Summary
这项工作的具体编制三维纤维支架plutipotent干细胞培养和分化。这种支架可用于筛选各种生物化合物对干细胞的行为的影响，以及修改为包含药物输送系统。
Abstract
干细胞被发现在三维微环境中自然产生的体内 ，它通常被称为干细胞小生境1。三维生物材料支架内培养干细胞提供了一种方法，准确地模仿这些微环境，提供文化，用聚苯乙烯以及更换工程的组织2的方法比传统的2D方法的优势。虽然已为大多数细胞培养实验中使用的二维组织培养聚苯乙烯，三维生物材料支架可以更密切地复制在体内环境中，使更准确的细胞极性建立和拥有生化和机械性能类似于软组织的微环境。 3一个多种自然派生和合成生物材料支架已被用于支持干细胞生长的3D环境调查。虽然合成支架材料可以合成有一个更大的ŕ安格机械和化学性能，往往有更大的重复性，通常由天然生物材料在细胞外基质含有细胞粘附的结合位点，并随时支持细胞培养的结果发现蛋白质和多糖。纤维蛋白支架，通过聚合获得的血浆蛋白纤维蛋白原生产，已被广泛研究了各种组织工程的应用， 在体外和体内 4。这种支架可以修改使用多种方法纳入控释系统提供治疗的因素5。以前的工作表明，这种支架可以用来成功地培养胚胎干细胞，并基于此脚手架的文化系统，可用于筛选内6,7种子的干细胞分化的各种生长因子的影响。
该协议的细节过程polymerizinĞ纤维支架纤维蛋白原使用凝血酶酶活性的解决方案。这个过程需要2天才能完成，包括纤维蛋白原的解决方案，以消除，抑制聚合的柠檬酸隔夜透析的步骤。这些详细的方法依赖于胚胎和诱导多能干细胞培养确定为最佳的纤维蛋白原浓度。其他团体作进一步调查的细胞类型和应用范围广泛的纤维蛋白支架-证明了这种方法的8-12的多功能性。
Protocol
开始之前协议的注释：纤维蛋白原是血源性蛋白，从而适当的安全训练之前，必须处理完成。此协议需要2天才能完成所需的干文化，所以时间适当，以确保它们的播种准备。在计算多少纤维蛋白原权衡，三个35毫米培养皿菜TRIS缓冲液（TBS，pH值7.4），含有110-130毫克的纤维蛋白原溶解于3毫升的TBS将足以产生1 24孔板含400在每口井的微升纤维支架。
1。第一天：纤维蛋白原的解决方案和隔夜透析
- 冻干纤维蛋白原的冰箱，让它坐了20分钟，以允许它来室温。
- 加入3毫升的Tris缓冲液（TBS）每35毫米培养皿。每个板的纤维蛋白原产量2至3毫升的纤维蛋白原溶液浓度从12到20mg / mL和纤维蛋白原总额可以根据这些近似计算。
- 称取约100-130毫克纤维蛋白原（Fg）和TBS电视台目前表面上洒在每一道菜。等待5分钟的纤维蛋白原开始进入解决方案。盖上盖培养皿。
- 孵育培养皿菜在37°C的2个小时，使纤维蛋白原完全进入TBS的解决方案。
- 湿透析管（7000兆瓦切断），用TBS。透析钳倍底端油管钳年底关闭。
- 吸取纤维蛋白原的解决方案，从菜肴到透析管。倍多高端和透析钳钳关闭。
- 成的TBS 4公升的容器中放置透析管含有纤维蛋白原的解决方案。混合溶液搅拌盘设置为低转速（100转）。
- 隔夜透析溶液，搅拌至少12小时板。 TBS的解决方案并不需要通过这段时间内改变。 2。第2天：聚合纤维蛋白支架和干细胞播种到支架
- 删除到一个适当大小的锥形管（15毫升或50毫升）从透析管和地方的纤维蛋白原的解决方案。
- 5.0微米的注射器过滤除去溶液中大量杂质的过滤纤维蛋白原的解决方案。根据解决方案的体积，使用多个过滤器可能需要处理的整个解决方案。
- 无菌过滤器的过滤用0.22微米到50毫升锥形管的纤维蛋白原的解决方案。使用适当的大小吸管，确定过滤纤维蛋白原的解决方案，以备后用做计算时的音量。根据解决方案的体积，可能需要使用多个过滤器处理耳鼻喉科愤怒的解决方案。
- 测量用分光光度计在280 nm的纤维蛋白原溶液的吸光度。一个50的稀释因素往往是必要的情况下取得1吸光度。
- 纤维蛋白原解决方案，使用下列公式计算：[毫克/毫升血浆纤维蛋白原浓度的蛋白质目前] =（280×稀释因子）÷1.55，其中1.55是在一个280人纤维蛋白原13消光系数。接下来计算所需的TBS稀释浓度为11.1毫克/毫升的初始音量根据纤维蛋白原的解决方案。终浓度的蛋白质纤维蛋白支架将聚合后的10毫克/毫升。
- 获取无菌凝血酶和氯化钙解决方案。首先，添加15μL的凝血酶溶液（浓度为40 U / ml的 - 在脚手架终浓度将是2个U / mL）的右侧第一排的24孔板中，每口井。接下来，添加15μL50毫米钙CHLoride解决方案，以每口井的左侧。最后，添加270μL的纤维蛋白原溶液的板块。摇板从侧面一边摇晃后到前的解决方案，以确保混合。
