Summary
Bu çalışma detayları 3D fibrin hazırlanması kültür ve plutipotent kök hücrelerin ayrıştırılması için iskeleleri. Bu tür iskelesi sıra ilaç verme sistemleri içeren değiştirilmiş olarak kök hücre davranışı üzerindeki çeşitli biyolojik etkiler bileşiklerin taranması için kullanılabilir.
Abstract
Kök hücreler doğal genellikle kök hücre hücresi 1 olarak adlandırılan in vivo, in 3D mikro meydana bulunur. 3D biyomalzeme iskelelerinin içinde Kültürleme kök hücreler polistiren yanı sıra, mühendislik yedek dokular 2 için bir yöntem kullanılarak geleneksel 2B kültür yöntemleri üzerinde bir avantaj sağlayarak, doğru bir şekilde bu mikro taklit etmek için bir yol sağlar. 2B doku kültürü polistren hücre kültür deneylerinde çoğunluğu için kullanılmış olsa da, 3D biyomalzeme iskelelerinin daha yakından ortamında hücre polarite daha doğru kurulmasını sağlayan ve yumuşak doku benzer biyokimyasal ve mekanik özelliklere sahip olan in vivo olarak bulundu mikroçevrelerde çoğaltabilirsiniz. 3 çeşitli doğal kaynaklı ve sentetik biyomalzeme iskelelerde kök hücre büyümesini desteklemek için 3D ortamlar olarak incelenmiştir. Sentetik iskelesi daha büyük bir r sahip sentezlenebilir ikenmekanik ve kimyasal özellikleri ange ve genellikle daha büyük bir tekrarlanabilirlik sahip, doğal biyomalzemeler genellikle extracelluar matris içinde ve hücre yapışması için bağlama bölgeleri içermesi ve kolaylıkla hücre kültürü destekleyen bir sonucu olarak bulundu proteinleri ve polisakkaritleri oluşmaktadır. Plazma elde edilen protein fibrinojen polimerize tarafından üretilen fibrin iskelesi, yaygın olarak in vitro ve in vivo hem de in 4 doku mühendisliği çeşitli uygulamalar için incelenmiştir. Böyle iskeleleri iyileştirici faktörler, 5 sunmak için kontrollü salım sistemlerini birleştirmek için çeşitli yöntemler kullanılarak değiştirilebilir. Önceki İş bu iskeleleri başarıyla kültür embriyonik kök hücreler için kullanılabilir ve bu iskele tabanlı kültür sistemi 6,7 içindeki ekilmiş kök hücrelerin farklılaşması üzerine çeşitli büyüme faktörlerinin etkilerini taramak için kullanılabilir göstermiştir.
Bu protokol, ayrıntıları polymerizin işlemig fibrin trombinin enzim etkinliği kullanarak fibrine çözeltilerinden iskeleleri. Polimerizasyon süreci inhibe sitratlar kaldırmak için fibrinojen çözümü için bir gece diyaliz adım da dahil olmak üzere, tamamlamak için 2 gün sürer. Bu detaylı yöntemleri embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre kültürleri için optimal olarak belirlenmiştir fibrinojen güveniyor. Diğer gruplar daha fazla hücre tipleri ve geniş bir uygulama yelpazesi için fibrin iskeleleri araştırdık - Bu yaklaşımın 8-12 çok yönlülüğünü gösteren.
Protocol
Protokolü başlamadan önce Notlar: Fibrinojen bir kan proteini elde edilen ve bu nedenle uygun güvenlik eğitimi dokunmadan önce tamamlanması gerekir. Bu protokol, istenilen kök kültürlerin uygun onlar ekimi için hazır olduğundan emin olmak için zaman çok 2 gün tamamlamak için gerektirir. Ne kadar fibrinojen, tris üç 35 mm petri dışarı ağırlığında hesaplanması bakımından 400 ihtiva eden 1 24 kuyulu plakanın üretmek için yeterli olacak TBS 3 mL içinde çözülmüş fibrinojen 110-130 mg (TBS, pH 7.4) tamponlu salin Her iyi ul fibrin iskeleleri.
1. Gün: fibrinojen çözümleri ve geceleme diyaliz yapma
- Buzdolabının liyofilize fibrinojen çıkartın ve oda sıcaklığına gelmesini sağlamak için 20 dakika bekletin.
- Tris ile ekle 3 mL her 35 mm petri için tuz (TBS) tamponlu. 12 ila 20 arasında değişen konsantrasyonlarda fibrinojenin fibrine çözeltisi verimleri her plakası 2-3 mLmg / mL ve fibrinojen gerekli toplam miktarının bu yaklaştırmalar göre hesaplanabilir.
