Summary
Detta arbete detaljer förberedelse av 3D fibrin ställningar för odling och differentiering plutipotent stamceller. Sådana ställningar kan användas för att screena effekterna av olika biologiska föreningar på stamceller beteende samt modifierats för att innehålla läkemedelsavgivningssystem.
Abstract
Stamceller som finns i naturligt förekommande 3D mikromiljöer in vivo, vilket ofta refereras till som stamceller nisch 1. Odling av stamceller inuti 3D biomaterial byggnadsställningar är ett sätt att exakt efterlikna dessa mikromiljöer, vilket ger en fördel jämfört med traditionella 2D kultur metoder med polystyren samt en metod för att vävnader tekniska ersättning 2. Medan 2D vävnadskultur polystyren har använts för de flesta av experiment cellodling kan 3D biomaterial ställningar närmare replikera mikromiljöer som finns in vivo genom att möjliggöra mer exakt fastställande av cell polaritet i miljön och som har biokemiska och mekaniska egenskaper som liknar mjuk vävnad. 3 En mängd olika naturligt framställda och syntetiska biomaterial byggnadsställningar har undersökts som 3D-miljöer för att stödja tillväxt stamceller. Även syntetiska ställningar kan syntetiseras ha en större rorange av mekaniska och kemiska egenskaper och har ofta större reproducerbarhet, är naturliga biomaterial ofta sammansatta av proteiner och polysackarider som finns i den extracellulära matrisen och som ett resultat innehåller bindningsställen för celladhesion och lätthet cellkultur. Fibrin ställningar, som produceras genom polymerisation av proteinet fibrinogen erhålles från plasma, har undersökts i stor utsträckning för en mängd olika tillämpningar vävnadsutvecklingssteg både in vitro och in vivo 4. Sådana ställningar kan ändras med hjälp av olika metoder för att integrera system med kontrollerad frisättning för att leverera terapeutiska faktorer 5. Tidigare arbete har visat att sådana ställningar kan användas för att framgångsrikt kultur embryonala stamceller, och denna stödstruktur-baserade odlingssystem kan användas för att screena effekterna av olika tillväxtfaktorer på differentiering av stamcellerna ympade inuti 6,7.
Detta protokoll detaljer processen för polymerizing fibrin stödstrukturer från fibrinogen lösningar med den enzymatiska aktiviteten av trombin. Processen tar 2 dagar att slutföra, inklusive en övernattning dialys steg för fibrinogen lösningen att ta bort citrater som hämmar polymerisation. Dessa detaljerade metoder förlitar sig på fibrinogenkoncentrationer bestämts vara optimal för embryonal och inducerade pluripotenta stamceller kultur. Andra grupper har ytterligare undersökt fibrin ställningar för ett brett spektrum av celltyper och applikationer - visar mångsidigheten av denna strategi 8-12.
Protocol
Anteckningar innan du börjar protokollet: Fibrinogen är en blod härstammar protein och därför lämpligt säkerhetsutbildning måste slutföras innan hantering. Detta protokoll kräver 2 dagar att slutföra så tiden önskade stamcellerna kulturerna lämpligt att säkerställa att de är redo för sådd. I termer av att beräkna hur mycket fibrinogen till väga, tre 35 mm petriskålar av tris-buffrad saltlösning (TBS, pH 7,4) innehållande 110-130 mg av fibrinogen upplöst i 3 ml av TBS kommer att vara tillräcklig för att producera en 24 brunnars platta innehållande 400 il fibrin ställningar i varje brunn.
1. Dag ett: Att fibrinogen lösningar och natten dialys
- Ta lyofiliserat fibrinogen ur kylskåpet och låt det sitta i 20 minuter för att kunna komma till rumstemperatur.
- Tillsätt 3 ml Tris-buffrad saltlösning (TBS) till varje 35 mm petriskål. Varje platta av fibrinogen ger 2 till 3 ml av fibrinogen-lösning varierar i koncentration från 12 till 20mg / ml och den totala mängden fibrinogen som behövs kan beräknas baserat på dessa approximationer.
