Summary
एक प्रगतिशील उपनिवेशन प्रक्रिया आगे मेजबान यकृत चयापचय पर इसके प्रभाव का आकलन करने के लिए वर्णित है. औपनिवेशीकरण गैर invasively एनएमआर आधारित चयापचय रूपरेखा द्वारा माइक्रोबियल सह चयापचयों के मूत्र उत्सर्जन का मूल्यांकन द्वारा नजर रखी है, जबकि यकृत चयापचय उच्च संकल्प जादू कोण स्पिनिंग (मानव संसाधन MAS) बरकरार बायोप्सी के एनएमआर रूपरेखा द्वारा मूल्यांकन है.
Protocol
1. रोगाणु मुक्त जानवरों और नमूना संग्रह के औपनिवेशीकरण
- Isolators और उन्हें घर से पारंपरिक जो जानवरों नियंत्रण (चित्रा 1) के रूप में काम करेंगे के सामने फिल्टर के साथ सुसज्जित पिंजरों में एक पारंपरिक पालन कमरे में रोगाणु मुक्त जानवरों निकालें.
- कूड़े के मिक्स आधा (3 पुराने दिनों) रोगाणु मुक्त पशुओं के कूड़े के साथ नियंत्रण पारंपरिक पिंजरे से लिया है. हमेशा 1 / 3 गंदे पारंपरिक कूड़े के हर समय इसे नवीनीकृत क्रम में जीवाणुओं की एक स्तर (यह कम से कम 3 दिनों के लिए रहते हैं) को बनाए रखने के लिए आवश्यक है रहते हैं.
- एक 1.5 एमएल microtube में मूत्र ट्यूब पर माउस से निपटने के द्वारा और धीरे से उसकी आंत्र मालिश द्वारा बारंबार पेशाब करने की इच्छा मदद लीजिए. स्नैप - तरल नाइट्रोजन में फ्रीज तुरंत. एनएमआर विश्लेषण तक कम से कम -40 ° C पर स्टोर. 20 μL की एक न्यूनतम मात्रा 5 मिमी एनएमआर जांच के साथ अधिग्रहण के लिए आवश्यक है, लेकिन यह 30 μL उपयोग चयापचय प्रोफाइलिंग की गुणवत्ता में सुधार की सिफारिश की है.
- पशु ख चाहिएई किसी भी चतनाशून्य करनेवाली औषधि के उपयोग के बिना euthanized क्रम में confounding एनएमआर यकृत चयापचय (उदाहरण के लिए, गर्भाशय ग्रीवा exsanguination द्वारा मौत की पुष्टि के द्वारा पीछा किया अव्यवस्था का उपयोग करें) संवेदनाहारी यौगिकों के कारण अनुनादों से बचने
2. जिगर बायोप्सी के संग्रह के लिए सिफारिश
- किसी भी संक्रमण से बचने के लिए अल्कोहल युक्त उत्पाद का उपयोग नहीं. केवल पानी या नमकीन घोल का उपयोग उपकरणों धो लें.
- पित्ताशय छेदना मत करो. पित्त रिसाव के मामले में, ऊतक तुरंत धो पानी या नमकीन घोल के साथ.
- छोड़ दिया के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है पालि से जिगर बायोप्सी (के बारे में 15-50 मिलीग्राम) ले लीजिए. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बायोप्सी के लिए, बाईं पालि परिधीय क्षेत्रों जहां ऊतक पतली है से बचने के केंद्र में लगातार इकट्ठा.
- तरल नाइट्रोजन में फ्रीज बायोप्सी तुरंत स्नैप और उन्हें -80 पर स्टोर ° C एनएमआर विश्लेषण तक.
3. मूत्र microvolume 1 एच एनएमआर अधिग्रहण
नमूना तैयारी: 4 1 जिगर ऊतक के एच एचआर MAS एनएमआर बायोप्सी
- MAS रोटर घटकों और उपकरणोंचित्रा 4 में वर्णित है.
