Summary
Dit werk beschrijft de voorbereiding van de 3D-fibrine steigers voor het kweken en te differentiëren plutipotent stamcellen. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gebruikt om de effecten van verschillende biologische verbindingen op stamcellen gedrag vertonen en aangepast medicijnafgiftesystemen bevatten.
Abstract
Stamcellen in de natuur voorkomende micro-omgevingen 3D in vivo, die vaak worden aangeduid als de stamcel nis 1. Kweken stamcellen in 3D biomateriaal scaffolds een manier om nauwkeurig na te bootsen deze micro-omgevingen, die een ten opzichte van traditionele 2D kweekmethoden met polystyreen als een werkwijze voor technische vervangende weefsels 2. Terwijl 2D weefselkweek polystyreen is gebruikt voor de meerderheid van de celkweek experimenten, kan 3D-biomateriaal steigers beter een kopie van de micro-omgevingen in vivo door zodat een nauwkeurigere oprichting van de cel polariteit in het milieu en het bezit van biochemische en mechanische eigenschappen die vergelijkbaar zijn weke delen. 3 Een variëteit aan natuurlijk verkregen en synthetische biomateriaal steigers werden bestudeerd als een 3D-omgevingen voor de ondersteuning van stamcellen groei. Terwijl synthetische steigers kunnen worden gesynthetiseerd een grotere r hebbenange van mechanische en chemische eigenschappen en vaak grotere reproduceerbaarheid worden natuurlijke biomaterialen vaak uit eiwitten en Polysacchariden in de extracellulaire matrix en daardoor bevatten bindingsplaatsen voor celhechting en gemakkelijk ondersteunen celkweek. Fibrine steigers, door polymeriseren van het eiwit fibrinogeen verkregen plasma, zijn uitgebreid onderzocht voor diverse technische toepassingen tissue in vitro en in vivo 4. Dergelijke draagstructuren kunnen worden gemodificeerd met verschillende methoden voor gecontroleerde vrijgave omvatten systemen voor het afgeven van therapeutische factoren 5. Vroeger werk heeft aangetoond dat dergelijke steigers kan worden succes cultuur embryonale stamcellen en de scaffold gebaseerde cultuur systeem kan worden gebruikt om de effecten van verschillende groeifactoren op de differentiatie van de stamcellen geënt in 6,7 screenen.
Dit protocol stelt de procedure van polymerizing fibrine steigers uit fibrinogeen oplossingen met de enzymatische activiteit van trombine. Het duurt twee dagen in beslag, zoals een nacht dialysestap de fibrinogeen oplossing citraten dat polymerisatie remt verwijderen. Deze gedetailleerde methoden rekenen op fibrinogeen concentraties vastgesteld dat het optimaal is voor de embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen cultuur. Andere groepen verder onderzocht fibrine dragers voor een groot bereik aan celtypen en toepassingen - aantonen van de veelzijdigheid van deze benadering 8-12.
Protocol
Opmerkingen vóór het begin van het protocol: Fibrinogeen is een bloed afkomstig eiwit en dus passende veiligheidsnormen opleiding moet vóór verwerking worden. Dit protocol heeft 2 dagen in beslag, zodat de tijd de gewenste stam culturen behoren te zorgen dat ze klaar zijn voor het zaaien. In het berekenen hoeveel fibrinogeen af te wegen, drie 35 mm petri-schalen van tris gebufferde zoutoplossing (TBS, pH 7,4) bevattende 110 tot 130 mg fibrinogeen opgelost in 3 ml TBS voldoende zijn om een 24 wells plaat met 400 produceren ul fibrine steigers in elk putje.
1. Eerste dag: Het maken van fibrinogeen oplossingen en 's nachts dialyse
- Neem gevriesdroogd fibrinogeen uit de koelkast en laat het zitten voor 20 minuten laat het op kamertemperatuur komen.
- 3 ml Tris gebufferde zoutoplossing (TBS) elk 35 mm petrischaal. Elke plaat van fibrinogeen opbrengst 2-3 ml fibrinogeenoplossing met concentraties 12-20mg / ml en de totale hoeveelheid benodigde fibrinogeen kan worden berekend op basis van deze benaderingen.
