הערכת שינויים מטבוליים כבדית במהלך להתיישבות מתקדמת של עכבר נבט בחינם על ידי ¹ H NMR ספקטרוסקופיה

Summary

הליך קולוניזציה פרוגרסיבי מתואר להמשיך להעריך את השפעתה על מטבוליזם בכבד המארח. ההתיישבות מנוטר הלא פולשני על ידי הערכת הפרשת השתן של חיידקים שיתוף מטבוליטים על ידי אפיון NMR מבוססי המטבולית בזמן חילוף החומרים בכבד נבחנת על ידי Magic רזולוציה גבוהה זווית ספינינג (MAS HR) פרופיל התמ"ג של ביופסיה ללא פגע.

Abstract

זה ידוע היטב כי חיידקי מעיים לתרום באופן משמעותי הומאוסטזיס המארח, מתן מגוון של הטבות כגון ההגנה החיסונית וסינתזה ויטמין. הם גם מספקים את המארחת עם כמות רבה של חומרים מזינים, מה שהופך את המערכת האקולוגית איבר מטבוליים חיוניים. בהקשר של ראיות הגוברת של הקשר בין צמחיית המעיים ואת תסמונת מטבולית, הבנת האינטראקציה בין מטבולית המארח החיידקים במעיים שלו הופכת לאתגר החשוב של הביולוגיה המודרנית. ^1-4

להתיישבות (המכונה גם תהליך נורמליזציה) מייעדת את הקמתה של מיקרו אורגניזמים חיה נבט ללא לשעבר. אמנם תהליך טבעי המתרחש בלידה, הוא משמש גם נבט ללא בעלי חיים בוגרים כדי לשלוט על המערכת האקולוגית פרחים במעיים ובהמשך לקבוע את השפעתה על מטבוליזם המארח. הליך נפוץ לשלוט בתהליך הקולוניזציה היא להשתמש בשיטה gavage עם singlדואר או תערובת של מיקרו אורגניזמים. התוצאה היא שיטה קולוניזציה מהירה מאוד ומציג את החיסרון של להיות מלחיץ מאוד ^5. לכן כדאי לצמצם את הלחץ כדי להשיג תהליך הקולוניזציה איטי לצפות בהדרגה את ההשפעה של הקמת חיידקי על המטבוליזם המארח.

בכתב היד הזה, אנו מתארים הליך להעריך את השינוי של חילוף החומרים בכבד במהלך תהליך הקולוניזציה הדרגתי באמצעות שאינו הרסני פרופיל טכניקה מטבולית. אנו מציעים לעקוב קולוניזציה של חיידקים במעי על ידי בחינה של פעילות מטבולית של חיידקים במעיים לידי ביטוי בהפרשת השתן של חיידקים שיתוף מטבוליטים על ידי פרופיל מטבולי ¹ H NMR מבוססות. זה מאפשר הערכה של היציבות של פעילות חיידקים במעיים מעבר להקמת יציב של המערכת האקולוגית של חיידקים במעיים העריכו בדרך כלל על ידי חיידקים בצואה על ידי ניטור DGGE (denaturing ג'ל אלקטרופורזה שיפוע). ⁶קולוניזציה מתרחשת בסביבה פתוחה קונבנציונאלי הוא שיזם החול מלוכלך מלוכלך על ידי בעלי חיים רגילים, אשר תשמש שולטת. מכרסמים להיות חיות coprophagous, זה מבטיח קולוניזציה הומוגנית כפי שתואר לעיל. ⁷

פרופיל מטבולי כבדית נמדדת ישירות באמצעות ביופסיה בכבד שלם ¹ H ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג NMR ספקטרוסקופיה. טכניקה זו וכמותיות מציע דרך מהירה להעריך, מבלי לפגוע במבנה התא, מטבוליטים גדולות כמו טריגליצרידים, גלוקוז גליקוגן כדי לקדם להעריך את יחסי הגומלין המורכבים בין תהליך הקולוניזציה ואת חילוף החומרים בכבד ^7-10. שיטה זו יכולה לחול גם על כל רקמה ביופסיה ^11,12.

