Summary
Questi i dettagli del lavoro per la preparazione di fibrina scaffold 3D per la coltura e differenziazione delle cellule staminali plutipotent. Tali ponteggi può essere usata per selezionare gli effetti di vari composti biologici sul comportamento cellule staminali nonché modificata per contenere sistemi di drug delivery.
Abstract
Cellule staminali si trovano in natura microambienti 3D in vivo, che sono spesso denominati nicchia cellule staminali 1. Coltura di cellule staminali all'interno di 3D scaffold biomateriale fornisce un modo per riprodurre accuratamente questi microambienti, fornendo un vantaggio rispetto ai tradizionali metodi di coltura 2D utilizzando polistirene nonché un metodo per tessuti di ricambio ingegneria 2. Mentre 2D polistirene coltura tissutale è stato utilizzato per la maggior parte degli esperimenti di coltura cellulare, 3D ponteggi biomateriale può più strettamente replicare i microambienti trovate in vivo consentendo costituzione più accurata di polarità cella nell'ambiente e possiede proprietà biochimiche e meccaniche simili a tessuti molli. 3 Una varietà di derivazione naturale e sintetico ponteggi biomateriale sono stati studiati come ambienti in 3D per sostenere la crescita delle cellule staminali. Mentre ponteggi sintetici possono essere sintetizzati per avere una maggiore range di proprietà meccaniche e chimiche e spesso hanno una maggiore riproducibilità, biomateriali naturali sono spesso composti di proteine e polisaccaridi presenti nella matrice extracellulare e di conseguenza contengono siti di legame per l'adesione cellulare e facilmente sostenere la coltura cellulare. Ponteggi fibrina, prodotto polimerizzando il fibrinogeno proteina ottenuta da plasma, sono stati ampiamente studiati per una varietà di applicazioni di ingegneria tissutale sia in vitro e in vivo 4. Tali ponteggi può essere modificata utilizzando una varietà di metodi per incorporare sistemi a rilascio controllato per fornire fattori terapeutici 5. Studi precedenti hanno dimostrato che tali ponteggi può essere utilizzato con successo per coltura di cellule staminali embrionali e questo scaffold sistema di coltura può essere usata per selezionare gli effetti di vari fattori di crescita sulla differenziazione delle cellule staminali seminate dentro 6,7.
Questo protocollo dettagli il processo di polymerizing fibrina ponteggi da soluzioni fibrinogeno utilizzando l'attività enzimatica della trombina. Il processo si fa in 2 giorni per completare, compresa una fase di dialisi per tutta la notte per la soluzione del fibrinogeno per rimuovere citrati che inibiscono la polimerizzazione. Questi metodi dettagliati contare su concentrazioni di fibrinogeno determinati a essere ottimale per la coltura embrionale e indotto cellule staminali pluripotenti. Altri gruppi hanno ulteriormente investigato ponteggi fibrina per una vasta gamma di tipi di cellule e applicazioni - dimostrare la versatilità di questo approccio 8-12.
Protocol
Note prima di iniziare il protocollo: Il fibrinogeno è una proteina del sangue derivato e formazione sulla sicurezza quindi opportuno deve essere completata prima manipolazione. Questo protocollo richiede 2 giorni per completare così il tempo delle culture staminali desiderati in modo appropriato per assicurare che siano pronti per la semina. In termini di calcolare la quantità di fibrinogeno da pesare, tre piastre da 35 mm di Petri di soluzione salina tamponata Tris (TBS, pH 7,4) contenente 110-130 mg di fibrinogeno sciolto in 3 ml di TBS sarà sufficiente a produrre 1 24 pozzetti contenente 400 ponteggi fibrina pl in ogni pozzetto.
1. Day One: Making soluzioni di fibrinogeno e la dialisi per tutta la notte
- Prendere fibrinogeno liofilizzato fuori dal frigorifero e lasciare riposare per 20 minuti per permettere di venire a temperatura ambiente.
- Aggiungere 3 mL di soluzione salina tamponata Tris (TBS) a ciascuna capsula di Petri 35 millimetri. Ciascuna piastra di rendimenti fibrinogeno 2 a 3 ml di soluzione di fibrinogeno che vanno in concentrazione 12-20mg / ml e la quantità totale di fibrinogeno necessario può essere calcolato sulla base di queste approssimazioni.