- Yaklaşık 100-130 mg fibrinojen (FG) dışarı tartılır ve her yemekte TBS mevcut yüzeyine serpin. Çözüm girmeye başlamak için fibrinojen için 5 dakika bekleyin. Kapağı ile petri örtün.
- 37 inkübe petri ° C'de 2 saat fibrinojen tam TBS çözümü gitmek için izin vermek.
- TBS ile Islak diyaliz tüp (7000 MW kesilmiş). Hortum ve kelepçe sonu Fold Alt uç bir diyaliz kelepçe ile kapattı.
- Diyaliz boru içine yemeklerinden fibrinojen çözümleri Pipeti. Üst ucuna katlayın ve bir diyaliz kelepçe ile kapattı kelepçe.
- Yer diyaliz tüp TBS'nin 4 litrelik kaba fibrinojen solüsyon içeren. Düşük hızda (100 rpm) ayarlanır heyecan plaka kullanarak Mix çözüm.
- En az 12 saat için tabak karıştırın üzerine gecede çözüm Dialyze. TBS Çözüm bu dönem boyunca değiştirilmesine gerek yoktur. 2. 2. Gün: iskelelerinin içine fibrin iskeleleri ve kök hücre ekim Polimerizasyonu
- Uygun büyüklükte konik tüp (15 ml veya 50 ml ya) içine diyaliz boruları ve yerden fibrinojen solüsyonu çıkarın.
- Çözümü büyük kirleri ortadan kaldırmak için bir 5.0 mikron şırınga filtresi Filtre fibrinojen çözüm. Çözeltisinin hacmine bağlı olarak, çoklu filtrelerin kullanımının tüm çözüm işlemek için gerekli olabilir.
- Bir 50mL konik tüp içine filtre 0.22 mikron ile Steril filtre fibrinojen çözüm. Uygun boyutta bir pipet kullanarak, hesaplamalar yaparken daha sonra kullanmak üzere filtre fibrinojen solüsyonun hacmi belirler. Çözeltisinin hacmine bağlı olarak, çoklu filtrelerin kullanımının ent işlemek için gerekli olabilirire çözüm.
- Spektrofotometre ile 280 nm fibrinojen çözüm absorbansı ölçülür. 50 arasında bir seyreltme faktörü 1 uyarınca bir absorbans elde etmek için genellikle gerekir.
- Aşağıdaki eşitliği kullanarak fibrine çözelti içinde mevcut proteini konsantrasyonu hesaplanır: [mg / mL 'de fibrinojen] = (A 280 x seyreltme faktörü) 1.55 insan fibrinojen 13 için bir 280 azından bir sönüm katsayısı ÷ 1.55. Sonraki 11.1 mg / başlangıçtaki hacminin dayalı fibrinojen mL çözelti konsantrasyonu sulandırmak için gerekli TBS miktarını hesaplar. Fibrin iskelesi protein son konsantrasyon polimerizasyon sonra 10 mg / ml olacak.
- Steril trombin ve kalsiyum klorür çözümleri edinin. Birincisi, 15 uL trombin solüsyonu (konsantrasyon: 40 U / mL - iskele nihai konsantrasyonu 2 U / ml olacak) 24 sıra plaka ilk satırdaki her iyi sağ tarafına. Daha sonra, 50 mM kalsiyum Chl 15 uL eklemeHer iyi sol tarafına oride çözüm. Son olarak, plaka fibrinojen çözeltinin 270 uL ekleyebilir. Taraftan çözeltilerinin karışmasını sağlamak için ön geri çalkalama takiben yan plakası çalkalanır.
- Karışımları, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca polimerize içeren satır edelim. Onlar polimerize olarak iskeleleri daha opak hale gelir.
- Fibrin iskelelerinin istenilen sayıda polimerize edilmiş kadar adımları 2.6 ve 2.7 tekrarlayın.
- Son 5 dakikalık inkübasyondan sonra, iskelelerinin tam polimerizasyonu için izin vermek için bir 37 ° C inkübatör içindeki plakaları yerleştirin.
- Bir saat inkübe tamamlandıktan sonra, bir sonraki adım embriyoid organlarıyla tohumu iskelesi etmektir. Bir 20 uL pipettemen kullanılarak, fibrin iskele merkezinde bir birey embriyoid gövde ve bir yer seçmek. Her iyi tek bir embriyoid vücut içerdiğini mikroskop ile kontrol edin.
- Ve 50 mM kalsiyum klorid ve 5 uL: trombin solüsyonu 5 uL (40 U / ml konsantrasyonda) ekleyinHer bir kuyuya fibrinojen solüsyonu 90 uL ardından her embriyoid vücut üstüne çözüm. Çözüm embriyoid organları özetleyen bir kabarcık oluşturmalıdır.
- Polimerizasyon sağlamak için ek bir saat için geri 37 ° C inkübatöründe yer plaka.
