マウス強制水泳試験

Summary

強制水泳試験は、げっ歯類の潜在的な抗うつ効果を評価するための実験的なアプローチとして検証されます。実験動物は、水のタンクに配置され、エスケープ関連のモビリティの挙動が定量化される。この試験のマウスのバージョンに共通の手順が説明されています。

Abstract

強制水泳試験は抗うつ薬、新規化合物の抗うつ効果、および状態のようなうつ病をレンダリングまたは予防を目的としている実験操作の評価に使用されるげっ歯類の行動試験です。マウスは、水で満たされており、彼らの脱出に関連するモビリティの挙動が測定され避けられない透明なタンクに配置されます。強制水泳試験では、確実に実施するのは簡単であり、それは最小限の特殊な装置を必要とします。強制水泳試験の実装を成功させるには、一定の手続きの詳細およびマウスへの不当なストレスの最小化に従う必要があります。プロトコルの説明および添付のビデオでは、我々はどのようにそれらを避けるために、結果の解釈とに有害かもしれない潜在的な落とし穴に重点を置いてこの試験のマウスのバージョンを実施する方法について説明します。さらに、我々はテストで明らかに動作が評価される方法について説明します。

Protocol

1。材料と方法

1.1。水タンク

この材料はガラスよりも優れて戦車や事故の頻繁な動きに耐えることができるようになると我々の研究室でマウスの強制水泳試験（FST）に必要な円筒形のタンクは（30 cm高さ× 20 ​​cmの直径）、透明なプレキシグラスで構成されています。水位は底から15 cmであり、水の量は、マウス全体で整合性を確保するようにタンクにマークする必要があります。戦車の数は、理想的に最初のセットが使用されている間、2番目の水槽セットがいっぱいできるように、一度にテストされているマウスの数の少なくとも2倍多くする必要があります。タンクの大きさはマウスが水泳のテスト中に、自分の足や尻尾のいずれかで、タンクの底に触れることができないだろうというように選択する必要があります。タンクの高さはタンクからの脱出からマウスを防ぐのに十分高いはずです。注意してくださいタンクの直径と水の深さはマウスの行動を（これらの問題の詳細な分析のための^1-3を参照）に変更するように調整することができる重要なパラメータであること。

1.2。温度計

温度の迅速な測定がテストを実施するために必要な時間の量を減少するため、耐水性赤外線温度計は、好適である。しかし、ガラスの水銀温度計は、このタスクのための十分です。

1.3。タイマー

1.4。ビデオ録画デバイス

我々は、三脚でサポートされているビデオカメラを使用。このテストは通常​​、同時に試験される複数の動物を含んでいるので、ライブスコアリングは非常に困難になるとお勧めできませんになります。ビデオカメラは行動スコアリングのために後で使用される高品質の画像をレンダリングするために十分な高解像度で記録する必要があります。常にstartinの前にカメラに十分な記録のメモリがあることを確認してくださいGテスト。我々は、ビデオのデジタル転送を可能にする、機械的なメディアの使用（すなわち、ビデオカセット）なしでデジタル記録するビデオカメラを使用。オーバーヘッド蛍光灯照明と実験室の環境で発生する可能性のあるタンク、上の過度の反射がある場合は、お使いのカメラで偏光レンズのフィルターを使用することをお勧めします。

1.5。仕切り

私たちの研究室では、仕切りの2つのセット（35 cm高さ× 22センチ幅× 22 cmの深さ）を持っている。これらは3つの壁と長方形であり、どちらも背景として、またテスト中にお互いを見て、潜在的に彼らの行動を変えることからマウスを防ぐためにタンクとの間の仕切りとして使用されています。一方のセットはアルビノと明るい色の動物のために黒​​になりますが、他のセットは、高いコントラストをレンダリングするために暗い色の動物のための色の光することができます。実験者は、彼らがカメラの画像を変更、または主要なdをレンダリングするように、仕切りの表面が過度に反映していないことを確認する必要があります照明レベル間のifferences。

