在无菌无鼠标进定植评估肝代谢的变化 ¹ H核磁共振光谱

Summary

一个渐进的殖民化过程进行了介绍，以进一步评估其主机上的肝脏代谢的影响。定植被监视的非侵入性的，而基于核磁共振的代谢分析评估微生物的代谢产物的尿中排泄肝脏代谢高分辨率魔角旋转（人力资源的MAS）核磁共振完好活检的分析评估。

Abstract

这是众所周知的，肠道细菌有助于显著主机的动态平衡，提供一系列的好处，如免疫保护和维生素的合成。他们还提供主机与大量的营养物质，使这个生态系统的一个重要的代谢器官。在肠道菌群和代谢综合征之间的联系的理解之间的主机和其肠道菌群的代谢相互作用，越来越多的证据的范围内正在成为现代生物学^的一个重要挑战。1-4

定植（也称为正常化的进程）指定建立在前者的无菌动物的微生物。虽然这是一个自然的过程，在出生时发生，它也用于成人无菌动物来控制肠道花卉的生态系统，并进一步确定其主机上的代谢的影响。控制殖民化进程的一个普通的程序是使用SINGL灌胃方法E或微生物的混合物。这种方法的结果，并提出在一个非常快的殖民统治的^极端压力5的缺点。因此，它是有用的，以尽量减少压力和获得殖民化进程较慢，逐步观察细菌建立在主机上的新陈代谢的影响。

在这个手稿中，我们描述了一个过程，在一个渐进的殖民过程中，使用非破坏性的代谢分析技术，以评估肝脏代谢的修改。我们建议监测评估肠道微生物的代谢活性微生物的代谢^产物 1 H核磁共振的代谢分析尿中排泄反映肠道微生物定植。这使得肠道微生物的活动超出了通常由粪便细菌DGGE（变性 ​​梯度凝胶电泳）监测评估的肠道微生物生态系统的稳定建立稳定的^升值 。6定植在传统的开放式环境，是由传统的动物，这将作为控件沾脏的垃圾发起。正在coprophagous动物的啮齿动物，这确保了同质定植如前所述。

肝代谢分析是直接从一个完整的肝活检使用高分辨率^{的1 H}魔角旋转核磁共振光谱测量。这半定量的技术提供一个快速的方法进行评估，不破坏细胞结构，如甘油三酯，葡萄糖和糖原的主要代谢产物，以进一步估计殖民化进程和肝脏^代谢 7-10之间复杂的相互作用。这种方法也可以适用于任何组织^活检 11,12 。

Protocol

1。定植无菌动物和样品采集

1. 从隔离和房子他们在传统畜牧业室配备带过滤器在传统的动物将作为对照组（图1）面前笼中取出无菌动物。
2. 混合垃圾的一半（3天），从常规笼无菌动物的垃圾。始终保持1 / 3脏传统的枯枝落叶每次它是必要的更新，以保持水平（至少要保持3天）的细菌。
3. 收集在1.5毫升的微管的尿液处理管鼠标，帮助轻轻按摩排便排尿。管理单元立即在液氮冻结。至少在-40 ° C储存，直到NMR分析。一个20μL体积最小的是需要一个5毫米的NMR探头的收购，但建议使用30μL，以改善代谢分析质量。
4. 动物应bË安乐死不使用任何麻醉剂，以避免混淆核磁共振，由于肝代谢麻醉化合物（例如，使用颈椎脱位确认死亡放血其次）

2。收集肝活检的建议

1. 不要使用任何含有酒精，以避免污染的产品。工具使用仅用水或生理盐水溶液洗净。
2. 不要穿孔胆。胆漏的情况下，立即用清水或生理盐水溶液冲洗组织。
3. 收集从图2所示的左叶肝活检（约15-50毫克）。对于重复性的活组织切片检查，收集一直在避免周边地区组织较薄的左叶的中心。
4. 立即扣在液氮冻结活检，并存放于-80 °直到NMR分析彗星。

^{（3）1 H}核磁共振收购尿微量

准备在D2O（99.8％），pH值7.4，含有1毫米3 0.2M磷酸钠缓冲液- （三甲基硅基）丙酸- _D 4（TSP）的。

混合磷酸钠缓冲液30μL30μL尿。

转移到1.7毫米核磁共振毛细管使用配备一个金属针（外径0.5毫米）50μL玻璃注射器（图3（2））混合溶液50μL。小心，以避免气泡。

适合的毛细血管含尿液样本上的毛细管适配器（图3（3））和5毫米核磁共振探头（图3（1））放入一个2.5毫米的核磁共振微管。作为一个普通的5毫米核磁共振光谱采集管这管的组合。