- Inkübasyondan sonra, 37 ° C inkübatör geri her iyi ve yerinde plakasına uygun Hücre kültür ortamına 1 ml.
Bu iskelesi kök hücre kültürleri ile ekildi edileceği gibi, bu işlem için açıklanan tüm adımları steril bir doku kültürü davlumbaz yapılmalıdır.
3. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1 de bir embriyoid vücut. Şekil 2A ile tohumlanan 3D fibrin iskele kültür sistemi içeren bir bireyin yan görünümü şematik bir fare embriyonik fibroblast besleyici katmanlar kültüre olan fare indüklenen pluripotent kök hücrelerin temsilcisi görüntüleri gösterir gösterir. Bu hücreler daha sonra bir 8 gün retinoik asit tedavi protokolü (Şekil 2B) previousl olarak kullanarak embriyoid organları, sinir progenitörlerin içeren hücrelerin agrega oluşturmak için indüklenirŞekil 3, 3B fibrin iskelelerinin içinde kültür 3 gün sonra, bir iPS-türetilmiş embriyoid gövdesinin görünüşünü gösterir iken Y 14 tarif. Benzer sonuçlar fare embriyonik kök hücreleri 7 kullanarak daha önce elde edilmiştir. Ayrıca, bu yöntem, bu kültüre sisteminin yönlülüğü gösteren, retinoik asit ve purmorphamine 3D fibrin iskelelerinin 15 içinde yer aldığı, farklı bir protokol kullanılarak kültürü iPS-türetilmiş embriyoid gövdeleri için üretilen kullanılmıştır.
Şekil 1. Iyi bir embriyoid gövdeli bir 3D fibrin iskele numaralı seribaşı içeren bir bireyin yan görünümü gösteren şematik.
Şekil 2. Fare uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücre kültürü ve farklılaşma. Neur içine bu hücrelerin ayırt etmek içinal fenotipleri, iPS hücreleri embriyoid organları (EBS) denilen hücrelerin agrega üretmek için süspansiyon kültürlenmiştir. Bu EBS sonra nöral farklılaşma teşvik için retinoik asit ile tedavi edilir ve bu protokol daha önce embriyonik kök hücrelerinin sinir farklılaşma ikna etmek için kullanıldı. A) Farklılaşmamış fare iPS hücre kolonisi bir fare embriyonik fibroblast besleyici tabaka kültüre. B) süspansiyon kültüründe fare iPS hücreleri elde Embriyoid organları nöral farklılaşma teşvik için retinoik asit ile tedavi sonrasında 8. günde alınır. Ölçek çubuğu 100 mikron olduğunu.
Bir fare iPS Şekil 3. Örnek sonuçlar 3D fibrin iskele içinde kültür 3 gün sonra vücut embriyoid. Hücreler fibrin iskele iç göç ve ayırt etmeye başlamışlardır. Ölçek bar 500 mikron olduğunu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıda detaylı Bu protokol, fare embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücreleri için özel olarak, pluripotent kök hücre kültürü için 3D fibrin iskelesi üretmek için bir yöntem sağlar. Bu 3D biyomalzemenin bazlı kültürü sistemi daha doğru bir in vivo olarak bulundu kök hücre hücresi taklit eder ve bunun sonucu olarak, bu kök hücre farklılaşması 6 üzerindeki etkilerinin belirlenmesi için biyolojik kuyrukları taranması için kullanılabilir. Gözlemlerimiz bu iskeleleri embriyoid organları tamamen bozulmuş olmadan önce, in vitro 2 hafta süreyle devam edilen kök hücre ile tohumlanan zaman göstermiştir. Daha sonra bu iskelelerinin kararlılığını arttırmak için, aprotinin (bir proteaz inhibitörü) hücre kültür ortamına ilave edilmesi suretiyle degradasyon yavaşlatmak için kullanılabilir. 7,16 Bunlar, aynı zamanda spesifik olarak iskelesi sinir doku mühendisliği uygulamaları, doku üretimi için başarılı bir şekilde kullanılmıştır Merkezi sinir sistemi 17 içinde bulunan benzer. Diğer gr ikenoups İskemik inme 18 tedavisi için fibrin yapıştırıcı ile iPS hücreleri kombine edip, bu işi sinir doku mühendisliği uygulamaları için fibrin iskeleleri ile iPS hücreleri birleştiren bilinen ilk raporu temsil eder. Bu çalışma aynı zamanda diğer doku mühendisliği uygulamaları için fibrin iskeleleri ile kök hücre türleri bir dizi birleştirmek için bir başlangıç noktası olarak görev yaptı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar, "uyarılmış pluripotent kök hücre davranışlarını kontrol için doku mühendisliği iskeleleri" NSERC Discovery Hibe 402.462 tanımak istiyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