- सम्मिलित करें बायोप्सी zirconium रोटर में (के बारे में 15-50 मिलीग्राम) (चित्रा 4 (1)) और शुद्ध एनएमआर ताला के लिए डी 2 हे के साथ मात्रा के बाकी को भरने. क्योंकि यह और डाटा अधिग्रहण के बाद shimming गुणवत्ता की गुणवत्ता बदल जाएगा बनाने के किसी भी बुलबुले नहीं सावधान रहो.
- 50 μL Teflon (4 (2) चित्रा) स्पेसर बेलनाकार स्क्रू (4 (5) चित्रा) का उपयोग कर सम्मिलित करें. इसे खोल देना और यह कम पक्ष पर गहराई गेज (चित्रा 4 (8)) का उपयोग कर जांचना. इस चरण में, यह महत्वपूर्ण है नमूना करने के लिए एक विशेष ध्यान देना है क्योंकि इसे का हिस्सा स्पेसर छेद के माध्यम से लीक कर सकते हैं. यदि यह मामला है, फिर बायोप्सी का हिस्सा नष्ट कर दिया और नमूना वजन विश्वसनीय नहीं रह गया है. यह इस प्रकार है नमूने की तैयारी शुरुआत से फिर से शुरू करने के लिए आवश्यक है.
- Thead पिन (4 (3) चित्रा) प्लेस और यह पेचकश (4 (6) चित्रा) के साथ धीरे पेंच. ऊतक का एक टुकड़ा के साथ किसी भी अवशिष्ट पानी बाहर सूखी.
- पर टोपी (4 (4) चित्रा) प्लेसरोटर के शीर्ष और रोटर पैकर (4 (6) चित्रा) में सम्मिलित हैं. मजबूती से प्रेस जब तक टोपी जगह में है. वहाँ किसी भी रोटर और अपनी टोपी के बीच छोड़ दिया स्थान नहीं होना चाहिए.
- रोटर के नीचे एक काला मार्कर पेन का उपयोग कर के आधे मार्क ऑप्टिकल स्पिन दर का पता लगाने की अनुमति है.
- एनएमआर स्पेक्ट्रोमीटर के अंदर रोटर प्लेस और 5 kHz पर कताई शुरू करते हैं. 1 एच एनएमआर निर्माता के दिशा निर्देशों के अनुसार CPMG नाड़ी 13 अनुक्रम का उपयोग करते हुए स्पेक्ट्रम मोल .
- 5.22 पीपीएम (नक़ल) α anomeric ग्लूकोज अनुनाद प्रयोग एनएमआर स्पेक्ट्रा जांचना.
- रोटर खोलना, टोपी हटाने टोपी हटानेवाला (4 (9) चित्रा) का उपयोग करके आगे बढ़ें. खोल देना thead पिन हटायें और Teflon बेलनाकार स्क्रू का उपयोग स्पेसर. धो अच्छी तरह से पानी और डिटर्जेंट का उपयोग कर.
5. प्रतिनिधि परिणाम
आंत माइक्रोबियल गतिविधि मूत्र चयापचय की रूपरेखा का उपयोग पर नजर रखी जा सकता है. मूत्र माइक्रोबियल की एक बड़ी संख्या1 एच एनएमआर द्वारा पहचाने जाने योग्य सह - चयापचयों 7,14-17 साहित्य में वर्णित किया गया है. इन माइक्रोबियल सह - चयापचयों उपनिवेशन प्रक्रिया पर नजर रखने के लिए के रूप में वे एक त्वरित और noninvasive अनुमान जब नव स्थापित पारिस्थितिकी तंत्र स्थिर है तरीका प्रदान करते हैं विशेष रूप से उपयोगी होते हैं. चित्रा 5A उपनिवेशन प्रक्रिया पर स्पष्ट रूप से पेट माइक्रोबियल सह चयापचयों की उपस्थिति दिखाता है. यह आंकड़ा से पता चलता है एक मूत्र चयापचय प्रोफ़ाइल एक जानवर के लिए चरण 2 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करके प्राप्त 20 दिनों उपनिवेश चरण 1 में वर्णित की प्रक्रिया का उपयोग कर. इस जानवर को किसी भी indoxyl सल्फेट नहीं उगलना था और (पीएजी) phenylacetylglycine और रोगाणु से मुक्त राज्य में पी cresol सल्फेट (0 नीले दिन) की बहुत कम मात्रा में. उपनिवेशण प्रगति, पेट microbiota द्वारा इन 3 प्रोटीन चयापचय के मार्करों में काफी वृद्धि करने के लिए 20 दिन (लाल) में एक संतुलन तक पहुँचने. यह विशेष रूप से आसान है सचित्र रूप में पशुओं के एक चित्रा 5B पर पीएजी का उपयोग समूह के लिए निगरानीअनुनाद. इस चित्र अनुनादों चित्रा 5A में ग्रे (7.40-7.43 δ) में डाला, 7 पशुओं के एक समूह के लिए पीएजी की एक विशिष्ट अनुनाद (triplet) को इसी के तहत क्षेत्र को एकीकृत करने के द्वारा प्राप्त किया गया था.