1.6。ホワイトノイズ発生器

これは、突然の大きな音が潜在的に動物を驚愕することを聞くことができる実験室環境で必要とされる。ノイズジェネレータは、このような断続的な妨害音をマスクします。ホワイトノイズジェネレータの音量レベルは、他の周囲の、予期せぬ騒音の上になるように選択されるべきである。我々の実験室での周囲雑音レベルは、（アクティブホワイトノイズ発生器なし）60dBです。タンクが配置されている場所でアクティブにホワイトノイズ発生器との合計ノイズレベルは70〜72デシベルです。しかしそれは、これらの数値は例として提供されていることに注意すべきである、と各研究室では独自の環境や状況に応じて右側のノイズレベルを選択する必要があります。

1.7。乾燥紙と熱ランプ

彼らのホームケージに動物を返す前に、乾燥することが重要です。彼らは静かに紙タオルを使用して、それが低体温を防ぐために熱のランプを（暴露温度が32 ° Cを超えることのない確信）を使用すると便利です。

2。行動手順

1. 全体的な実験計画は、実験に特有な変数間の適切な相殺を反映している必要があります。例えば、我々の実験で、我々はすべてのFSTセッション（すなわち、4つの治療グループがある場合、それぞれがそれぞれのセッションで表現されます）に等しく、各グループを代表してみてください。また、マウスが回転して、各治療群のようにマウスが各セッションで異なるタンクに配置されます。
2. カメラとの位置に仕切りを置きます。カメラは、マウスの可能な限り高い解像度を得るためにできるだけ近いはずです。
3. タンクは、タンクの壁にマークされている決定レベル、に室温（23〜25 ° C）で設定された水道水で埋めなくてはなりません。貴事業所には、一定のホット/コールドwaを持っていない場合TERは、あなたはすぐに適切な温度に水をもたらすために温水および/または氷を準備することができます。赤外線温度計で水温を確認してください。正しい最終に近づくこと - お湯のレベル用と冷たい水の添加のための秒のマーク - また、温水と冷水の温度が貴施設で一定の場合には、タンクに2つのマークを描くことができます急激に水温。
4. マウスは、試験室に導入される前に、使用されている場合、ホワイトノイズ発生器を起動します。ホワイトノイズのレベルは、外部ノイズをマスクするために十分なはずです。高音量を回避し、ホワイトノイズと同じレベルのすべての動物に使用されていることを確認してください。
5. 試験室に動物をもたらす。動物が存在するコロニーの部屋と試験室が隣接しているか、お互いに非常に近い場合、周囲の状況は類似しており、ケージの移動中に障害がない順化ペリし、最小限のではないodは必要になります。そうでなければ、順化の期間（一般的には少なくとも1時間）に試験室に動物を置く。順応期間が必要な場合は、馴化動物が同じ部屋で同時にテストされているマウスに影響されないことを確認してください。嗅覚と超音波手がかりが同じ部屋に置く他の動物によって感知することができますのでご注意ください。
6. 水タンクに動物を配置する前にビデオ録画を開始します。
7. その尾で動物を保​​持し、穏やかにゆっくりと水に置きます。マウスが水になると、徐々に尾を離します。通常、このプロシージャを使用すると、水面下に水没しているから、動物の頭を防止します。
8. 録音の閉塞を最小化される順序でタンクにマウスを置きます。この順序は、もちろん、あなたの実験的デザインに特定のグループや他の要件の相殺と組み合わせて決定されるべきである。
9. 一度、すべてのマウスは、ストップウォッチでカウントダウンを開始し、タンクになります。マウスの通常のテストの長さは、FSTで6分です。
10. テスト中に、あなたが動物から妥当な距離にあると動物に気づかれる可能性のある動きや音を確認していない特定のである。マウスが容易に水に浮くことができる、しかし、マウスの新型や行動を泳ぎへの影響の予備知識なしでテストされている新しい化合物のいずれかの場合、実験者がより密接に動物を監視する必要があります。ラットとは対照的に、マウスは通常、しかし、ダイビングのイベントでマウスがタンクから除去されるべきである、FST中に潜っていません。実験者が部屋を離れる場合、マウスは、マウスが水泳と浮動小数点の動作を維持することはできませんし、必要に応じてテストを停止するイベントで、ビデオで監視する必要があります。
11. 6分テスト期間の終了時に録音を停止します。私たちの研究室では、我々は非常に最後に動物を識別するためのカメラの前でメモを表示各記録の。 IDが唯一の録音の一番最後に表示されているので、このアプローチを使用する場合は、その後の記録を得点、個々の動物の身元を知ることができません。これは、後で録音に関連する発生する可能性がある問題を保つ任意の識別と記録を防ぎます。に関係なく使用されている記録保持の戦略の、それは明らかに動物を識別し、また後でグループの割り当ての知識を持っていることから、テストの得点、個々のを防ぐ必要があります。
12. あなたがそれらを入れ、ゆっくりと戻ってそのhomecageに乾燥紙と場所でそれらを乾燥するのと同じ順序で、その尾で水から動物を取り外します。

