Bioengineering

幹細胞培養アプリケーションのための3Dフィブリン足場の調製

Published: March 2, 2012 doi: 10.3791/3641

Kathleen Kolehmainen¹, Stephanie M. Willerth²

¹Department of Biology, University of Victoria, ²Department of Mechanical Engineering, Division of Medical Sciences, University of Victoria

Summary

この作品の詳細3Dフィブリンの調製は、培養およびplutipotent幹細胞を区別するための足場。このような足場は、同様の薬物送達システムを含むように修正された幹細胞の挙動に及ぼす種々の生物学的化合物の作用をスクリーニングするために使用することができます。

Abstract

幹細胞は自然に多くの場合、幹細胞のニッチ¹と呼ばれる生体内 3次元微小に発生するに記載されています。 3D生体材料足場の内側に培養幹細胞はポリスチレンなどのエンジニアリング交換組織²の方法を使用して、従来の2D培養法上の利点を提供し、正確にこれらの微小環境を模倣する方法を提供します。 2Dの組織培養polystreneは、細胞培養実験の大半に使用されている一方で、3D生体の足場は、より密接な環境で細胞極性のより正確な設置を可能にし、軟組織に似て生化学的および機械的性質を有することにより、生体内で見つかった微小環境を複製することができます。 ³の様々な天然由来の合成生体材料足場が幹細胞の成長をサポートするための3D環境として検討されている。合成足場は大きなrを持つように合成することができる一方機械的および化学的性質のアンジュ、しばしば大きく再現性を持っているが、天然の生体材料は、多くの場合、細胞外マトリックスや細胞接着の結合部位が含まれており、容易に細胞培養をサポートして結果として検出されたタンパク質や多糖類で構成されています。血漿から得られた蛋白質フィブリノゲンを重合することによって生成されたフィブリンの足場は、広く、in vitroおよび in vivo ⁴ の両方の組織工学の様々なアプリケーションのために検討されている。このような足場は、治療因子^5を提供するための制御放出システムを組み込むための様々な方法を使用して変更できます。前の仕事は、このような足場が正常に培養胚性幹細胞を使用することができ、この足場ベースの培養系が^6,7の内側に播種した幹細胞の分化の様々な成長因子の効果をスクリーニングするために使用することができることが示されています。

このプロトコルの詳細polymerizinのプロセスグラムフィブリンは、トロンビンの酵素活性を用いてフィブリノゲン溶液から足場。プロセスは、重合を阻害するクエン酸塩を除去するフィブリノゲン溶液で一晩透析する工程を含む、完成には2日かかります。これらの詳細な方法は、胚および誘導多能性幹細胞培養のための最適であると判断さフィブリノゲン濃度に依存しています。他のグループはさらに、細胞の種類とアプリケーションの広い範囲のフィブリンの足場を検討した-このアプローチは^8から12の汎用性を実証した。

Protocol

プロトコルを開始する前に注意：フィブリノーゲンは、血液由来のタンパク質であり、したがって、適切な安全訓練が処理する前に完了する必要があります。このプロトコルは2日、所望の幹文化が適切に彼らは播種の準備ができていることを確認するための時間を完了する必要があります。どのくらいのフィブリノゲンは、トリスの3 35ミリメートルペトリ皿を量るための計算条件で400を含む1 24ウェルプレートを生成するのに十分であるTBSの3 mLに溶解フィブリノゲンの110から130 mgを含む（TBS、pH7.4）で緩衝生理食塩水各ウェルに添加フィブリン足場。

