Valutare alterazioni metaboliche epatiche durante la colonizzazione progressiva di Germe senza mouse da ¹ H spettroscopia NMR

Summary

Una procedura di progressiva colonizzazione è descritto per valutare ulteriormente il suo impatto sul metabolismo epatico ospitante. La colonizzazione è monitorato non invasivo, valutando l'escrezione urinaria di co-metaboliti microbici da NMR basati su profili metabolici, mentre il metabolismo epatico viene valutata ad alta risoluzione Angle Spinning Magic (MAS HR) profilazione NMR di intatto biopsia.

Abstract

E 'noto che i batteri intestinali contribuiscono significativamente alla omeostasi host, fornendo una serie di benefici come la protezione immunitaria e la sintesi della vitamina. Essi hanno inoltre fornire l'host con una notevole quantità di sostanze nutritive, facendo di questo ecosistema un organo metabolico essenziale. Nel contesto di una crescente evidenza del legame tra la flora intestinale e la sindrome metabolica, comprendere l'interazione metabolica tra l'host e la sua flora intestinale sta diventando una sfida importante della biologia moderna. ^1-4

Colonizzazione (noto anche come processo di normalizzazione), designa la creazione di micro-organismi in un antico animale privo di germi. Mentre è un processo naturale che si verificano al momento della nascita, è utilizzato anche in adulti privo di germi animali per controllare l'ecosistema intestinale floreali e ulteriormente determinare il suo impatto sul metabolismo host. Una procedura comune per controllare il processo di colonizzazione è quello di utilizzare il metodo gavage con un singlE o una miscela di microrganismi. Questo metodo comporta una colonizzazione molto veloce e presenta lo svantaggio di essere estremamente stressante ^5. E 'quindi utile per ridurre al minimo lo stress e per ottenere un processo di colonizzazione lento ad osservare gradualmente l'impatto di stabilimento sul metabolismo batterico ospite.

In questo manoscritto, si descrive una procedura per valutare la modifica del metabolismo epatico durante un processo di colonizzazione graduale utilizzando una tecnica non distruttiva profili metabolici. Noi proponiamo di monitorare la colonizzazione microbica intestinale, mediante la valutazione dell'attività microbica intestinale metabolica riflette l'escrezione urinaria di metaboliti microbici co-profilatura di ¹ H NMR basati metabolica. Questo consente un apprezzamento della stabilità dell'attività microbica intestinale al di là della sede stabile l'ecosistema microbico intestinale solitamente valutata attraverso il monitoraggio dei batteri fecali da DGGE (gel elettroforesi denaturante gradiente). ⁶ Ilcolonizzazione si svolge in un ambiente convenzionale aperta ed è iniziata da una cucciolata sporca sporca da animali convenzionali, che servirà come controlli. Roditori sono animali coprofagi, questo garantisce una colonizzazione omogenea come descritto in precedenza ^7.

Profiling metabolico epatico viene misurato direttamente da una biopsia del fegato intatto con ¹ H ad alta risoluzione Magic Angle Spinning spettroscopia NMR. Questo semi-quantitativa tecnica offre un modo rapido per valutare, senza danneggiare la struttura delle cellule, i metaboliti importanti come trigliceridi, glucosio e glicogeno al fine di ulteriormente valutare la complessa interazione tra il processo di colonizzazione e il metabolismo epatico ^7-10. Questo metodo può essere applicato a qualsiasi tessuto bioptico ^11,12.

