הכנת 3D הפיברין פיגומים יישומים סלולריים גזע תרבות

Summary

זה מפרט עבודה והכנת 3D הפיברין פיגומים culturing ומבדל בתאי גזע plutipotent. פיגומים אלה ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של חומרים ביולוגיים שונים על התנהגות בתאי גזע גם שונה כדי לכלול מערכות אספקת סמים.

Abstract

בתאי גזע נמצאים באופן טבעי microenvironments 3D in vivo, אשר המכונה לעתים קרובות נישה תא גזע ^1. גזע culturing בתוך תאים של 3D ביולוגי פיגומים מספק דרך לחקות במדויק את microenvironments, מתן יתרון על פני שיטות מסורתיות תרבות 2 ד באמצעות קלקר, כמו גם שיטה להחלפת רקמות הנדסה ^2. בעוד polystrene 2 ד תרביות רקמה שימש במשך רוב הניסויים תרבית תאים, 3D פיגומים ביולוגי יכול הדוק יותר לשכפל את microenvironments נמצאו in vivo, בכך שהיא מאפשרת הקמת מדויק יותר של הקוטביות בתא בסביבה ובעל תכונות ביוכימיות ומכניות הדומות רקמות רכות. ³ מגוון של נגזרים באופן טבעי סינתטי פיגומים ביולוגי נחקרו כמו 3D סביבות לתמיכה תא גידול גזע. בעוד פיגומים סינתטי יכול להיות מסונתז יש R יותרange של תכונות מכניות וכימיות, ולעתים קרובות יש שחזור גדול, biomaterials טבעיים מורכבים לרוב חלבונים ופוליסכרידים שנמצאו מטריקס extracelluar וכתוצאה מכך מכילים אתרי קישור הידבקות התא בקלות לתמוך תרבית תאים. הפיברין פיגומים, המיוצר על ידי polymerizing פיברינוגן חלבון המתקבל פלזמה, נחקרו נרחב עבור מגוון רחב של יישומים הנדסיים רקמות הן במבחנה in vivo ^4. פיגומים אלו ניתן לשנות באמצעות מגוון של שיטות לשלב מערכות שחרור מבוקר עבור אספקת גורמים טיפוליים ^5. מחקרים קודמים הראו כי פיגומים כאלה יכולים לשמש בהצלחה בתאי גזע עובריים תרבות וזה פיגום מערכת מבוססת התרבות ניתן להשתמש כדי לסנן את ההשפעות של גורמי גדילה שונים על התמיינות של תאים שנזרעו בתוך גזע ^6,7.

פרוטוקול זה מפרט את תהליך polymerizinגרם הפיברין ויוצר תשתית מפתרונות פיברינוגן באמצעות הפעילות האנזימטית של תרומבין. התהליך לוקח 2 ימים לסיים, כולל צעד דיאליזה לילה לפתרון פיברינוגן להסיר citrates המעכבות פילמור. שיטות אלו מפורטות להסתמך על ריכוזי פיברינוגן נחוש בדעתו להיות אופטימלי עבור העובר המושרה תרבות גזע pluripotent התא. קבוצות אחרות חקרו יותר פיגומים הפיברין למגוון רחב של סוגי תאים ויישומים - הוכחת צדדיות של גישה זו ^8-12.

Protocol

הערות לפני תחילת פרוטוקול: פיברינוגן הוא חלבון בדם נגזר והכשרה בטיחות המתאים ולכן יש להשלים לפני הטיפול. פרוטוקול זה דורש 2 ימים כדי להשלים את כל הזמן התרבויות גזע הרצויות כראוי, כדי להבטיח שהם מוכנים זריעה. מבחינת חישוב כמה פיברינוגן לשקול את שלוש 35 צלחות פטרי מ"מ של טריס בופר סליין (TBS, pH 7.4) המכיל 110-130 מ"ג של פיברינוגן מומס מ"ל של 3 כפות יספיקו כדי לייצר 1 24 צלחת היטב המכיל 400 הפיברין פיגומים μl ב היטב כל אחד.