3。行動分析

1. FSTのマウスバージョンは6分の長さ、開始から終了までの、典型的です。しかし、一般にテストの唯一の最後の4分間が分析されます。これは、ほとんどのマウスはFSTの開始時に非常に活発であるという事実によるものであり、p治療のotential効果は最初の2分間の間に隠されることができる。
2. 私たちのラボでは、カメラから直接PCにビデオファイルをアップロードし、PC上で分析を行います。
3. 行動の分析中に、各マウスがモバイルに費やす時間が測定されます。モビリティの時間の合計は、試験時間の240秒から減算され、その後不動の時間として記載されています。それは直接不動時間を測定することは可能ですが、私たちの研究室で我々はそれが容易ではなく、そのような動きの欠如よりも活発な動きを検出し測定することを発見した。
4. FSTで通常最も重要な行動分析の側面とオブザーバーとの間のばらつきの最大の原因は、 善意のモビリティとしてカウントされる動きの正確な同定です。 FSTのモビリティのための私たちの業務の定義は、 身体のバランスをとり、水 ^4の 上に頭を維持するために必要なもの以外の任意の動きです。。マウスは一般的に容易に水に浮く、しかし彼らはまだ自分の体のバランスをとり、水の上に頭を保つために小さな動きを明らかになります。これらの動作は、脱出しようとしたものではなく、モビリティとして採点されるべきではない。また、モビリティの一つの試合後に、さらに本質的に不動も、マウスはまだ勢いの結果として、水にドリフトすることができる。これらの動きはまた、モビリティとして採点されるべきではない。
5. 当研究室では、我々は時間測定のための画面上のストップウォッチソフト（Xnoteストップウォッチ、dnSoft研究グループ）を使用します。二つの独立したストップウォッチは、画面上で使用されています。ダウンの240秒とアラートからの最初のストップウォッチのカウント行動の分析期間が終了オブザーバー。第二ストップウォッチは、携帯電話にかかる時間を測定します。いくつかのストップウォッチのソフトウェアは、画面上のストップウォッチは、キーボードで制御できるように、機能を起動および停止するキーを割り当てる機能を持っています。私たちの研究室では、代わりに普通のキーボードの、我々​​は一般にとして知られている入力デバイスを使用ストップウォッチを制御するために"ゲームパッド"。
6. テストと画面上に存在する複数のマウスがある場合は、不動を定量化するためにPCを使用する場合、それはように、（別のプログラムウィンドウを使用したり、物理的に紙と画面をカバーすることができます）他の動物をカバーすることをお勧めしますその動きは、オブザーバをそらすことはありません。
7. 画面上のストップウォッチを使用する場合は、すべてがストップウォッチの秒の小数をカバーするようにしてください。この理由は、まだ時計が実行中または実行されていないかどうかを判断する能力を許可しながら、観察者のバイアスを防ぐためです。オブザーバーは、動物のグループの割り当てにブラインドしながら、マウスの移動性のレベルの一般的な考え方を持っているので、彼女はその特定のマウスの経過モビリティの時間の総量を表示するために許可されている場合に発生するいくつかのバイアスがあるかもしれません分析のセッションの前に完了。ストップウォッチをカバーすることによって、彼女は唯一のストップウォッチは、任意の時点でオンまたはオフになっていますが、ウィルかどうかを知ることがlは合計時間が経過し、したがって、どんなバイアスによって行うことができないことを知ってではない。
8. 間のオブザーバーの信頼性試験は、試験動物からデータを収集を開始する前に、すべての新しい観察のために実施されるべきである。当研究室では、各々の新しい観察は、最初に経験豊富な観察者のスコアリングを監視します。不動から可動性を区別するために新しいオブザーバゲイン自信の後、彼らはその後、経験豊かな観測者が視聴して誤りがあれば指摘して得点。このフェーズが正常に完了すると、新たなオブザーバーたちは訓練の目的のために当研究室で保管することをFSTビデオの特定のセットを分析します。間観察者の相関の高いレベルは、経験豊富な観察で得した後でのみ、実際の実験でFSTビデオを分析する研究者のスタートを行います。我々は、アーカイブ、これらのトレーニングの分析からのデータは、将来使用するために実験室の内部標準を構成する。我々は、彼らがmobiはを表現する方法で菌株間の違いを観察しているlity（と不動）行動、そして男女間の不動時間を意味する。新しい系統、性別、または遺伝子改変マウスモデルが実験室で試験されている場合は、再度信頼性のこのタイプの分析を行うことが必要です。