1 एच उच्च संकल्प जादू कोण (मानव संसाधन MAS) स्पिनिंग एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी एक गैर विनाशकारी तकनीक है कि 18 बायोप्सी के किसी भी तरह के चयापचय प्रोफाइल के त्वरित और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अधिग्रहण की अनुमति देता है है . इस प्रोटोकॉल में, हम इस शक्तिशाली तकनीक का इस्तेमाल किया (नीला) से पहले और उपनिवेशन (लाल) (चित्रा 6) के बाद 2 चूहों के यकृत चयापचय प्रोफ़ाइल प्राप्त करने के लिए. यह आंकड़ा अच्छी तरह से जानकारी है कि एनएमआर आधारित चयापचय प्रोफ़ाइल एक मास से प्राप्त किया जा सकता है दिखाता है. के रूप में के रूप में अच्छी तरह से बहुत सारे अमीनो एसिड जैसे ग्लूकोज, ग्लाइकोजन, लैक्टेट, ट्राइग्लिसराइड्स, (डी) 3 hydroxybutyrate और nicotinurate ऊर्जावान चयापचय से व्युत्पन्न चयापचयों visualized किया जा सकता है . ये प्रोफाइल भी oxidative तनाव के लिए प्रासंगिक जानकारी (यानी एक ascorbic होते हैंसीआइडी, glutathione), nucleotide (यानी inosine, uridine) चयापचय और methylamine चयापचय (यानी choline, Trimethylamine - एन - ऑक्साइड). इस उदाहरण में, यह बहुत स्पष्ट है कि रोगाणु मुक्त माउस लगभग कोई ग्लाइकोजन और ग्लूकोज और ट्राइग्लिसराइड्स की बहुत कम मात्रा के रूप में पहले 7 प्रकाशित किया गया था दिखाता है .
चित्रा 1 उपनिवेशण प्रोटोकॉल के अवलोकन. रोगाणु मुक्त और परंपरागत जानवरों पक्ष और उनके litters पारंपरिक पेट microbiota (1) से प्रगतिशील उपनिवेशण की अनुमति विमर्श कर रहे हैं द्वारा फिल्टर पक्ष के साथ सुसज्जित पिंजरों में रखे जाते हैं. आंत माइक्रोबियल गतिविधि 1 एच एनएमआर - आधारित चयापचय रूपरेखा (2-3) का उपयोग करने के लिए नजर रखी है. यकृत चयापचय 1 एच एचआर एनएमआर आधारित चयापचय रूपरेखा MAS (4-5) द्वारा मूल्यांकन किया है.
चित्रा 2. माउस रहते हैंआर शारीरिक रचना. जिगर जैसे अंग के फ्लैट की ओर तालिका चेहरे प्रदर्शित होता है. प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य बायोप्सी के लिए, यह हमेशा बाईं पालि के रूप में धराशायी आयत ने संकेत दिया के केंद्र से नमूने एकत्र करने की सलाह दी है.
चित्रा 3 कुंजी 1.7 मिमी एनएमआर केशिका किट के microvolumes साथ काम: 1: 2.5 मिमी एनएमआर microtube, 2: 1.7 मिमी एनएमआर केशिका ट्यूब, 3: केशिका एडाप्टर, 4: निष्कर्षण रॉड.