Protocol

1. Colonizzazione di germi senza animali e la raccolta dei campioni

1. Rimuovere sterile animali da isolatori e la casa in una stanza di allevamento in gabbie tradizionali dotati di filtro davanti alla animali convenzionali, che servirà come controlli (Figura 1).
2. Mescolare mezzo della cucciolata (3 giorni) preso dalla gabbia di controllo convenzionale con la lettiera del germe senza animali. Tenere sempre 1 / 3 della lettiera sporca convenzionale ogni volta che è necessario rinnovarlo al fine di mantenere un livello di batteri (tenerlo almeno per 3 giorni).
3. Raccogliere l'urina in un microtubo 1,5 ml gestendo il mouse sopra il tubo e aiutare minzione da massaggiare delicatamente l'intestino. Snap-congelare immediatamente in azoto liquido. Memorizzare almeno a -40 ° C fino al momento dell'analisi NMR. Un volume minimo di 20 l è necessario per l'acquisizione con una sonda NMR 5 millimetri, ma si consiglia di utilizzare 30 microlitri per migliorare la qualità dei profili metabolici.
4. Gli animali devono be l'eutanasia, senza uso di anestetico per evitare risonanze NMR confusione a causa del metabolismo epatico di composti anestetici (per esempio, utilizzare dislocazione cervicale seguito da conferma della morte per dissanguamento)

2. Raccomandazione per la raccolta della biopsia epatica

1. Non utilizzare alcun prodotto contenente alcol per evitare la contaminazione. Lavare gli attrezzi con acqua o soluzione salina.
2. Non perforare cistifellea. In caso di perdita di bile, lavare tessuto immediatamente con acqua o soluzione salina.
3. Raccogliere biopsie epatiche (circa 15-50 mg) dal lobo sinistro come mostrato nella Figura 2. Per le biopsie riproducibile, raccogliere costantemente al centro del lobo sinistro evitando le zone periferiche dove il tessuto è più sottile.
4. Snap biopsie congelare in azoto liquido immediatamente e conservarli a -80 ° C fino al momento dell'analisi NMR.

3. Acquisizione ¹ H NMR di urina microvolumi

Preparare una soluzione di sodio fosfato 0,2 M tampone in D2O (99,8%), pH 7,4 contenente 1 mM 3 - (trimetilsilil) propionico-d ₄ (TSP).

Mescolare 30 ml di urina con 30 ml di tampone fosfato di sodio.

Trasferire 50 ml di soluzione mista in tubo di 1,7 millimetri NMR capillare (Figura 3 (2)) usando una siringa da 50 microlitri di vetro dotato di un ago di metallo (diametro 0,5 mm). Attenzione ad evitare le bolle.

Montare l'adattatore capillare (Figura 3 (3)) sulla parte superiore del campione di urina contenente capillare e mettetelo in un microtubo NMR 2,5 mm per 5 millimetri sonda NMR (Figura 3 (1)). Utilizzare questa combinazione di tubi come un normale tubo NMR 5 mm per l'acquisizione spettrale.

Utilizzare l'asta di estrazione (Figura 3 (4)) per rimuovere capillare da 2,5 mm Tubo NMR avvitando l'adattatore capillare delicatamente per estrarlo.

. 4 ¹ H NMR HR MAS di tessuto biopsia epatica: la preparazione del campione

1. MAS di componenti di rotori e gli strumenti sonodescritto nella Figura 4.
2. Inserire biopsia (circa 15-50 mg) in zirconio rotore (Figura 4 (1)) e riempire il resto del volume con puro D ₂ O per NMR di blocco. Fare attenzione a non fare le bolle, perché questo altererebbe la qualità della spessoramento successive e la qualità di acquisizione dei dati.
3. Inserire 50 microlitri distanziatore in teflon (figura 4 (2)), utilizzando la vite cilindrica (figura 4 (5)). Svitare e calibrare usando il misuratore di profondità sul lato corto (figura 4 (8)). A questo punto, è importante prestare una specifica attenzione al campione perché una parte di esso può fuoriuscire attraverso il foro distanziatore. Se questo è il caso, allora parte della biopsia viene distrutta e il peso del campione non è più affidabile. E 'quindi necessario ricominciare dall'inizio la preparazione del campione.
4. Posizionare il perno thead (Figura 4 (3)) e avvitare delicatamente con il cacciavite (Figura 4 (6)). Asciugare l'acqua residua con un pezzo di tessuto.
5. Posizionare il tappo (figura 4 (4)) alsuperiore del rotore e di inserirlo nel packer rotore (Figura 4 (6)). Premere con decisione fino a quando il tappo è a posto. Non ci dovrebbe essere alcuno spazio lasciato tra il rotore e il suo tappo.
6. Segna la metà del fondo del rotore con una penna nera marker per consentire il rilevamento ottico velocità di rotazione.
7. Posizionare il rotore all'interno dello spettrometro NMR e iniziano a girare a 5 kHz. Acquisire ¹ H NMR utilizzando CPMG sequenza di impulsi ¹³ secondo le linee guida del produttore.
8. Utilizzare la risonanza glucosio anomerico α a 5,22 ppm (doppietta) per calibrare gli spettri NMR.
9. Per decomprimere il rotore, procedere togliendo il tappo utilizzando il dispositivo di rimozione tappo (figura 4 (9)). Svitare thead pin e rimuovere distanziatore in Teflon con la vite cilindrica. Lavare accuratamente con acqua e detersivo.