使用提取杆（图3（4））删除从2.5毫米NMR管的毛细管拧毛细管适配器，轻轻将其拉出。

4 ^{的1 H}人力资源的MAS核磁共振肝组织活检：样品制备

1. MAS转子组件和工具是在图4描述。
2. 插入活检（约15-50毫克）进入锆转子（图4（1）），并填写该卷的其余纯D ₂ O核磁共振锁。小心不使任何气泡，因为这会改变随后垫补和数据采集的质量品质。
3. 将50μL特氟隆垫片（图4（2））使用圆柱形的螺丝（图4（5））。拧下它和校准使用深度计短边（图4（8））。在这一步，重要的是要付出特别注意样品的一部分，因为它可以通过间隔孔泄漏。如果是这样的话，那么活检的一部分被破坏和样品重量不再是可靠的。因此，有必要再次启动从开始的样品制备。
4. 将THEAD针（图4（3））轻轻螺丝，用螺丝刀（图4（6））。干出任何一块组织的残余水。
5. 放置在第（图4（4））顶部的转子和在转子打包机（图4（6））插入。坚决按，直到第到位。此外，不应该留下任何空间之间的转子和第。
6. 马克用黑色记号笔转子底部的一半，让光学旋转速率检测。
7. 广场内的核磁共振波谱仪的转子，并开始在5 kHz纺。收购^{1 H}核磁共振谱使用CPMG脉冲序列^13，根据制造商的指引。
8. 使用5.22 PPM（双峰）α异头葡萄糖共振核磁共振光谱校准。
9. 要解压缩的转子，继续使用第卸妆（图4（9））删除第。拧开THEAD针和删除聚四氟乙烯垫片使用的圆柱螺杆。使用水和洗涤剂彻底清洗。

5。代表性的成果

肠道微生物的活性，可使用尿代谢分析监测。大量的尿微生物已在文献中描述^7,14-17合作的代谢产物通过^{1 H} NMR识别。这些微生物的代谢产物是特别有用的监测殖民化进程，为他们提供了一个快速和无创的方法来估计时，新成立的生态系统是稳定的。图5A清楚地说明了肠道微生物代谢产物在殖民化过程中的外观。此图显示了以下步骤2中所述的程序为动物得到一个尿代谢轮廓殖民统治20天，使用在步骤1中描述的过程。这种动物没有排出任何indoxyl phenylacetylglycine（PAG），在无菌状态下的硫酸对甲酚（0天蓝色）的硫酸和数量很少。由于殖民化的进展，这些蛋白质代谢标记的肠道菌群大大增加，达到一个平衡点，在第20天（红色）。这是一个组所示，图5B使用PAG的动物特别容易监控共鸣。此图是由下图5A灰色（δ7.40-7.43）中强调的共振，对应于一个特定的共振PAG的一组7只动物（三重）相结合的面积。

¹ H高解像度魔角旋转（人力资源的MAS）核磁共振光谱是一种非破坏性的技术，允许任何一种^活检 18代谢概况快速和可重复性收购。在这个协议中，我们使用这个强大的技术获得前（蓝色）和（红色）（图6）定植后的2小鼠肝代谢轮廓。这个数字说明以及可以从基于核磁共振的代谢轮廓MAS派生的信息。大量的氨基酸，以及衍生代谢物，如能量代谢葡萄糖，糖原，乳酸，甘油三酸脂（D）- 3 -羟丁酸和​​nicotinurate，可以可视化。这些配置文件中还含有氧化应激相关的信息（即抗坏血酸一个CID，谷胱甘肽），核苷酸代谢（即肌苷，尿苷）和甲胺代谢（即胆碱，三甲胺- N -氧化物）。在这个例子中，这是很清楚，无菌鼠标几乎没有显示糖原和非常低血糖和甘油三酯察看⁷数额。

图1。定植协议概述。无菌和常规动物都装在过滤器端配备由方交换了自己的窝，以便逐步从传统的肠道菌群（1）定植的笼子。使用¹ H核磁共振的代谢分析（2-3），肠道微生物的活动都受到监控。肝脏代谢评估^{的1 H} HR MAS基于核磁共振的代谢分析（4-5） 。

图2鼠标生活ř解剖。肝脏是显示，比如平坦的侧面表的器官。可重复活检，这是应始终从虚线矩形的左叶中心收集的样本。

图3 1.7毫米核磁共振毛细管套件与microvolumes工作重点 ：（1）：2.5毫米核磁共振微管，2：1.7毫米核磁共振毛细管，3：毛细管适配器，4：提取杆。

图4 MAS的转子设备的关键 ：1：MAS的转子，2：50μL特氟隆垫片，3：THEAD针，4：第5：圆柱螺杆，6：螺丝刀，7：包装机转子，8：深度计。

图5 colonizatio尿代谢概况演化。N.