- Pesare circa 100-130 mg di fibrinogeno (Fg) e cospargere sulla superficie del presente TBS in ogni piatto. Attendere 5 minuti per il fibrinogeno per iniziare ad andare in soluzione. Coprire con coperchio capsula di Petri.
- Incubare le piastre di Petri a 37 ° C per 2 ore per permettere il fibrinogeno di andare completamente nella soluzione TBS.
- Dialisi tubo Wet (7000 MW tagliata) con TBS. Fold estremità inferiore della fine tubo e pinza chiusa con una fascetta dialisi.
- Pipettare le soluzioni di fibrinogeno, dai piatti in tubi di dialisi. Ripiegare estremità superiore e bloccare chiuso con una fascetta dialisi.
- Luogo dialisi tubo contenente la soluzione di fibrinogeno in un contenitore 4 di litro di TBS. Mix soluzione con piastra di agitazione impostato a bassa velocità (100 rpm).
- Dializzare soluzione di pernottamento a mescolare piastra per almeno 12 ore. La soluzione TBS non deve essere cambiata in questo periodo di tempo. 2. Giorno 2: Polimerizzazione di ponteggi di fibrina e la semina di cellule staminali in ponteggi
- Rimuovere la soluzione di fibrinogeno dal tubo di dialisi e posto in un apposito tubo dimensionato conica (o 15 ml o 50 mL).
- Fibrinogeno soluzione filtro con un filtro a siringa da 5,0 um per rimuovere le impurità grandi nella soluzione. A seconda del volume della soluzione, l'utilizzo di più filtri può essere necessario elaborare l'intera soluzione.
- Filtro sterile con la soluzione di fibrinogeno da 0,22 micron filtro in un tubo conico 50mL. Usando una pipetta di dimensioni adeguate, determinare il volume della soluzione filtrata fibrinogeno da utilizzare in seguito quando fare calcoli. A seconda del volume della soluzione, l'utilizzo di più filtri può essere necessario elaborare il entire soluzione.
- Misurare assorbanza della soluzione di fibrinogeno a 280 nm usando uno spettrofotometro. Un fattore di diluizione 50 è spesso necessario per ottenere una assorbanza sotto 1.
- Calcolare la concentrazione di proteine presenti nella soluzione fibrinogeno utilizzando la seguente equazione: [Fibrinogeno in mg / ml] = (A 280 × diluizione Factor) 1,55 ÷ 1,55 dove è il coefficiente di estinzione a 280 A per il fibrinogeno umano 13. Avanti calcolare la quantità di TBS necessaria per diluire la concentrazione della soluzione di 11,1 mg / ml di fibrinogeno in base al volume iniziale. La concentrazione finale di proteine nella ponteggi fibrina sarà di 10 mg / ml dopo la polimerizzazione.
- Ottenere trombina sterile e soluzioni di cloruro di calcio. In primo luogo, aggiungere 15 ul di soluzione di trombina (concentrazione: 40 U / mL - concentrazione finale in scaffold sarà di 2 U / mL) a destra di ciascun pozzetto nella prima riga della piastra a 24 pozzetti. Successivamente, aggiungere 15 microlitri di 50 CHL calcio mMoride soluzione al lato sinistro di ciascun pozzetto. Infine, aggiungere 270 microlitri della soluzione di fibrinogeno alla piastra. Agitare piastra da lato a lato, poi scuotere posteriore a quella anteriore per garantire la miscelazione delle soluzioni.
- Sia la riga contenente la miscela polimerizzare per 5 minuti a temperatura ambiente. Le impalcature diventano più opachi come polimerizzare.
- Ripetere le fasi 2.6 e 2.7 fino al numero desiderato di ponteggi fibrina sono stati polimerizzati.
- Dopo l'ultimo 5 minuti di incubazione, porre le piastre all'interno di un incubatore a 37 ° C per consentire la completa polimerizzazione ponteggi.
- Dopo l'incubazione uno ora è completa, il passo successivo è alle sementi al patibolo con corpi embrionali. Utilizzando un pipettemen 20 microlitri, selezionare un corpo individuale embrioide e posto al centro del patibolo fibrina. Verificare con il microscopio che ogni pozzetto contiene un unico corpo embrioide.
- Aggiungere 5 pl di soluzione di trombina (concentrazione: 40 U / mL) e 5 microlitri di 50 mM cloruro di calciosoluzione su ciascun corpo embrioide seguito da 90 microlitri di soluzione di fibrinogeno ad ogni pozzetto. La soluzione deve formare una bolla che incapsula i corpi embrionali.