- Väg upp approximativt 100-130 mg fibrinogen (Fg) och strö på ytan av TBS närvarande i varje skål. Vänta 5 min för fibrinogen att börja gå i lösning. Täck petriskål med lock.
- Inkubera petriskålar vid 37 ° C under 2 timmar för att tillåta fibrinogen till fullo gå in i TBS-lösning.
- Våt dialysrör (7000 MW avbröt) med TBS. Fold nedre änden av slangen och klämma slutet igen med en dialys klämma.
- Pipettera över fibrinogen lösningar från diskgodset i dialysslang. Vik över övre änden och klämma igen med en dialys klämma.
- Ställe dialysrör innehållande fibrinogen-lösning i en 4 liters behållare TBS. Blandning med användning av omrörarplatta inställd till låg hastighet (100 rpm).
- Dialysera lösningen övernattning på rör plattan under minst 12 timmar. TBS Lösningen behöver inte ändras under denna tidsperiod. 2. Dag 2: Polymerisation av fibrin byggnadsställningar och sådd av stamceller till byggnadsställningar
- Avlägsna fibrinogenlösning från dialysslangen och placera i ett lämpligt dimensionerat koniskt rör (antingen 15 ml eller 50 ml).
- Filtret fibrinogenlösning med en 5,0 fim sprutfilter för att avlägsna stora föroreningar i lösningen. Beroende på volymen av lösningen, kan användningen av multipla filter vara nödvändigt att behandla hela lösningen.
- Sterilfiltrera fibrinogenlösning med ett 0,22 pm filter in i en 50 ml koniskt rör. Användning av en lämplig storlek pipett, bestämma volymen hos den filtrerade fibrinogen lösning för senare användning när man gör beräkningar. Beroende på volymen av lösningen, kan användningen av multipla filter vara nödvändigt att behandla entire lösning.
- Mäta absorbans fibrinogenlösning vid 280 nm med en spektrofotometer. En utspädningsfaktor av 50 det ofta nödvändigt att erhålla en absorbans under 1.
- Beräkna koncentrationen av protein som föreligger i fibrinogenlösning med användning av följande ekvation: [fibrinogen i mg / ml] = (A 280 x spädningsfaktor) ÷ 1,55 där 1,55 är extinktionskoefficienten vid A 280 för humant fibrinogen 13. Nästa beräkna TBS som behövs för att späda ut koncentrationen av lösningen till 11,1 mg / ml av fibrinogen baserat på den initiala volymen. Den slutliga koncentrationen av protein i den fibrin-ställningar är 10 mg / ml efter polymerisation.
- Skaffa sterila trombin och kalcium klorid. Första, tillsätt 15 | il trombin (koncentration: 40 U / ml - slutlig koncentration i ställningen kommer att vara 2 U / ml) till höger om varje brunn i den första raden i 24-brunnars platta. Därefter tillsättes 15 pl av 50 mM kalcium CHLoride lösning till vänster i varje brunn. Slutligen tillsättes 270 | il av den fibrinogenlösning till plattan. Skaka plattan från sida till sida, följt av skakning bakifrån och framåt för att säkerställa blandning av lösningar.
- Låta den rad som innehåller blandningarna polymeriseras under 5 minuter vid rumstemperatur. De skeletten bli mer opak när de polymeriseras.
- Upprepa steg 2.6 och 2.7 tills det önskade antalet fibrin ställningar har polymeriserats.
- Efter den sista 5 min inkubation, placera plattorna inne i en 37 ° C inkubator för att möjliggöra fullständig polymerisation av byggnadsställningar.
- Efter en timmes inkubering är klar är nästa steg att utsädet ställningen med embryoidkroppar. Med en 20 pl pipettemen, välja en enskild embryoid kropp och plats i mitten av fibrin ställningen. Kontrollera med mikroskop som varje brunn innehåller en enda embryoid kropp.
- Tillsätt 5 pl trombin-lösning (koncentration: 40 U / ml) och 5 pl av 50 mM kalciumkloridLösningen på toppen av varje embryoidkroppar kroppen följt av 90 | il av fibrinogen-lösning till varje brunn. Lösningen bör bilda en bubbla kapsla in embryoidkroppar.