4。代表的な結果

そのベースラインの不動と特定の薬剤^5-11を対応の面で遺伝的に異なる近交系と近交系マウスの系統間の著しい違いがあります。例えば、我々は、マウス系統のパネル（図^1）5のリチウムに差抗うつ薬のような応答を同定した。この実験の実験の詳細はCANら、2011年⁵公開されています。

図1。強制水泳試験における不動時間（秒単位）、5時間、様々な近交系とOU内の生理食塩水、200、300、または400 mg / kgの単ip注射後tbredマウス系統。 *：P <0.05、**：P <0.01、***：P <0.001は生理食塩水群、Dunnettの事後検定と比較して有意差を表す。データは平均± SEMとして表される。各菌株のグループあたりの動物数は^6-8（5から再現図）です。

すべてのマウス系統は、FSTには適しているわけではありません。そのようなブラックスイス、NIHスイス、およびFVB / NJなどの一部の株は、従って床効果（図^1）5を表す、制御条件の下でほとんど、あるいはほとんどない不動を示す。ベースラインの不動の欠如は、効果的に実験操作の抗うつ効果を検出することを防ぎます。それは彼らが浮くことができるにもかかわらず、いくつかのマウス系統が異常に動作すると、テスト中にタンクに飛び込む可能性があることを、非常にまれですが、も可能です。そのような株は、（我々の研究室では未発表の観察）DBA/1OlaHsdです。このような株は、FSTには適していません。このためダイビングリスクの、しかし、Smalのlは、以前にFSTまたは新規の遺伝子操作を抱いてマウスでテストされていない新しい菌株をテストするとき、それは慎重に、彼らが潜在的に有害な行動に従事する場合、マウスを救出するための初期臨床試験を観察することが不可欠です。

ここで説明する実験的なデザイン、複数の動物（最大5つ）で同時にテストされています。我々が使用する分周器は、テスト中にお互いを見てからマウスを防止し、ホワイトノイズ発生器は音発声を抑制しながら、私たちのセットアップは、送信されているから、すべての超音波や嗅覚手掛かりを防ぐことはできません。まずテストの性質を与えられたものの、これらはマウスの行動に影響を与える可能性があります。この問題に対する一つの解決策は、個々の動物をテストすることです。しかし、このアプローチは、独自の問題を抱えている。例えば、一般的に、各セッションで試験動物は同じhomecageから来る。これは、実験変数のランダム化と相殺することができます。個々のマウスをテストするLYはhomecageから一度に1つのマウスを除去することを意味する。これは、残された他の中のケージでの社会階層の繰り返し応力と乱れの原因となります。テストのもう一つの問題は単独で時間の制約があります。一度に一つのマウスをテストすると、マウスが概日周期の異なる時期にテストされている状況で、その結果多くの時間に実験を拡張します。これにより、曜日効果の交絡時間を作成することができます。彼らの実験を設計しながら研究者は念頭に置いて、これらの問題を維持する必要があります。