- 让行包含聚合混合物在室温下5分钟。棚架变得更加不透明，为他们聚合。
- 重复步骤2.6和2.7，直到所需数量的纤维蛋白支架已聚合。
- 最后5分钟的潜伏期后，放在里面的37℃培养箱板，棚架，以便完全聚合。
- 经过一个小时的潜伏期是完整的，下一步就是种子胚体的脚手架。使用20μLpipettemen，选择个别胚体中的纤维蛋白支架的中心地点。用显微镜检查，每口井包含一个单一的胚体。
- 添加5μL凝血酶溶液（浓度为40 U / ml的）和5μL50毫米氯化钙纤维蛋白原的解决方案，以每孔90μL每个胚体顶部的解决方案。该解决方案应形成泡沫封装胚体。
- 现浇板早在37°Ç孵化器增加一个小时，以确保聚合。
- 孵化后，合适的细胞培养基添加1毫升，每口井的地方板成37°C间孵化器。
这个过程中描述的所有步骤应执行这些支架，将干细胞培养接种在无菌组织培养引擎盖。
3。代表结果
图1显示了个人以及包含的三维纤维支架文化系统种植胚体。 图2A侧视示意图显示鼠标诱导多能干细胞培养小鼠胚胎成纤维细胞饲养层的代表图像。然后，这些细胞被诱导形成胚体，含有神经祖细胞的集合体，用8天的维甲酸治疗协议（ 图2B）previouslŸ描述14，而图3显示的IPS衍生的胚体经过3天的文化内的三维纤维蛋白支架的外观。已取得了类似的结果，以前用小鼠胚胎干细胞7。此外，这种方法已被用于文化IPS-衍生的胚体制作使用不同的协议，涉及维甲酸和purmorphamine的15三维纤维支架内，展示这个文化系统的多功能性。
图1。示意图显示的个人以及三维纤维支架种子含胚体的侧视图。
图2。小鼠诱导多能干细胞（iPS）细胞培养和分化 。这些细胞分化成neur人的表型，iPS细胞悬浮培养产生细胞的集合体称为胚体（EBS）。这些胚，然后用维甲酸诱导神经细胞分化和本议定书以前用来诱导胚胎干细胞的神经分化。一）未分化的小鼠iPS细胞集落培养对小鼠胚胎成纤维细胞饲养层。 b）从小鼠iPS细胞的悬浮培养的胚体维甲酸治疗后第8天，诱导神经细胞分化。比例尺是100微米。
图3示例结果的小鼠iPS胚状体的三维纤维支架内经过3天的文化机构。细胞迁移和分化的纤维蛋白支架内已经开始。比例尺是500微米。
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Discussion
上面详细介绍该协议产生的多能干细胞培养小鼠胚胎和诱导多能干细胞的三维纤维支架，专门提供了一个方法。这三维生物材料为基础的文化系统，更准确地模仿体内发现的干细胞小生境，作为一个结果，它可以用来筛选生物的线索，以确定对干细胞分化6的影响。我们的观察表明，干胚体细胞在体外培养2周保持完全降解之前，播种时，这些支架。为了进一步提高这些支架的稳定，抑肽酶（一种蛋白酶抑制剂）可以用来减缓退化的细胞培养基。7,16这些支架也已成功地用于神经组织工程的应用，特别是组织的代类似的发现，在中枢神经系统的17。而其他GRoups结合iPS细胞与纤维蛋白胶用于治疗缺血性中风18，这项工作的iPS细胞与纤维蛋白支架神经组织工程的应用相结合的第一个已知的报告。这项工作，还担任了与其他组织工程应用中的纤维蛋白支架相结合的干细胞类型范围的出发点。
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Disclosures
作者没有透露。
Acknowledgments
笔者想承认“诱导多能干细胞的行为控制的组织工程支架材料”NSERC发现格兰特402462。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
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| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
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| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
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