5. Rappresentante Risultati

Attività microbica intestinale può essere monitorato tramite il profiling metabolico urinario. Un gran numero di microrganismi urinarico-metaboliti identificabili da ¹ H NMR sono stati descritti in letteratura ^7,14-17. Questi co-metaboliti microbici sono particolarmente utili per monitorare il processo di colonizzazione in quanto forniscono un modo rapido e non invasivo per valutare quando l'ecosistema di nuova costituzione è stabile. 5A figura illustra chiaramente l'aspetto del microbica intestinale co-metaboliti sul processo di colonizzazione. Questa figura mostra un profilo metabolico urinario ottenute seguendo la procedura descritta al punto 2 per un animale colonizzata 20 giorni utilizzando procedura descritta al punto 1. Questo animale non espellere qualsiasi solfato indossile e quantità molto piccola di phenylacetylglycine (PAG) e p-cresolo solfato presso il germe senza stato (giorno 0-blu). Come colonizzazione avanza, questi 3 marcatori del metabolismo delle proteine ​​dalla flora intestinale aumenta notevolmente per raggiungere un equilibrio al giorno 20 (rosso). Ciò è particolarmente facile da monitorare per un gruppo di animali, come illustrato in Figura 5B con il PAGrisonanza. Questo diagramma è stato ottenuto integrando l'area sotto le risonanze evidenziate in grigio nella Figura 5A (δ 7,40-7,43), corrispondente ad una risonanza specifica (tripletta) di PAG per un gruppo di 7 animali.

¹ H ad alta risoluzione Magia Angle Spinning (MAS HR) spettroscopia NMR è una tecnica non distruttiva che permette acquisizioni rapido e riproducibile di profili metabolici di ogni tipo di biopsia ^18. In questo protocollo, abbiamo usato questa tecnica potente per ottenere un profilo metabolico epatico di 2 topi prima (blu) e dopo (rosso) colonizzazione (Figura 6). Questa figura illustra bene le informazioni che possono essere derivati ​​da un MAS NMR basati su profilo metabolico. Numerosi aminoacidi e metaboliti derivati ​​da metabolismo energetico come il glucosio, il glicogeno, lattato, trigliceridi, (D)-3-idrossibutirrato e nicotinurate possono essere visualizzati. Questi profili contengono anche informazioni utili per lo stress ossidativo (cioè un ascorbicocid, glutatione), il metabolismo dei nucleotidi (cioè inosina, uridina) e il metabolismo metilammina (cioè colina, Trimetilammina-N-ossido). In questo esempio, è molto chiaro che la priva di germi del mouse viene visualizzata quasi glicogeno e gli importi molto bassi di glucosio e trigliceridi, come è stato precedentemente pubblicato ^7.