- Luogo piastra posteriore in incubatore a 37 ° C per un'ora supplementare per garantire la polimerizzazione.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 1 mL dei mezzi appropriati di colture cellulari per ogni piatto ben luogo e indietro nel 37 ° C incubatore.
Tutte le fasi descritte per tale processo deve essere eseguito in una cappa sterile coltura tissutale come questi scaffold saranno seminate con colture di cellule staminali.
3. Risultati rappresentativi
Figura 1 mostra una schematica vista laterale di un singolo pozzetto contenente il 3D fibrina sistema cultura scaffold seminati con un corpo embrioide. Figura 2A mostra immagini rappresentative di cellule staminali pluripotenti indotte topo in coltura su strati di fibroblasti embrionali di topo feeder. Queste cellule vengono quindi indotte a formare corpi embrionali, aggregati di cellule contenenti progenitori neurali, utilizzando uno 8 giorni retinoico protocollo di trattamento (Figura 2B) come previously descritto 14 mentre la Figura 3 mostra l'aspetto di un IPS-derivato corpo embrioide dopo 3 giorni di coltura all'interno di 3D ponteggi fibrina. Risultati simili sono stati ottenuti in precedenza con cellule staminali embrionali di topo 7. Inoltre, questo metodo è stato utilizzato per la cultura IPS-derivati corpi embrionali prodotte utilizzando un protocollo diverso, con l'acido retinoico e purmorphamine 15 all'interno del 3D ponteggi fibrina, a dimostrazione della versatilità di questo sistema di coltura.
Figura 1. Schematico che mostra la vista laterale di un singolo pozzetto contenente un 3D fibrina scaffold seminato con un corpo embrioide.
Figura 2. Mouse staminali pluripotenti indotte (iPS), coltura cellulare e la differenziazione. Per differenziare queste cellule in neurfenotipi al, le cellule iPS sono coltivate in sospensione per la produzione di aggregati di cellule chiamate corpi embrionali (EBS). Questi EBs vengono poi trattate con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale e questo protocollo è stato precedentemente usato per indurre il differenziamento neurale delle cellule staminali embrionali. A) indifferenziato topo cellule iPS colonia coltivati su una embrionale strato di fibroblasti topo alimentatore. B) corpi embrionali derivate da cellule iPS topo in coltura in sospensione adottata il giorno 8 dopo trattamento con acido retinoico di indurre il differenziamento neurale. Barra della scala è di 100 micron.
Risultati dell'esempio Figura 3. Di un IPS topo embryoid corpo dopo 3 giorni di coltura all'interno di uno scaffold 3D fibrina. Le cellule hanno cominciato a migrare e differenziarsi all'interno del patibolo fibrina. Barra della scala è di 500 micron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo protocollo dettagliato sopra fornisce un metodo per generare 3D ponteggi di fibrina per la coltura di cellule staminali pluripotenti, in particolare per embrionali di topo e cellule staminali pluripotenti indotte. Questo sistema biomateriale cultura 3D basato più accuratamente imita la nicchia delle cellule staminali trovato in vivo e, di conseguenza, può essere usata per selezionare segnali biologici per determinare i loro effetti sulla differenziazione delle cellule staminali 6. Le nostre osservazioni hanno mostrato che quando questi scaffold seminati con cellule staminali derivate corpi embrionali rimangono per 2 settimane in vitro prima di diventare completamente degradata. Per aumentare ulteriormente la stabilità di questi scaffold, aprotinina (un inibitore della proteasi) può essere usato per rallentare la degradazione mediante aggiunta ai mezzi di coltura cellulare. 7,16 Tali ponteggi sono stati utilizzati con successo per applicazioni di ingegneria tissutale neurali, in particolare la generazione di tessuti simile a quella presente nel sistema nervoso centrale 17. Mentre altri groups hanno combinato le cellule iPS con colla di fibrina per il trattamento di ictus ischemico 18, questo lavoro rappresenta il primo rapporto nota di combinare cellule iPS, con impalcature di fibrina per applicazioni di ingegneria dei tessuti neurali. Questo lavoro è stato anche un punto di partenza per combinare una serie di tipi di cellule staminali con impalcature di fibrina per altre applicazioni di ingegneria tissutale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare NSERC Discovery Grant 402462 "scaffolds di ingegneria tessutale indotta per il controllo delle cellule staminali pluripotenti comportamento".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