1. יום ראשון: ביצוע פתרונות פיברינוגן ו דיאליזה בן לילה

1. קח פיברינוגן lyophilized מהמקרר ולתת לו לשבת במשך 20 דקות כדי לאפשר לו להגיע לטמפרטורת החדר.
2. הוסף 3 מ"ל של טריס בופר סליין (כפות) על צלחת פטרי 35 מ"מ כל אחד. כל צלחת התשואות פיברינוגן 2-3 מ"ל של תמיסת פיברינוגן החל בריכוז 12-20מ"ג / מ"ל ​​ו - הכמות הכוללת של פיברינוגן הצורך ניתן לחשב בהתבסס על הערכות אלה.
3. לשקול את כ 100-130 מ"ג פיברינוגן (FG) ומפזרים על פני השטח של ימינו כפות בכל צלחת. חכו 5 דקות פיברינוגן להתחיל להיכנס פתרון. מכסים בצלחת פטרי עם מכסה.
4. דגירה בצלחות פטרי ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות, כדי לאפשר פיברינוגן באופן מלא להיכנס פתרון TBS.
5. דיאליזה צינורות רטוב (7000 MW לחתוך) עם כפות. הקצה התחתון של פולד סוף צינורות מהדק לסגור עם מהדק דיאליזה.
6. פיפטה פתרונות פיברינוגן מן הכלים לתוך צינורות דיאליזה. מקפלים מעל הקצה העליון לצבוט לסגור עם מהדק דיאליזה.
7. דיאליזה צינורות המקום המכיל פתרון פיברינוגן לתוך מיכל 4 ליטר של TBS. מערבבים פתרון באמצעות צלחת ומערבבים מוגדר במהירות נמוכה (100 סל"ד).
8. Dialyze פתרון בן לילה על הצלחת לעורר לפחות 12 שעות. פתרון TBS לא צריך להיות שונה על פני פרק זמן זה.
2. יום 2: פילמור של פיגומים הפיברין וזריעה בתאי גזע לתוך פיגומים

כל השלבים המתוארים בתהליך זה יש לבצע מכסה המנוע רקמות סטרילית התרבות האלה פיגומים יהיה זרע עם תרביות תאים גזע.

1. הסר את הפתרון של פיברינוגן צינורות דיאליזה ומקום לתוך הצינור המתאים חרוט בגודל (או 15 מ"ל או 50 מ"ל).
2. פיברינוגן פתרון סינון עם מסנן 5.0 מיקרומטר מזרק כדי להסיר זיהומים גדולים בתמיסה. בהתאם לכמות של פתרון, השימוש מסננים מרובים ייתכן שיהיה צורך לעבד את הפתרון כולו.
3. מסנן סטריליים פתרון פיברינוגן עם 0.22 מיקרון המסנן לתוך שפופרת 50 מ"ל חרוטית. בעזרת פיפטה בגודל המתאים, לקבוע את עוצמת הקול של פתרון פיברינוגן מסוננים להשתמש מאוחר יותר כאשר עושים חישובים. בהתאם לכמות של פתרון, השימוש מסננים מרובים ייתכן שיהיה צורך לעבד אף אוזן גרוןזעמם פתרון.
4. למדוד את ספיגת הפתרון פיברינוגן ב 280 ננומטר באמצעות ספקטרופוטומטר. גורם דילול של 50 לעתים קרובות יש צורך לקבל את ספיגת תחת 1.
5. חשב את הריכוז של חלבון הנוכחי בפתרון פיברינוגן באמצעות המשוואה הבאה: [פיברינוגן ב מ"ג / מ"ל] = ₍₂₈₀ × פקטור דילול) ÷ 1.55 1.55 שם הוא מקדם הכחדה על ₂₈₀ על ¹³ פיברינוגן האנושי. לאחר מכן לחשב את כמות כפות צורך לדלל את ריכוז הפתרון 11.1 מ"ג / מ"ל ​​של פיברינוגן מבוסס על נפח ראשוני. הריכוז הסופי של החלבון פיגומים הפיברין יהיה 10 מ"ג / מ"ל ​​לאחר פילמור.
6. להשיג thrombin סטרילית פתרונות כלוריד הסידן. ראשית, להוסיף 15 הפתרון thrombin μL (ריכוז: 40 יח' / מ"ל ​​- הריכוז הסופי פיגום יהיו 2 יח' / מ"ל) בצד ימין של כל טוב בשורה הראשונה של צלחת 24 גם כן. לאחר מכן, הוסף 15 μL של CHL 50 סידן mMoride פתרון הצד השמאלי של כל טוב. לבסוף, מוסיפים 270 μL של פתרון פיברינוגן לצלחת. ללחוץ את הצלחת מצד לצד ואחריו רועד בחזרה לחזית כדי להבטיח ערבוב של פתרונות.
7. תן את השורה המכילה את תערובות לפלמר במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. פיגומים הופכים אטום יותר ככל שהם לפלמר.
8. חזור על שלבים 2.6 ו 2.7 עד המספר הרצוי של פיגומים הפיברין כבר מפולמר.
9. לאחר דגירה 5 דקות האחרונה, להציב את הצלחות בתוך 37 ° C בחממה כדי לאפשר פילמור שלמה של פיגומים.
10. לאחר דגירה של שעה אחת הסתיימה, השלב הבא הוא זרע הפיגום עם גופים embryoid. באמצעות מספר 20 pipettemen μL, בחר הגוף embryoid המקום היחיד במרכז הפיגום הפיברין. בדוק עם מיקרוסקופ כי גם מכיל גוף embryoid אחת.
11. הוסף 5 μL של פתרון תרומבין (ריכוז: 40 U / ml) ו 5 μL של סידן כלוריד 50 mMהפתרון על גבי כל הגוף embryoid ואחריו μL 90 של פתרון פיברינוגן היטב כל אחד מהם. הפתרון צריך ליצור בועה בבועה הגופים embryoid.
12. במקום צלחת בחזרה 37 ° C בחממה במשך שעה נוספת, כדי להבטיח פילמור.
13. לאחר הדגירה, הוסף 1 מ"ל של התקשורת והתרבות המתאימים התא לצלחת כל טוב ומקום בחזרה 37 ° C חממה.

