крайней мере в трех независимых экспериментах объединяются вместе, и, как минимум, 20 ячеек должны быть проанализированы. Средняя площадь, покрытая дендритных деревьев для контрольных экспериментах определяется и устанавливается как 100%, а значения для других экспериментов, выраженные в процентах значения соответственно. Статистический анализ данных осуществляется с помощью программного обеспечения Prism GraphPad. Потому что мы неПредположим, что все значения, определенные являются частью распределения Гаусса, мы используем статистические тесты, которые не предполагают такого распределения измеренных значений. Для сравнения нескольких условий и тестирование на статистическую значимость, мы используем Крускала-Уоллиса следуют соответствующие процедуры постфактум тесты для ранга на основе статистики, как, например, реализован в должность тест Данна в GraphPad Prism. Результаты, как правило, представлены в виде гистограмм. Примером такой статистической оценки приведен на рис 5. Оба анализа дендритных размер дерева (рис. 5) и число точек ветвления на клетку Пуркинье (рис. 5B) показывают четкие различия между состоянием управления и ДХПГ или PMA лечения. Оба параметра были разные с статистическую значимость р <0,001 в соответствии с Крускала-Уоллиса.

FIGURe 1. EGFP-меченых клеток Пуркинье. В PCP2-EGFP мышей не все клетки Пуркинье экспресс-EGFP. Таким образом, дендритных деревьев некоторых клеток Пуркинье можно рассматривать индивидуально, когда они выражают EGFP (EGFP канал) и соседние клетки Пуркинье с перекрытием дендритных деревьев нет (отрицательное в канале EGFP показано в, положительные в борьбе с кальбиндин окрашивания показали в красном канале в B). Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 2. Измерение параметров дендритных клеток Пуркинье. (A). Размер дендритных дерева можно легко измерить с помощью трассировки контура клеток Пуркинье с помощью одного щелчка мыши в программное обеспечение Image Pro анализа изображения плюс с помощью волшебной палочкой. Инструмент Magic Wand Tool используется таким образом, что все дерево дендритных в том числе сомы клетки и все дендритных ветвей полностью окруженные линии. (B). Число точек ветвления является кулоновскоеnted вручную в образах клеток Пуркинье. Каждая точка ветвления отмечен желтой точкой. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 3. Мониторинг развития Пуркинье дерево дендритные клетки. Выявленные клетки Пуркинье были сфотографированы несколько раз, чтобы контролировать рост дендритных дерева. (AC): дендритные дерево клеток Пуркинье растет и развивается изо дня в пробирке (DIV) 2 до DIV7. Существует непрерывный рост и ветвление дендритов в течение этого периода культивирования. (DF): дендритные дерево клеток Пуркинье растет и развивается от DIV4 до DIV11. Дендритных дерева существенно расширяется в течение этого периода культивирования. Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 4. Развитие Пуркинье дерево дендритных клеток подавляется PKC или mGluR1 stimulatiна (A), (D):. необработанными контрольными клетками с хорошо развитой дендритной дерева. (B), (E): После 9 дней дендритов PMA лечения появляются утолщенные и дендритные дерево сильно снижается в размер. Клетки часто теряют свою поляризацию и стал биполярным (E). (C), (F): После 9 дней ДХПГ лечении дендритных дерева значительно уменьшается в размерах. В отличие от лечения PMA, многие очень тонкие и короткие боковые ветви присутствуют на первичном и вторичном дендритов. Клетки часто теряют свою поляризацию и стал биполярным (F). Клетки Пуркинье были визуализированы с помощью анти-кальбиндин иммуноокрашивания в (A - C) и EGFP-выражения в культурах, полученных от PCP2-EGFP мышей (D - F). Шкала бар = 50 мкм.

Рисунок 5. Количественная оценка дендритных клеток Пуркинье размера дерева и ветвление. Количественные измерения показывают, что как дендритные размер дерева (верхняя гистограмма) и количесГ точек ветвления (нижняя гистограмма) значительно снижаются после лечения PMA или ДХПГ. Различия между контролем дендритных деревьев и дендритных деревьев клеток Пуркинье из обработанных культур были значительными, р <0,001.

Discussion

Методы, представленные здесь, позволяют изучать Пуркинье дендритных клеток в развитии мозжечка органотипических культур срез и количественно оценить Пуркинье расширения дендритных клеток путем измерения размеров дендритных дерева и количество дендритных точки ветвления. Конечно, более обширный и сложный количественный анализ дендритов клетки Пуркинье можно, например, путем определения общей длины дендритов, выполняя Шолл анализа или определения фрактальной размерности дендритных дерева. Для этого типа анализа обычно требуется вручную проследить весь клеток Пуркинье дендритных дерева в анализе программы как, например, нейро-Lucida. Хотя это более изощренные методы, безусловно, дают высочайший уровень анализа (см., например, ^{1, 6),} они больше времени и требует больше специализированное оборудование и программное обеспечение для анализа по сравнению с методами, представленные здесь. Для большинства приложений, в частности, в ситуациях, когда измененияВ дендритов клетки Пуркинье являются значительными и качественно видно, простые методы, представленные были будет достаточно. Следует отметить, что органотипических мозжечка культур срез, полученных от мышей P8 будет охватывать только поздней стадии развития Пуркинье дендритные клетки характеризуются быстрым расширением дендритных. Для изучения ранних стадиях, метод срез культуры должна быть адаптирована к ломтиками от новорожденных или эмбриональных животных, которые затем будут рассмотрены на предыдущих этапах дендритных развития (например, ^2).

Для визуализации клеток Пуркинье в мозжечке органотипических культур срез, мы сосредоточились только на двух рутинных методов: анти-кальбиндин иммуноокрашивания и использовании мыши с EGFP выражения клеток Пуркинье. Конечно, более доступных методов, в частности баллистической или вирусной трансфекции с флуоресцентными белками, diolistic маркировки с флуоресцентными красителями и внутриклеточных инъекций красителя на отдельные клетки Пуркинье. В зависимости от требований исследований и имеющегося оборудования в лабораториях этих методов может значительно повысить уровень анализа Пуркинье морфологии дендритных клеток, например, путем анализа дендритных шипиков с помощью конфокальной или два фотона микроскопии.