- Placera plattan tillbaka i 37 ° C inkubator under en ytterligare timme för att säkerställa polymerisation.
- Efter inkubation, tillsätt 1 ml av lämpliga cellodlingsmedier till varje brunn och placera plattan tillbaka till 37 ° C inkubator.
Alla steg som beskrivits för denna process skall utföras i en steril vävnadsodling huven dessa ställningar kommer att ympas med stamcellskulturer.
3. Representativa resultat
Figur 1 visar en schematisk vy av den från sidan av en individuell brunn innehållande 3D fibrin ställningen odlingssystem ympades med en embryoidkroppar kropp. Figur 2A visar representativa bilder av mus inducerad pluripotenta stamceller som odlats på mus embryonala fibroblastceller skikt feeder. Dessa celler får sedan induceras för att bilda embryoidkroppar, aggregat av celler innehållande neurala stamceller, som använder en 8 dagars retinsyra protokoll syrabehandling (figur 2B) som previously beskrivs 14 medan figur 3 visar utseendet på en iPS härrörande embryoid kroppen efter 3 dagars odling insidan av 3D-fibrin ställningar. Liknande resultat har erhållits tidigare med användning av embryonala stamceller från mus 7. Dessutom har denna metod har använts för odling iPS-härledda embryoidkroppar framställda med användning av ett annat protokoll involverar retinsyra och purmorphamine 15 insida 3D fibrin ställningar, som visar mångsidigheten hos detta odlingssystem.
Figur 1. Schematiskt bild som visar en sidovy av en individuell brunn innehållande en 3D fibrin byggnadsställning ympades med en embryoidkroppar kropp.
Figur 2. Mus inducerad pluripotenta stamceller (IPS) cellodling och differentiering. Att skilja mellan dessa celler till neural fenotyper är iPS-celler odlades i suspension för att producera aggregat av celler som kallas embryoidkroppar (EBS). Dessa EB behandlas sedan med retinsyra att inducera neural differentiering och detta protokoll har tidigare används för att inducera neural differentiering av embryonala stamceller. A) odifferentierad mus iPS-cell koloni odlad på en mus embryonala fibroblaster matarskikt. B) embryoidkroppar härledda från mus iPS-celler i suspensionskultur taget på dag 8 efter behandling med retinoinsyra för att inducera neural differentiering. Skalstrecket är 100 pm.
Figur 3. Exempel resultat av en mus iPS embryoidkroppar kroppen efter 3 dagars odling inuti en 3D fibrin byggnadsställning. Celler har börjat migrera och differentiera insidan av fibrin ställningen. Skala bar är 500 nm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskrivs ovan tillhandahåller ett förfarande för att generera 3D fibrin ställningar för pluripotenta stamceller kultur, särskilt för mus embryonala och inducerade pluripotenta stamceller. Denna 3D biomaterialet baserade odlingssystem mer exakt efterliknar nisch stamcell återfinnes in vivo och som ett resultat av detta kan den användas för att screena biologiska signaler för att bestämma deras effekter på stamceller differentiering 6. Våra observationer har visat att dessa ställningar när de sås med stamceller som härrör cellen embryoidkroppar kvar under 2 veckor in vitro innan den blir helt nedbrutna. För att ytterligare öka stabiliteten i dessa ställningar kan aprotinin (en proteashämmare) kan användas för att bromsa nedbrytning genom tillägg till de cellkulturmedia. 7,16 Dessa ställningar har också använts med framgång för neurala tillämpningar vävnadsteknik, särskilt i generationen av vävnad liknande det som hittas i det centrala nervsystemet 17. Medan andra grOUPS har kombinerat iPS-celler med fibrinlim för behandling av ischemisk stroke 18, är detta arbete första kända rapporten att kombinera iPS celler med fibrin byggnadsställningar för neurala applikationer vävnadsteknik. Detta arbete tjänade också som en startpunkt för att kombinera en rad olika typer av stamceller med fibrin ställningar för andra tillämpningar vävnadsteknik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för NSERC Discovery bidrag 402462 "vävnadsteknisk ställningar för att styra inducerade pluripotenta beteende stamceller".