- Weeg ongeveer 100-130 mg fibrinogeen (FG) en strooi er op het oppervlak van de TBS in elk gerecht. Wacht 5 minuten om de fibrinogeen om te beginnen met in oplossing gaan. Bedek petrischaal met deksel.
- Incubeer Petrischalen bij 37 ° C gedurende 2 uur om het fibrinogeen volledig naar de TBS oplossing.
- Wet dialyse slang (7000 MW afgesneden) met TBS. Vouw de onderkant van de slang en klem het einde dicht met een dialyse klem.
- Pipetteer de fibrinogeen-oplossingen van gerechten in de dialyse slang. Vouw bovenkant en klem dicht met een dialyse klem.
- Plaats dialyse catheter met fibrinogeen oplossing in een 4 liter container van TBS. Mix oplossing met ophef plaat ingesteld op een laag toerental (100 tpm).
- 'S nachts Dialyze oplossing op roer plaat voor ten minste 12 uur. De TBS oplossing niet behoeft te worden gewijzigd in deze periode. 2. Dag 2: Polymerisatie van fibrine steigers en het zaaien van stamcellen in de steigers
- Verwijder de fibrinogeen-oplossing van dialyse slang en plaats in een geschikte grootte conische buis (hetzij 15 ml of 50 ml).
- Filter fibrinogeenoplossing met 5,0 urn spuitfilter grote onzuiverheden uit de oplossing. Afhankelijk van het volume van de oplossing, kan het gebruik van meerdere filters nodig zijn om de volledige oplossing te verwerken.
- Steriel filter de fibrinogeenoplossing met een 0,22 pm filter in een 50 ml conische buis. Met een geschikte grootte pipet bepalen de omvang van de gefilterde fibrinogeenoplossing later gebruikt bij het uitvoeren berekeningen. Afhankelijk van het volume van de oplossing, kan het gebruik van meerdere filters nodig zijn om de ent te verwerkenire oplossing.
- Meet absorptie van het fibrinogeen-oplossing bij 280 nm met de spectrofotometer. Een verdunning van 50 het vaak nodig om een absorptie verkregen onder 1.
- De concentratie van proteïne in de fibrinogeenoplossing met de volgende formule: [fibrinogeen in mg / ml] = (A 280 x Verdunningsfactor) ÷ 1,55 1,55 wanneer de extinctiecoëfficiënt bij A 280 menselijk fibrinogeen 13. Vervolgens berekent de hoeveelheid TBS nodig om de concentratie van de oplossing tot 11,1 mg / ml fibrinogeen op het oorspronkelijke volume te verdunnen. De uiteindelijke concentratie proteïne in de fibrine steigers dan 10 mg / ml na polymerisatie.
- Zorg voor steriele trombine en calciumchloride oplossingen. Eerste toe 15 pi thrombine-oplossing (concentratie: 40 U / ml - eindconcentratie in scaffold zijn 2 U / ml) opzij van elk putje in de eerste rij van de 24 wells plaat. Vervolgens voeg 15 ul van 50 mM calcium CHLoride oplossing links elk putje. Voeg tenslotte 270 pl van het fibrinogeen-oplossing aan de plaat. Schud plaat van links naar rechts, gevolgd door het schudden van achter naar voor om ervoor te zorgen mengen van oplossingen.
- Laat de rij met het mengsel gedurende 5 minuten polymeriseren bij kamertemperatuur. De steigers meer ondoorzichtig als ze polymeriseren.
- Herhaal stap 2.6 en 2.7 tot het gewenste aantal fibrine steigers zijn gepolymeriseerd.
- Na de laatste vijf minuten incubatie plaats de platen in een 37 ° C incubator voor volledige polymerisatie van steigers.
- Na de een uur durende incubatie is voltooid, is de volgende stap is het zaad het schavot met embryo lichamen. Een 20 pL pipettemen, selecteert een individuele embryoiden lichaam in het midden van de fibrine scaffold. Neem contact op met microscoop die elk putje een embryoid lichaam bevat.
- Voeg 5 ul van thrombine-oplossing (concentratie: 40 U / ml) en 5 pi 50 mM calciumchlorideoplossing op elkaar embryoid lichaam gevolgd door 90 ul van fibrinogeen-oplossing in elk putje. De oplossing moeten vormen een luchtbel inkapselen van het embryo organen.
- Plaat weer 37 ° C incubator gedurende een extra uur bij polymerisatie te waarborgen.