1。一日目：フィブリノゲン溶液と一晩透析を作る

冷蔵庫の凍結乾燥フィブリノゲンを取り出し、それが室温に来るようにできるように20分間座ってみましょう。
トリスの追加3 mLをそれぞれ35ミリメートルシャーレに生理食塩水（TBS）にバッファされます。 12から20までの濃度範囲フィブリノゲン溶液のフィブリノーゲン収率の各プレートには2〜3 mLのmg / mLとし、必要なフィブリノゲン量の合計は、これらの近似に基づいて計算することができます。
約100から130 mgのフィブリノーゲン（FG）を秤量し、それぞれの皿にTBSの存在の表面に振りかける。ソリューションに入るために開始するためにフィブリノゲンのために5分間待ってください。蓋付きのペトリ皿をカバーしています。
2時間フィブリノゲンが完全にTBS溶液に移動できるようにするために37℃でペトリ皿をインキュベートします。
TBSで濡れた透析チューブ（7000 MWはカットオフ）。チューブとクランプの端倍下端は、透析クランプでシャットダウンします。
透析チューブに皿からフィブリノゲン溶液をピペットで。上端の上に折り、透析クランプでシャットダウンクランプ。
TBSの4リットル容器にフィブリノゲン溶液を含有する透析チューブを配置します。低速（100回転）に設定し、撹拌プレートを使用してソリューションを混ぜる。
少なくとも12時間プレートをかき立てる上で一晩ソリューションを透析。 TBSソリューションは、この期間に変更する必要はありません。

これらの足場は、幹細胞培養物を接種されるように、このプロセスのために説明されているすべてのステップは滅菌組織培養フード内で実行する必要があります。

適切なサイズのコニカルチューブ（15 mlまたは50 mlのいずれか）に透析チューブと場所からフィブリノゲン溶液を削除します。
溶液中での大きな不純物を取り除くために5.0μmのシリンジフィルターとフィルターフィブリノゲン溶液。溶液の体積に応じて、複数のフィルタを使用すると、ソリューション全体を処理する必要があるかもしれません。
50mlコニカルチューブに0.22μmフィルターで滅菌フィルターフィブリノゲン溶液。適切なサイズのピペットを用いて、計算を行うときに、後で使用するためにろ過フィブリノゲン溶液の体積を決定します。溶液の体積に応じて、複数のフィルタの使用は、ENTを処理するために必要があるかもしれません怒り·ソリューションを提供します。
分光光度計を用いて280 nmでのフィブリノゲン溶液の吸光度を測定します。 50の希釈係数は1で吸光度を得るためにしばしば必要になります。
1.55は、ヒトフィブリノゲン¹³ ₂₈₀吸光係数である÷1.55 =（A _280×希釈倍率）[mg / mLでのフィブリノゲン]：次の式を用いてフィブリノゲン溶液中に存在するタンパク質の濃度を計算します。次のTBSの量を計算すると、最初のボリュームに基づいて、フィブリノゲンの11.1 mg / mlに溶液の濃度を希釈する必要がありました。フィブリン足場でのタンパク質の最終濃度は、重合後に10 mg / mLのでしょう。
滅菌トロンビンと塩化カルシウム溶液を得る。 24ウェルプレートの最初の行の各ウェルの右側に - ：まず、15μLトロンビン溶液（最終足場の濃度が2 U / mLとなります40 U / mLの濃度）を追加します。次に、50mMのカルシウムCHLの15μLを追加する各ウェルの左側にorideソリューションを提供します。最後に、プレートにフィブリノゲン溶液270μLを追加します。側からのソリューションの混合を確実にするために前に戻って揺れが続く側にプレートを横に振る。
混合物は室温で5分間重合を含む行してみましょう。それらが重合として足場はより不透明になります。
フィブリン足場、所望の数が重合されたまで、手順2.6および2.7を繰り返します。
最後の5分間のインキュベーション後に、足場の完全な重合を可能にするために37℃のインキュベーターの中にプレートを配置します。
1時間のインキュベーションが完了したら、次のステップは、胚様体と種子の足場をすることです。 20μLpipettemenを使用して、フィブリン足場の中心部にある個々の胚様体と場所を選択します。各ウェルは、単一の胚様体が含まれていることを顕微鏡で確認してください。
と50 mMの塩化カルシウムの5μL：トロンビン溶液5μL（40 U / mLの濃度）を追加各ウェルにフィブリノゲン溶液90μLに続いて、各胚様体の上にソリューションを提供します。解決策は、胚様体をカプセル化し、バブルを形成する必要があります。
重合を確実にするためにさらに1時間戻って、37℃インキュベーター内で場所のプレート。
インキュベーション後、37℃インキュベーターに戻し、各ウェルと場所プレートに適切な細胞培養培地の1 mLを加える。