Discussion

FST（と呼ばれることもありますPorsoltの水泳試験）は、ラットで最初に開発し、Porsoltと同僚^12,13によってマウスのために変更されました。我々の研究室で成功し、上記のプロトコルに加えて、主に微妙なテストの修正の数は、（完全な見直し¹ HascoëtとBourinを参照してください）発表されています。それは抗うつ薬と基礎および臨床研究^3,14-16で様々な行動と神経生物学的操作の効果の有効性の評価に使用される一般的なテストです。それは"行動絶望"が誘導されている状況をレンダリングするように記載されている、つまり、動物はストレスの多い環境^13を逃れるために希望を失う。強制水泳試験のマウスのバージョンでは、マウスのないトレーニングを必要とせず、最小限の機器で行う​​ことができる比較的短く、低コストの行動試験です。これは一般的に伴うテスト、のラットのバージョンとは対照的である水タンクへの曝露試験の¹⁷日目前日。

ため、その人気のFSTの様々な抗うつ薬の影響に関するデータが豊富にあります。これは（2009年レビュー¹ HascoëtとBourinを参照）の研究者は、他人と自分の結果を比較対照することができます。 FSTのこれらの特性は、その信頼性と新規化合物のハイスループットスクリーニングが不可欠である産業現場における学術研究と創薬における重要なツールとなっています。 FSTの追加機能は、データ収集プロセス^18-20加速することができます商用自動化された行動分析システムの可用性です。しかし、我々の経験では、これらの自動化システムは、人間の得点で大規模な検証が必要です。さらに、自動化されたパラメータは、異なる菌株を使用する際に再調整する必要があります場合は特に、バックグラウンドのコントラストの変化のレベル、または別のsのマウスとizesや行動反応。

FSTが使用されている別のエリアには、うつ病に関連する行動の遺伝的基礎が調査されているneurogenetic研究です。研究のこれらのタイプは、遺伝子組み換えまたは選択的に交配マウスとその野生型対応^6,21-23の抗うつ薬と比較の使用の有無にかかわらず様々なマウス系統の比較を含む。この点では、FSTは気分障害の神経生物学と遺伝学に関連した基礎研究に有用であることが証明されている。しかし、FSTは、人間のうつ病の完全なスペクトルのアナログではありません。それが^24,25効果的でないものへの抗うつ剤とを区別しないように、ヒトにおける有効な化合物に合理的に敏感であるため、例外があるにもかかわらず、FSTは、予測的妥当性のかなりのレベルを持っています。 FSTの行動の結果が一次元であるため、それが唯一の化合物またはexの抗うつ効果を示すことができますperimental操作は、それはそれらの間の機構的な違いを区別することはできません。これは、ラットは、化合物²⁶作用するセロトニンやノルエピネフリンを区別できる、水泳、登山行動の両方を明示するFSTのラットのバージョンとは対照的です。また、全体の活動レベルに影響を及ぼす可能性のある操作は、潜在的に誤った結論を導くFSTの不動を変更することがあります。したがって、このようなオープンフィールドテスト^1,27全体としての活性を測定する別の行動テストでFSTの結果を確認することが重要です。それは、FSTは、人間の状態を表していないことを覚えておくことが有益であり、そしてある程度までFSTのモデル動物と人間のうつ病の重複によって明らかに行動の基盤となる神経生物学的メカニズムは²⁸完全には明らかにされていない。しかし、制限のこれらのタイプは、創薬及び検証ツールとしてFSTの有用性を切り下げるてはいけません。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Water tanks
Thermometer
Timer
Video Camera
White Noise Generator (optional)
Drying Paper