Protocol

1. להתיישבות של חיידקים ללא חיות איסוף דגימה

1. הסר נבט ללא חיות המבודדים והבית אותם בחדר בעלי קונבנציונאלי בכלובים מצויד במסנן מול החיות הקונבנציונלית אשר תשמש שולטת (איור 1).
2. Half מערבבים בחבורה (3 ימים) שנלקחו הכלוב הסכמי שליטה עם פסולת של חיידקים ללא בעלי חיים. שמור תמיד את 1 / 3 של פסולת המקובלת מלוכלך בכל פעם יש צורך לחדש אותו על מנת לשמור על רמה של חיידקים (לשמור את זה לפחות 3 ימים).
3. איסוף שתן ב microtube 1.5 מ"ל על ידי טיפול העכבר מעל הצינור ולעזור השתנה על ידי מעסים בעדינות את המעי. Snap-להקפיא מיד חנקן נוזלי. חנות לפחות -40 ° C עד לניתוח NMR. נפח מינימלי של 20 μL נדרש לרכישת עם בדיקה NMR 5 מ"מ, אך מומלץ להשתמש 30 μL כדי לשפר את איכות פרופיל מטבולי.
4. בעלי חיים צריכים bדואר מורדמים מבלי להשתמש בשום חומר הרדמה כדי למנוע בלבול NMR תהודה בשל חילוף החומרים בכבד של תרכובות הרדמה (לדוגמה, להשתמש נקע בצוואר הרחם בעקבות אישור למוות על ידי exsanguination)

2. המלצה אוסף של ביופסיה של הכבד

1. אין להשתמש בכל מוצר המכיל אלכוהול כדי למנוע זיהום. לשטוף כלים רק באמצעות פתרון מים או תמיסת מלח.
2. אין לנקב כיס המרה. במקרה של דליפת מרה, לשטוף את הרקמה מיד עם מים או תמיסת מלח.
3. איסוף ביופסיות כבד (כ 15-50 מ"ג) מהאונה השמאלית כפי שמוצג באיור 2. עבור ביופסיות לשחזור, לאסוף בעקביות במרכז האונה השמאלית הימנעות בפריפריה שבו הרקמה הוא דק יותר.
4. הצמד ביופסיות הקפאה בחנקן נוזלי באופן מיידי ולאחסן אותם ב -80 ° C עד לניתוח NMR.

3. ¹ H NMR רכישת שתן microvolume

הכן 0.2M נתרן פוספט חיץ פתרון D2O (99.8%), המכיל pH 7.4 1 mM 3 - (trimethylsilyl) חומצה d propionic ₄ (כפית).

מערבבים 30 μL של שתן עם 30 μL של חיץ פוספט נתרן.

העברת 50 μL של פתרון מעורב לתוך צינור 1.7 מ"מ NMR נימי (איור 3 (2)) באמצעות מזרק 50 זכוכית μL מצויד מחט מתכת (OD 0.5 מ"מ). היזהר, כדי למנוע בועות.

התאם את מתאם נימי (איור 3 (3)) על גבי דגימת שתן נימי המכיל ומקום אותו לתוך microtube NMR 2.5 מ"מ ל 5 מ"מ NMR בדיקה (איור 3 (1)). השתמש שילוב של צינורות כמו צינור 5 מ"מ קבוע NMR לרכישת ספקטרלי.

השתמש מוט החילוץ (איור 3 (4)) כדי להסיר נימי מהצינור NMR 2.5 מ"מ על ידי הברגה מתאם נימי בעדינות למשוך אותו החוצה.

. 4 ¹ H HR MAS התמ"ג של רקמת הכבד ביופסיה: הכנת המדגם

1. MAS רכיבי הרוטור כליםהמתואר באיור 4.
2. הכנס ביופסיה (כ 15-50 מ"ג) לתוך הרוטור זירקוניום (איור 4 (1)) ולמלא את שאר הנפח עם טהור D ₂ O עבור NMR לנעול. תיזהר לא לעשות שום בועות כי זה היה לשנות את איכות shimming איכות עתידיים של רכישת נתונים.
3. הוספת 50 μL spacer טפלון (איור 4 (2)) באמצעות בורג גלילי (איור 4 (5)). הברג החוצה את זה לכייל אותו באמצעות מד עומק בצד קצר (איור 4 (8)). בשלב זה, חשוב לשים לב ספציפית המדגם כי חלק זה יכול לדלוף דרך החור spacer. אם זהו המקרה, אז חלק ביופסיה נהרס ומשקל המדגם הוא כבר לא אמין. זהו אפוא צורך להתחיל שוב מההתחלה הכנת המדגם.
4. מניחים את הסיכה THEAD (איור 4 (3)) ו בורג אותו בעדינות עם מברג (איור 4 (6)). יבש את כל שאריות המים עם פיסת רקמה.
5. הנח את מכסה (איור 4 (4)) בביתהעליון של הרוטור ואת הכנס אותו פקר הרוטור (איור 4 (6)). לחץ בחוזקה עד הפקק נמצא במקום. לא צריך להיות שום חלל השמאלי בין הרוטור ואת הכובע שלה.
6. מרק חצי התחתון של הרוטור באמצעות עט סימון שחור כדי לאפשר זיהוי אופטי שיעור ספין.
7. מניחים את הרוטור בתוך ספקטרומטר התמ"ג ולהתחיל להסתובב בבית kHz 5. רוכשת ¹ H ספקטרום NMR באמצעות CPMG רצף דופק ¹³ על פי הנחיות היצרן.
8. השתמש תהודה α גלוקוז anomeric עמודים לדקה 5.22 (כפיל) כדי לכייל ספקטרום NMR.
9. כדי לפרוק את הרוטור, המשך על ידי הסרת מכסה באמצעות מסיר כובע (איור 4 (9)). הברג החוצה THEAD סיכה ולהסיר spacer טפלון באמצעות בורג גלילי. שטפו ביסודיות בעזרת מים וחומרי ניקוי.