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment needed: | |||
| Analytical balance pH meter Tissue culture incubator (37°C, 5% CO2) Stir plate Spectrophotometer Sterile tissue culture hood |
|||
| Tris buffered saline (pH 7.4) (Need 4 L plus enough for dissolving fibrinogen) 50 mM calcium chloride solution Sterile conical tubes (15 or 50 mL) 35 mm Petri dishes Dialysis tubing (7,000 MW cutoff) Dialysis clips 5.0 μm syringe filters Individually wrapped sterile 0.22 μm syringe filters Syringe 24 well tissue culture plates |
|||
| Fibrinogen (human) | Calbiochem | 341578 | |
| Thrombin (human) | Sigma-Aldrich | T7009 | |
References
- Keung, A. J., Healy, K. E., Kumar, S., Schaffer, D. V. Biophysics and dynamics of natural and engineered stem cell microenvironments. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2, 49-64 (2010).
- Willerth, S. M., Sakiyama-Elbert, S. E. Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery. StemBook. , (2008).
- Lee, J., Cuddihy, M. J., Kotov, N. A. Three-dimensional cell culture matrices: state of the art. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 61-86 (2008).
- Ahmed, T. A., Dare, E. V., Hincke, M. Fibrin: a versatile scaffold for tissue engineering applications. Tissue Eng. Part B Rev. 14, 199-215 (2008).
- Breen, A., O'Brien, T., Pandit, A. Fibrin as a delivery system for therapeutic drugs and biomolecules. Tissue Eng. Part B Rev. 15, 201-214 (2009).
- Willerth, S. M., Faxel, T. E., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. The effects of soluble growth factors on embryonic stem cell differentiation inside of fibrin scaffolds. Stem Cells. 25, 2235-2244 (2007).
- Willerth, S. M., Arendas, K. J., Gottlieb, D. I., Sakiyama-Elbert, S. E. Optimization of fibrin scaffolds for differentiation of murine embryonic stem cells into neural lineage cells. Biomaterials. 27, 5990-6003 (2006).
- Gorodetsky, R. Fibrin Microbeads Loaded with Mesenchymal Cells Support Their Long-Term Survival While Sealed at Room Temperature. Tissue Eng. Part C Methods. , (2011).
- Barsotti, M. C. Fibrin acts as biomimetic niche inducing both differentiation and stem cell marker expression of early human endothelial progenitor cells. Cell Prolif. 44, 33-48 (2011).
- Park, J. S., Yang, H. N., Woo, D. G., Jeon, S. Y., Park, K. H. Chondrogenesis of human mesenchymal stem cells in fibrin constructs evaluated in vitro and in nude mouse and rabbit defects models. Biomaterials. 32, 1495-1507 (2011).
- Mooney, R., Tawil, B., Mahoney, M. Specific fibrinogen and thrombin concentrations promote neuronal rather than glial growth when primary neural cells are seeded within plasma-derived fibrin gels. Tissue Eng. Part A. 16, 1607-1619 (2010).
- Liu, H., Collins, S. F., Suggs, L. J. Three-dimensional culture for expansion and differentiation of mouse embryonic stem cells. Biomaterials. 27, 6004-6014 (2006).
- Dellenback, R. J., Chien, S. The extinction coefficient of fibrinogen from man, dog, elephant, sheep, and goat at 280 mmu. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 134, 353-355 (1970).
- Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).
- Li, X. J. Directed differentiation of ventral spinal progenitors and motor neurons from human embryonic stem cells by small molecules. Stem Cells. 26, 886-893 (2008).
- Lorentz, K. M., Kontos, S., Frey, P., Hubbell, J. A. Engineered aprotinin for improved stability of fibrin biomaterials. Biomaterials. 32, 430-438 (2011).
- Willerth, S. M., Rader, A., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of controlled growth factor delivery on embryonic stem cell differentiation inside fibrin scaffolds. Stem Cell Res. 1, 205-218 (2008).
- Chen, S. J. Functional improvement of focal cerebral ischemia injury by subdural transplantation of induced pluripotent stem cells with fibrin glue. Stem Cells Dev. 19, 1757-1767 (2010).