Figura 1. Panoramica del protocollo di colonizzazione. Animali germ-free e convenzionali sono alloggiati in gabbie dotate di filtri fianco a fianco e le loro cucciolate vengono scambiati per consentire progressiva colonizzazione dalla flora intestinale convenzionale (1). Attività microbica intestinale è controllata mediante ¹ H NMR del profilo metabolico-based (2-3). Il metabolismo epatico è valutata da ¹ H HR MAS NMR basati su profili metabolici (4-5).

Figura 2. Topo vivor anatomia. Il fegato viene visualizzato come il lato piatto dell'organo di fronte al tavolo. Per le biopsie riproducibile, si consiglia di raccogliere campioni da sempre al centro del lobo sinistro, come indicato dal rettangolo tratteggiato.

Figura 3 1.7 mm Kit NMR capillare di lavorare con microvolumi chiave:.. 1: 2,5 microtubo NMR mm, 2: 1,7 mm Tubo NMR capillare, 3: adattatore capillare, 4: asta di estrazione.

. Figura 4 MAS attrezzature rotore chiave: 1.: Rotore MAS, 2: 50 microlitri distanziatore in Teflon, 3: THEAD pin, 4: cappuccio, 5: vite cilindrica, 6: cacciavite, 7: rotore packer, 8: profondimetro.

Figura 5. Evoluzione dei profili metabolici urinari durante colonization.

1. Zoom sulla regione aromatica degli spettri tra 6,8-7,8 ppm in cui microbica co-metaboliti possono essere visualizzati. Spettri ¹ H NMR sono stati ricavati da un singolo individuo, al giorno 0 (blu), 4 (verde), 15 (arancione) e 20 (rosso) post-colonizzazione. La zona grigia corrisponde alla zona che è stata integrata per rendere il diagramma in B. chiave: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; indossile-S: solfato indossile;:; suo p-cresolo, S Istidina: solfato di p-cresolo; PAG : Phenylacetylglycine.
2. PAG concentrazione media durante la colonizzazione (n = 7). Student t-test è stato utilizzato per confrontare la differenza di concentrazione PAG a vari time-punti: a: p <rispetto al giorno 0 0.05; b: p <0,01 rispetto al giorno 10.

Figura 6. Tipiche 600 MHz ¹ H HR spettri NMR MAS di biopsie epatiche derivate da privo di germi (blu) ed ex-priva di germi (rid) i topi. Protoni in grassetto sono responsabili per la risonanza trigliceridi chiave:. 3-MP: 3-idrossibutirrato, GSH: glutatione ridotto, TG: trigliceridi, TMAO: Trimetilammina-N-ossido.

Discussion

In questo protocollo, abbiamo descritto una procedura di progressiva colonizzazione in un ambiente aperto di approfondire l'impatto della flora intestinale sul metabolismo epatico valutate di ¹ profiling H NMR HR MAS di intatto biopsia. Vari metodi di colonizzazione sono state descritte in letteratura. I metodi più comuni per colonizzare gli animali con un microbiota definiti sono sonda gastrica o l'acqua potabile contaminata ^19,20. Inoculazione fecale può essere utilizzato anche come descritto in precedenza ^21. Il metodo di colonizzazione presentato qui è derivato da un metodo di "normalizzazione" degli animali germ-free descritto da Koopman JP et al. nel 1986 ^22. In questa pubblicazione, gli autori hanno messo un animale vivente convenzionale nel isolatore tra il germe senza animali. Tuttavia, non è sempre possibile mantenere gli animali in isolatori, soprattutto se hanno bisogno di essere manipolato durante il processo di colonizzazione (questo è particolarmente difficile se campione collection è richiesto). In alternativa è quindi quella di casa ex-privo di germi animali in un ambiente convenzionale aperto in presenza di rifiuti contaminati da animali convenzionali che saranno utilizzati come controlli. In questo modo, la manipolazione degli animali a scopo di colonizzazione è minimo e questo si traduce in minore sforzo rispetto alla sonda gastrica. Questo metodo permette anche una progressiva colonizzazione dell'intestino che è più vicino ad un processo di colonizzazione naturale e offre una colonizzazione omogenea di animali condividono la stessa gabbia, come dimostrato da DGGE (elettroforesi su gel denaturante Gradient) valutazione dei profili di DNA microbico (disponibile come materiale supplementare in Natale et al. ^7).