5. נציג תוצאות

חיידקים פעילות גוט ניתן לנטר באמצעות פרופיל מטבולי השתן. מספר רב של חיידקים בדרכי השתןשיתוף מטבוליטים לזיהוי על ידי ¹ H NMR תוארו בספרות ^7,14-17. אלה חיידקים שיתוף מטבוליטים הם יעילים במיוחד כדי לפקח על תהליך קולוניזציה כפי שהם מספקים דרך מהירה פולשנית להעריך מתי את המערכת האקולוגית שהוקם יציב. איור 5 א ממחישה היטב את המראה של חיידקים במעיים שיתוף מטבוליטים על תהליך הקולוניזציה. נתון זה מראה על פרופיל מטבולי השתן שהתקבלו על ידי ביצוע ההליך המתואר בשלב 2 של חיה יישבו 20 ימים באמצעות ההליך המתואר בשלב 1. בעל חיים זה לא להפריש כל סולפט indoxyl כמויות קטנות מאוד של phenylacetylglycine (PAG) ו-p-cresol סולפט במצב נבט חינם (יום 0-כחול). כמו קולוניזציה מתקדמת, אלה 3 סמנים של מטבוליזם החלבון על ידי החיידקים במעיים להגדיל במידה ניכרת להגיע לשיווי משקל בכל יום 20 (אדום). זה קל במיוחד כדי לפקח על קבוצה של בעלי חיים כפי שמודגם באיור על 5B באמצעות PAGתהודה. תרשים זה הושג על ידי שילוב של האזור תחת תהודות מודגשת אפור איור 5A (δ 7.40-7.43), המקביל ל תהודה מסוימת (שלישיה) של PAG לקבוצה של 7 חיות.

¹ H ברזולוציה גבוהה קסם זווית ספינינג (MAS HR) NMR ספקטרוסקופיה היא טכניקה הרסנית שאינה המאפשר רכישות מהיר לשעתקו פרופילים המטבולית של כל סוג של ביופסיה ^18. בפרוטוקול זה, השתמשנו בטכניקה זו עוצמה כדי להשיג מטבולית הכבד פרופיל של עכברים לפני 2 (כחול) ואחרי קולוניזציה (אדום) (איור 6). נתון זה ממחיש היטב את המידע שניתן להפיק מן MAS NMR מבוססי פרופיל מטבולי. חומצות אמינו רבות, כמו גם מטבוליטים שמקורם במטבוליזם אנרגטי כגון לקטט גלוקוז, גליקוגן, טריגליצרידים, (D)-3-hydroxybutyrate ו nicotinurate ניתן דמיינו. פרופילים אלה גם מכילים מידע רלוונטי סטרס חמצוני (כלומר אסקורביתהבולשת, גלוטתיון), מטבוליזם נוקלאוטידים (כלומר inosine, uridine) וחילוף החומרים methylamine (כלומר, כולין, Trimethylamine-N-אוקסיד). בדוגמה זו, ברור מאוד כי נבט ללא עכבר מציגה כמעט שום גליקוגן כמויות נמוכות מאוד של גלוקוז וטריגליצרידים כפי שפורסם בעבר ^7.

באיור 1. סקירה כללית של פרוטוקול קולוניזציה. בעלי חיים נבט ללא וקונבנציונלית הם שוכנו בכלובים מצויד צד מסננים על ידי צד הגורים שלהם הם החליפו לאפשר קולוניזציה פרוגרסיבי מן החיידקים במעיים קונבנציונאלי (1). חיידקים פעילות גוט מנוטר באמצעות פרופיל מטבולי ¹ H NMR מבוסס (2-3). מטבוליזם הכבד מוערך על ידי ¹ MAS H HR NMR מבוססי פרופיל מטבולי (4-5).