- Na incubatie, 1 ml van de juiste cel cultuur media terug toe te voegen aan elk putje en laat de plaat in 37 ° C incubator.
Alle handelingen hiervoor beschreven proces wordt uitgevoerd in een steriele weefselkweek afzuigkap deze steigers wordt geënt met stamcellen culturen.
3. Representatieve resultaten
Figuur 1 toont een schema van het zijaanzicht van een individu en met 3D fibrine scaffold teeltsysteem geënt met embryoid lichaam. Figuur 2A toont representatief beelden van muizen geïnduceerd pluripotente cellen worden gekweekt op muizen embryonale fibroblast feeder lagen. Deze cellen worden daarna geïnduceerd om embryoiden organen aggregaten van cellen die neurale voorlopercellen met een 8 dagen retinoïnezuur behandelingsprotocol (Figuur 2B) als previousl vormeny beschreven 14 terwijl Figuur 3 toont het uiterlijk van een IPS-afgeleid embryoid lichaam na 3 dagen van de cultuur binnenkant van 3D-fibrine steigers. Soortgelijke resultaten zijn eerder verkregen met behulp van muis embryonale stamcellen 7. Daarnaast is deze methode is gebruikt om de cultuur iPS-afgeleid embryoid lichamen geproduceerd met behulp van een ander protocol met betrekking tot retinoïnezuur en purmorphamine 15 binnenkant van 3D-fibrine steigers, het aantonen van de veelzijdigheid van deze cultuur-systeem.
Figuur 1. Schematische toont het zijaanzicht van een individu en met 3D fibrine scaffold geplaatste een embryoid lichaam.
Figuur 2. Muis geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) celkweek en differentiatie. Om deze cellen differentiëren tot neural fenotypes, worden de iPS cellen gekweekt in suspensie op aggregaten van de cellen, embryo organen (EBS) te produceren. Deze EBS worden dan behandeld met retinoinezuur aan neurale differentiatie te induceren en dit protocol werd eerder gebruikt om neurale differentiatie van embryonale stamcellen te induceren. A) Ongedifferentieerde muis iPS cel kolonie gekweekt op een muis embryonale fibroblast feeder-laag. B) embryo lichamen afgeleid van de muis iPS cellen in suspensie cultuur die op dag 8 na de behandeling met retinoïnezuur tot neurale differentiatie te induceren. Schaal bar is 100 micrometer.
Figuur 3. Voorbeeld resultaten van een muis iPS embryoiden lichaam na 3 dagen kweken in een 3D fibrine scaffold. Cellen zijn begonnen met het migreren en differentiëren binnenkant van de fibrine schavot. Schaal bar is 500 pm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol hierboven beschreven biedt een methode voor het genereren van 3D-fibrine steigers voor pluripotente stamcellen cultuur, specifiek voor muis embryonale en geïnduceerde pluripotente stamcellen. Deze 3D biomateriaal gebaseerd teeltsysteem nauwkeuriger bootst de stamcellen nis in vivo en daardoor kan worden gebruikt om biologische signalen screenen om hun effecten op stamceldifferentiatie 6 bepalen. Onze observaties hebben aangetoond dat deze steigers toen gezaaid met zijn afgeleid van stamcellen embryo instanties voor 2 weken in vitro blijven voordat hij volledig afgebroken. Om verder te verhogen de stabiliteit van deze steigers, kan aprotinine (een protease-remmer) gebruikt worden om degradatie te vertragen door middel van toevoeging aan de celkweek media. 7,16 Deze steigers zijn ook met succes gebruikt voor zenuwweefsel technische toepassingen, in het bijzonder de generatie van het weefsel vergelijkbaar met die in het centrale zenuwstelsel 17. Terwijl andere groepen hebben iPS cellen met fibrine lijm voor de behandeling van ischemische beroerte 18 gecombineerd, dit werk is de eerste bekende rapport van het combineren van iPS cellen met fibrine steigers voor zenuwweefsel technische toepassingen. Dit werk diende ook als uitgangspunt voor het combineren van een reeks van stamcel typen met fibrine steigers voor andere tissue engineering toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag NSERC Discovery Grant 402462 "weefselmanipulatieproduct steigers voor het regelen van geïnduceerde pluripotente stamcellen zijn gedrag" te erkennen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