Il monitoraggio del processo di colonizzazione da profili metabolici urinari è un non invasivo, semplice, veloce ed efficace per rilevare quando l'attività microbica diventa stabile. Poiché non è necessario manipolare gli animali ogni giorno a tale scopo, come mostrato nella Figura 5B, il livello di stress è tenuto asuo minimo. È degno di nota ricordare che anche se la colonizzazione è iniziata da una lettiera sporca da animali di controllo convenzionale, è necessario mantenere lo stesso numero di quegli animali di controllo che permettono di stimare gli effetti misti dello stress e dell'invecchiamento sul metabolismo epatico. Altre tecniche sulla base di spettrometria di massa (MS) quali la GC-MS (gascromatografia) o LC-MS (cromatografia liquida) può anche essere usato per determinare microbiche urinarie co-metaboliti nonché di ottenere un profilo metabolico dei campioni liquidi (cioè l'urina, plasma, estratti di tessuto), ma non possono essere applicati sul tessuto bioptico intatti. GC-MS è stata applicata con successo per l'analisi mirata di stabili acidi grassi volatili ^23. Questa tecnica richiede un passo derivatizzazione che introduce distorsioni che devono essere attentamente presi in considerazione durante l'analisi dei dati ^24. LC-MS può essere particolarmente utile per migliorare l'individuazione di metaboliti microbici co-in profilazione mirata ^25. Sebbenenon mirati LC-MS profiling metabolico migliora notevolmente la sensibilità di rilevazione di metaboliti a bassa concentrazione, l'identificazione può essere difficile e un gran numero di metaboliti rilevati possono rimanere non assegnate ^26. Pertanto, la maggior parte degli studi non mirati metabonomic sono state effettuate utilizzando una dimensione ¹ H NMR basati su piattaforme. Una interessante discussione dei vari metodi analitici a disposizione a fini di profilazione metabolica è stato recentemente pubblicato da Ryan et al. ^27.

Metabolismo epatico è stata valutata da non distruttivo ¹ H HR MAS spettroscopia NMR. Questo metodo è stato scelto perché non richiede una fase di estrazione che distrugge il tessuto e determina l'ossidazione dei composti altamente reattivi come il glutatione. ¹ H NMR basati su profili metabolici presenta anche il vantaggio di offrire un profilo non mirati metabolico della biopsia. Permette quindi l'osservazione di una vasta gammametaboliti di copertura energetica, aminoacidi, i percorsi di stress nucleotide, metilammina e ossidativo correlati. L'unica restrizione è il limite di rilevazione che varia a seconda della struttura molecolare di un composto. Infatti, il limite di rilevazione è determinato dalla chimica (cioè metabolita) concentrazione così come il numero di protoni dando al picco di risonanza e il loro ambiente chimico. Identificazione di risonanze metabolita può anche essere difficile sulla base di ¹ H HR spettri MAS NMR sola ed è quindi consigliato di eseguire alcuni esperimenti NMR 2D in più per confermare le assegnazioni (ad esempio J-risolto, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC esperimenti ^{28-30) 31,32.} Questa H ¹ HR MAS NMR tecnica viene comunemente utilizzato per gli studi metabonomic, nel qual caso l'uso della statistica multivariata (chiamati anche metodi di pattern recognition) è necessario ^33. L'H ¹ NMR basati su metodi di profiling metabolico descritto in questo protocollo sono stati ampiamente applicati a vari biocondizioni logiche e non si limitano all'analisi dei campioni di urina e fegato ^34-36. Generale i protocolli di preparazione del campione per NMR basati metabonomica sono stati esaminati dagli Beckonert et al. ^18,37.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913