2. איור עכבר חיr אנטומיה. הכבד הוא מוצג כמו הצד השטוח של איבר בפניהם את השולחן. עבור ביופסיות לשחזור, מומלץ תמיד לאסוף דגימות ממרכז לאונה השמאלית כפי שצוין על ידי מלבן מקווקו.

איור 3 1.7 מ"מ NMR ערכת נימי לעבוד עם microvolumes מפתח:.. 1: 2.5 מ"מ NMR microtube, 2: 1.7 מ"מ NMR צינור נימי, 3: מתאם נימי, 4: מוט Extraction.

. MAS איור 4 ציוד הרוטור מפתח: 1.: הרוטור MAS, 2: 50 μL spacer טפלון, 3: THEAD סיכה, 4: כובע, 5: בורג גלילי, 6: מברג, 7: הרוטור פקר, 8: מד עומק.

איור 5. האבולוציה של פרופילים מטבולית השתן במהלך colonizatioהערה

1. זום על האזור ארומטי של הספקטרום בין 6.8-7.8 ppm שבו חיידקים שיתוף מטבוליטים ניתן דמיינו. ¹ H NMR ספקטרה נגזרו על אדם אחד ביום 0 (כחול), 4 (ירוק), 15 (כתום) 20 (אדום) שלאחר קולוניזציה. אזור אפור מתאים באזור זה היה משולב כדי להפוך את התרשים ב B. מפתח: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; Indoxyl-S: סולפט Indoxyl;:; שלו p-Cresol-S היסטידין: סולפט p-Cresol, PAG : Phenylacetylglycine.
2. PAG ריכוז ממוצע במהלך הקולוניזציה (n = 7). של סטודנטים מבחן t שימש להשוות את ההבדל בריכוז PAG בזמן נקודות שונות: a: p <0.05 לעומת יום 0: b: p <0.01 בהשוואה ל 10 יום.

איור 6. אופיינית 600 MHz ¹ H HR MAS ספקטרום NMR של ביופסיות כבד נגזר נבט חופשי (כחול) לשעבר נבט חינם (מחדשד) בעכברים. פרוטונים מודגש אחראים התהודה הטריגליצרידים מפתח:. 3-HB: 3-hydroxybutyrate, GSH: גלוטתיון מופחתת, TGS: טריגליצרידים, TMAO: Trimethylamine-N-אוקסיד.

Discussion

בפרוטוקול זה, תיארנו תהליך הקולוניזציה פרוגרסיבי בסביבה פתוחה להמשיך לחקור את ההשפעה של החיידקים במעיים על מטבוליזם בכבד על ידי העריכו ¹ פרופיל H MAS NMR HR של ביופסיה ללא פגע. שיטות שונות של קולוניזציה תוארו בספרות. השיטות הנפוצות ביותר ליישב חיות עם החיידקים מוגדר הם gavage אוראלי או שתיית מים מזוהמים ^19,20. חיסון צואה יכול לשמש גם כפי שתואר לעיל ^21. השיטה המוצגת כאן קולוניזציה נגזרת שיטת "נורמליזציה" של בעלי חיים נבט ללא שתואר על ידי קופמן JP et al. בשנת 1986 ^22. בפרסום זה, המחברים להציב חיה חיים רגילים לתוך המבודד בין נבט ללא בעלי חיים. עם זאת, לא תמיד אפשר לשמור על בעלי החיים המבודדים, במיוחד אם הם צריכים לטפל במהלך תהליך הקולוניזציה (זה קשה במיוחד אם מדגם Collection נדרש). כחלופה לכך, ובכך לבית לשעבר נבט ללא בעלי חיים בסביבה פתוחה קונבנציונאלי בנוכחות של פסולת מלוכלכים על ידי חיות קונבנציונלית אשר ישמש שולטת. בדרך זו, מניפולציה בעלי חיים לצורך קולוניזציה הוא מינימלי זה תוצאות מתח נמוך לעומת gavage הפה. שיטה זו גם מאפשרת קולוניזציה מתקדמת של המעי אשר קרוב תהליך הקולוניזציה הטבעית מציעה קולוניזציה הומוגנית של בעלי חיים בכלוב שיתוף זהה שמפגינים הערכה (Denaturing ג'ל אלקטרופורזה Gradient) DGGE של פרופילי DNA של חיידקים (זמין כחומר משלים ב קלאוס et al. ^7).