3. נציג תוצאות

איור 1 מציג סכמה של התצוגה בצד של היחיד המכיל גם הפיברין 3D מערכת הפיגום תרבות זרע עם הגוף embryoid. איור 2 א מציגה תמונות מייצגות של גזע pluripotent המושרה עכבר לתאי גזע בתרבית להיות על העכבר שכבות מזין עובריים פיברובלסטים. תאים אלה הם מכן גרמו ליצירת גופים embryoid, אגרגטים של תאים המכילים אבות עצביים, באמצעות 8 יום retinoic הטיפול בחומצה Protocol (איור 2 ב) כמו previously תיאר תוך ¹⁴ איור 3 מציג את מראה הגוף-IPS נגזר embryoid לאחר 3 ימים של תרבות בתוך 3D של פיגומים פיברין. תוצאות דומות התקבלו בעבר באמצעות עכבר לתאי גזע עובריים ^7. בנוסף, בשיטה זו נעשה שימוש לתרבות שב"ס הנגזרות גופים embryoid הופק באמצעות פרוטוקול שונה מעורבים החומצה הרטינואית ו purmorphamine ¹⁵ בתוך פיגומים 3D הפיברין, הוכחת את הרבגוניות של מערכת זו תרבות.


באיור 1. סכמטי המציג את התצוגה בצד של אדם טוב המכיל הפיברין 3D הפיגום seeded עם הגוף embryoid.


איור 2. עכבר המושרה pluripotent גזע (IPS) תא התרבות והתמיינות. כדי לבדל את התאים האלה לתוך neurפנוטיפים al, תאים שב"ס מתורבתים ההשעיה לייצור אגרגטים של תאים הנקראים גופים embryoid (EBS). EBS אלה מטופלים מכן עם חומצה רטינואית לגרום בידול עצבית ופרוטוקול זה נעשה שימוש בעבר כדי לגרום בידול העצבית של תאים עובריים. א) העכבר iPS מובחן מושבת תאים בתרבית על שכבת פיברובלסטים עובריים של עכברים מזין. ב) גופים Embryoid שמקורם בתאי עכבר שב"ס בתרבות ההשעיה נלקח ביום 8 לאחר הטיפול בחומצה רטינואית לגרום בידול עצבית. סרגל קנה מידה היא 100 מיקרומטר.


באיור 3. תוצאות דוגמה iPS עכבר embryoid הגוף לאחר 3 ימים של תרבות בתוך של הפיברין 3D הפיגום. התאים החלו להגר ולהבחין בתוך הפיגום הפיברין. סרגל קנה מידה היא 500 מיקרומטר.

Discussion

זה פרוטוקול כמפורט לעיל מספק שיטה להפקת 3D פיגומים הפיברין לתרבות גזע pluripotent התא, במיוחד עבור עכבר עובריים המושרה בתאי גזע pluripotent. זו מערכת ביולוגי מבוסס 3D התרבות באופן מדויק יותר מחקה את תא גזע נישה למצוא vivo וכתוצאה מכך, הוא יכול לשמש מסך אותות ביולוגיים כדי לקבוע את השפעתם על בידול גזע תא ^6. התצפיות שלנו הראו כי אלה פיגומים כאשר זרע עם תא גזע שמקורם גופים embryoid נותרו 2 שבועות במבחנה לפני שהפך מושפל לחלוטין. כדי להגביר עוד יותר את יציבות הפיגומים האלה, aprotinin (מעכבי פרוטאז) ניתן להשתמש כדי להאט את הידרדרות באמצעות תוספת לתקשורת תרבית תאים. ^7,16 פיגומים אלה יש גם שימש בהצלחה עצביים הנדסת רקמות יישומים, במיוחד הדור של רקמה דומה לזה שנמצא ב ¹⁷ מערכת העצבים המרכזית. בעוד גר אחרoups שילבו שב"ס תאים עם דבק הפיברין לטיפול בשבץ איסכמי ^18, עבודה זו מייצגת את הדו"ח הראשון הידוע של שילוב תאים iPS עם פיגומים הפיברין עבור יישומי הנדסה עצביים רקמות. עבודה זו שימשה גם נקודת מוצא שילוב מגוון של סוגי תאים גזע עם פיגומים הפיברין עבור יישומים הנדסיים אחרים רקמות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment needed:
Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates
Fibrinogen (human)	Calbiochem	341578
Thrombin (human)	Sigma-Aldrich	T7009