3。代表的な結果

図1は、よく胚様体を接種した3Dフィブリン足場培養系を含む個々の側面図の概略を示しています。 図2Aは、マウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で培養されているマウスの人工多能性幹細胞の代表的なイメージを示します。これらの細胞は、その後8日レチノイン酸治療プロトコール（ 図2B）previouslとして使用して、胚様体、神経前駆細胞を含む細胞の凝集体を形成するように誘導される図3は、3Dフィブリン足場の内側に培養3日後にiPS細胞由来の胚様体の外観を示しながら、yが^14を説明します。同様の結果がマウス胚性幹細胞^7を使用^して、以前^に得られています。さらに、このメソッドは、この培養系の多様性を実証し、レチノイン酸とpurmorphamine 3Dフィブリン足場¹⁵の内部を含む別のプロトコルを使用して、文化のiPS由来の胚様体に製造され使用されています。

図1。
図1。よく胚様体で3Dフィブリン足場シードを含む個々の側面図を示す模式図。

図2。
図2。マウス誘導多能性幹（iPS）細胞培養と分化 。 neurにこれらの細胞を区別するらの表現型は、iPS細胞は胚様体（EB）をと呼ばれる細胞の凝集体を生成する懸濁液中で培養される。これらのEBはその後神経分化を誘導するレチノイン酸で処理され、このプロトコルは、以前に胚性幹細胞の神経分化を誘導するために使用されていました。 A）未分化マウスiPS細胞のコロニーは、マウス胚性線維芽細胞フィーダー層上で培養した。 B）懸濁培養でのマウスiPS細胞由来の胚様体は、神経分化を誘導するレチノイン酸による治療後8日目に撮影。スケールバーは100μmである。

図3。
マウスiPSの図3の例の結果は、3Dフィブリン足場の内側に培養3日後に体を胚。細胞はフィブリン足場の中に移行し、区別するために始めました。スケールバーは500μmである。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

上記の詳細は、このプロトコルは、マウス胚および誘導多能性幹細胞に特化し、多能性幹細胞培養用の3Dフィブリンの足場を生成するためのメソッドを提供します。この3Dバイオマテリアルベースの培養系は、より正確に生体内で見つかった幹細胞のニッチを模倣し、結果として、それは幹細胞の分化^6日にその効果を決定するために生物学的な手がかりをスクリーニングするために使用することができます。我々の観察では、これらの足場が胚様体由来の幹細胞を播種したときにことが示されている完全に分解さになる前にin vitroでの2週間残っています。さらに、これらの足場の安定性を向上させるために、アプロチニン（プロテアーゼ阻害剤）は、細胞培養培地に添加して劣化を遅らせるために使用することができます^。7,16、これらの足場には、特に神経組織工学アプリケーションでは、組織の生成のために首尾よく使用されている中枢神経系¹⁷に見られるのと似ています。一方、他のGRoupsは、虚血性脳卒中^18を治療するためにフィブリン糊を組み合わせたiPS細胞を持っている、この作品は、神経組織工学アプリケーションのためにフィブリンの足場を持つiPS細胞を組み合わせた最初の既知のレポートを表します。この作品は、他の組織工学アプリケーションのためのフィブリン足場に幹細胞の種類の範囲を結合するための出発点として役立った。

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgments

著者らは、 "誘導多能性幹細胞の挙動を制御するための組織工学的足場" NSERCディスカバリーグラント402462を確認したいと思います。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment needed:
Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO₂) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood
Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates
Fibrinogen (human)	Calbiochem	341578
Thrombin (human)	Sigma-Aldrich	T7009