מעקב אחר תהליך הקולוניזציה על ידי פרופיל מטבולי השתן היא לא פולשנית, דרך קלה, מהירה ויעילה לגילוי כאשר פעילות חיידקית הופך יציב. כאשר אין צורך לתמרן בעלי חיים מדי יום למטרה זו, כפי שמוצג באיור 5 ב, רמת המתח נשמרת בביתהמינימום שלה. ראוי לציין להזכיר כי גם אם הוא קולוניזציה שיזם פסולת מזוהמת על ידי בעלי השליטה קונבנציונאלי, זה הכרחי כדי לשמור על מספר שווה של אותם בעלי חיים אשר יאפשר לשלוט אחד להעריך את ההשפעות של מעורבות מתח ההזדקנות על חילוף החומרים בכבד. טכניקות אחרות על בסיס ספקטרומטריית מסה (MS) כגון GC-MS (גז כרומטוגרפיה) או LC-MS (כרומטוגרפיה נוזלית) יכול לשמש גם כדי לקבוע חיידקים בדרכי השתן שיתוף מטבוליטים כמו גם לקבל פרופיל מטבולי של דגימות נוזל (כלומר שתן, פלזמה, תמציות רקמה), אבל הם לא יכולים להיות מיושמים על רקמת ביופסיה ללא פגע. GC-MS כבר מיושם בהצלחה ניתוח ממוקד של יציבות חומצות שומן נדיפות ^23. טכניקה זו דורשת צעד derivatization אשר מציגה הטיות שיש לשקול בזהירות במהלך ניתוח נתונים ^24. LC-MS יכול להיות שימושי במיוחד כדי לשפר את הזיהוי של חיידקים שיתוף מטבוליטים אפיון ממוקד ^25. למרותלא ממוקדות LC-MS פרופיל מטבולי משמעותי משפר את רגישות הזיהוי של מטבוליטים ריכוז נמוכה, זיהוי יכול להיות קשה ומספר רב של מטבוליטים שזוהו עשויים להישאר ²⁶ לא מסומנים. לכן, רוב המחקרים metabonomic ממוקדות בוצעו באמצעות חד ממדיות ¹ H NMR מבוססי פלטפורמות. דיון מעניין של שיטות אנליטיות שונות זמין למטרות פרופיל מטבולי פורסמו לאחרונה על ידי Ryan et al. ^27.

מטבוליזם בכבד הוערכה על ידי הלא הרסני ¹ H HR MAS NMR ספקטרוסקופיה. שיטה זו נבחרה משום שהיא אינה מחייבת צעד מיצוי שהורס את הרקמה והתוצאות של חמצון תרכובות תגובתי כגון גלוטתיון. ¹ H NMR מבוססי פרופיל מטבולי מציג גם את היתרון של המציע פרופיל מטבולי ממוקדות של הביופסיה. בכך היא מאפשרת תצפית במגוון גדולמטבוליטים של חומצה כיסוי אנרגטי, אמינו, מסלולים מתח נוקלאוטיד, methylamine ו חמצוני בנושא. המגבלה היחידה היא מגבלת של זיהוי אשר משתנה על פי המבנה המולקולרי של התרכובת. אכן, להגביל את גילוי נקבע על ידי חומר כימי (כלומר מטבוליט) ריכוז, כמו גם את מספר הפרוטונים נותן את השיא תהודה ועל הסביבה הכימית שלהם. זיהוי תהודות המטבוליט יכול גם להיות קשה מבוסס על ¹ ספקטרום HR-H NMR MAS לבד ולכן מומלץ לבצע כמה ניסויים מיותרים NMR 2D לאשר הקצאות (כלומר J-נפתרה, חמים, TOCSY, HSQC, HMBC ניסויים ^{28-30) 31,32. 1} זה ה HR MAS טכניקת NMR הוא נפוץ ללימודי metabonomic, ובמקרה השימוש סטטיסטיקה משתנים (המכונה גם הכרה בשיטות דפוס) הוא הכרחי ^{33. 1} H NMR מבוססי פרופיל מטבולי השיטות המתוארות פרוטוקול זה יושמו בהרחבה ביו שוניםתנאים לוגיים אינם מוגבלים ניתוח של דגימות שתן כבד ^34-36. כללי הכנת המדגם פרוטוקולים NMR מבוססי metabonomics נבדקו על ידי Beckonert et al. ^18,37.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913