1. 放大6.8-7.8 ppm的微生物共同代谢产物，可以可视化^。1 H NMR谱之间的光谱芳香地区均来源于单个人在第0天（蓝色），4（绿色），15（橙色）和20 （红色）后定植。灰色地带对应的是综合图B.主要领域：1，MeHistamine：1 methylhistamine; Indoxyl - S：Indoxyl硫酸;他：组氨酸，P -甲酚 - S：P -甲酚硫酸; PAG ：Phenylacetylglycine。
2. 殖民统治期间的平均PAG的浓度（N = 7）。学生t -检验用来比较PAG浓度的差异，在不同的时间点：A：0天相比，P <0.05; B：P <0.01相比，第10天。

典型的600兆赫^{的1 H}人力资源的MAS无菌（蓝色）和前无菌（重新产生的肝活检核磁共振光谱图6 。D）小鼠。粗体质子负责甘油三酯共振键 ：3 HB：3 -羟丁酸，谷胱甘肽：谷胱甘肽，TGS：三酸甘油脂，TMAO：三甲胺- N -氧化物。

Discussion

在这个协议中，我们描述了一个渐进的殖民化过程，在一个开放的环境，进一步探讨肝脏代谢的^{影响肠道菌群}的1 H HR MAS完整活检核磁共振分析评估。殖民化的各种方法在文献中被描述。最常用的方法来定义的菌群与殖民动物灌胃或污染的饮用水^19,20。粪便接种也可以使用先前描述^21。定植方法，这里介绍的是来自一个“正常化”无菌动物库普曼JP等描述的方法。在1986年^22。在本出版物中，放入无菌动物之间的隔离生活常规动物。然而，它并不总是保持在隔离的动物，尤其是如果他们在殖民化过程中需要操纵（这是特别困难的的，如果样本山口ction是必需的）。因此，另一种方法是在传统的开放凋落物存在的环境将作为对照组采用常规的动物沾房子前无菌动物。通过这种方式，操纵殖民化的目的是最小的动物，在低应力结果相比，灌胃。这种方法还允许逐步殖民化，这是一种天然的殖民化进程，并提供一个同质定植共享同笼DGGE（变性梯度凝胶电泳）评估微生物的DNA图谱（提供补充材料证明的动物的肠道克劳斯等^7条 ）。

监测尿中代谢分析的殖民化进程，是一种无创，方便，快速和有效的方式来检测微生物的活性趋于稳定。由于它是没有必要操纵动物每天这样的目的，如图5b所示，应力水平保持在其最小。这是值得一提的殖民统治，即使是由垃圾由传统的控制动物沾发起，有必要保持这些控制动物的数目相等，这将使估计压力的混合效果和肝脏代谢老化。基于质谱（MS）的GC - MS（气相色谱）或LC - MS（液相色谱）等其他技术也可以用于确定尿微生物代谢产物以及获得的液体样品的代谢（即尿液，血浆，组织提取物），但他们不能适用于完整的组织活检。 GC - MS法已成功地应用于有针对性地分析稳定的挥发性脂肪酸^23。这种方法需要一个衍生一步，引入了偏差，我们必须审慎考虑在数据分析^24。 LC - MS法可特别有用，提高微生物的代谢产物在有针对性^的分析25的检测。虽然没有针对性的LC - MS代谢分析，大大提高了检测灵敏度低浓度的代谢物，标识可以是困难的，大量的检测代谢物可能仍然^未分配的26。因此，不相关的代谢组学研究的大部分已使用的一^维核磁共振为基础的平台。 Ryan等代谢分析目的的各种分析方法的一个有趣的讨论最近已^出版 27 。

肝脏代谢，通过非破坏性^{的1 H}人力资源的MAS NMR谱评估。这种方法是选择，因为它并不需要提取步骤中的高活性的化合物，如谷胱甘肽氧化破坏的组织和^结果 ，1 H NMR的基础代谢分析也呈现优势提供了一个不相关的代谢活检。因此，它可以大范围的观察精力充沛，氨基酸，核苷酸，甲胺和氧化应激相关途径的代谢产物覆盖。唯一的限制是根据一个化合物的分子结构变化的检测限。事实上，检出限是由化学品（即代谢物）的浓度以及给人的共振峰，其化学环境的质子数目。基础上^{的1 H} HR MAS NMR谱单独鉴定代谢物的共振也难以的，因此它应执行一些额外的二维核磁共振实验来证实的任务（即J -解决^{，COSY，TOCSY，HSQC，HMBC实验} 28-30） ^31,32。这^{1 H} HR MAS NMR技术通常用于代谢组学研究，在这种情况下，使用多元统计（也称为模式识别方法）是必要的^{33。 1} H核磁共振的代谢分析在本议定书中所述的方法已被广泛应用于各种生物不仅限于尿和肝脏样本^34-36进行分析和逻辑条件。基于核磁共振的代谢组学研究的总样本准备协议已审阅Beckonert等^。18,37 。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913