. चित्रा 4 MAS रोटर उपकरण कुंजी: 1: MAS रोटर, 2: 50 μL Teflon स्पेसर, 3: thead पिन, 4: टोपी, 5: बेलनाकार स्क्रू, 6: पेचकश, 7: रोटर पैकर, 8: गहराई गेज.
चित्रा 5 मूत्र चयापचय प्रोफाइल के colonizatio दौरान विकास.एन
- 6.8-7.8 पीपीएम माइक्रोबियल जहां कल्पना सह चयापचयों 1 एच एनएमआर स्पेक्ट्रा किया जा सकता है के बीच स्पेक्ट्रा के खुशबूदार क्षेत्र पर ज़ूम 0 दिन में एक व्यक्ति (नीला), 4 (हरा), 15 (नारंगी) और 20 से व्युत्पन्न थे (लाल) के बाद उपनिवेशन. Indoxyl सल्फेट, उनके: हिस्टडीन, पी Cresol - एस:;: 1-MeHistamine: Indoxyl-एस 1-methylhistamine ग्रे क्षेत्र के क्षेत्र है कि बी कुंजी में चित्र बनाने के लिए एकीकृत किया गया मेल खाती है पी - Cresol सल्फेट, पीएजी : Phenylacetylglycine.
- उपनिवेशण के दौरान औसत पीएजी एकाग्रता (n = 7). विद्यार्थी का t-परीक्षण करने के लिए विभिन्न समय बिंदुओं पर पीएजी एकाग्रता में अंतर की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था: पी: <0 दिन की तुलना में 0.05, ख: पी <0.01 10 दिन की तुलना में.
चित्रा 6 ठेठ 600 मेगाहर्ट्ज 1 एच (नीला) रोगाणु मुक्त और पूर्व - रोगाणु मुक्त (पुनः से व्युत्पन्न जिगर बायोप्सी के मानव संसाधन MAS एनएमआर स्पेक्ट्रा.घ) चूहों. 3 - एचबी: 3-hydroxybutyrate, GSH: कम glutathione, TGS: ट्राइग्लिसराइड्स, TMAO: Trimethylamine - एन ऑक्साइड बोल्ड प्रोटॉन ट्राइग्लिसराइड अनुनाद के लिए जिम्मेदार कुंजी हैं. .
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम एक खुले वातावरण में एक प्रगतिशील उपनिवेशन प्रक्रिया का वर्णन करने के लिए आगे यकृत चयापचय पर पेट microbiota के प्रभाव को एच 1 बरकरार बायोप्सी के एचआर MAS एनएमआर रूपरेखा द्वारा मूल्यांकन की जांच की. उपनिवेशण के विभिन्न तरीकों साहित्य में वर्णित किया गया है. सबसे आम तरीकों के लिए एक परिभाषित microbiota के साथ जानवरों उपनिवेश मौखिक नलिका - पोषण या दूषित पेयजल 19,20 हैं. मलीय टीका भी रूप में पहले 21 में वर्णित किया जा सकता है. उपनिवेशण विधि यहाँ प्रस्तुत रोगाणु मुक्त Koopman जेपी एट अल द्वारा वर्णित पशुओं के एक "सामान्य" विधि से व्युत्पन्न है. +१,९८६ 22 में. इस प्रकाशन में, लेखक अलगाने में रोगाणु मुक्त पशुओं के बीच एक जीवित पारंपरिक जानवर रखा. हालांकि, यह हमेशा संभव नहीं है isolators में जानवरों को रखने, खासकर यदि वे उपनिवेशन प्रक्रिया के दौरान चालाकी से किया जा (यह विशेष रूप से कठिन है की जरूरत है अगर नमूना collection) की आवश्यकता है. एक विकल्प के घर पूर्व रोगाणु मुक्त पशुओं के लिए इस प्रकार कूड़े की उपस्थिति में एक पारंपरिक खुले वातावरण पारंपरिक जानवरों जो नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा द्वारा गंदे में है. इस रास्ते में, उपनिवेशण के प्रयोजन के लिए पशु हेरफेर कम है और मौखिक नलिका - पोषण की तुलना में कम तनाव में यह परिणाम है. यह विधि भी की अनुमति देता है जो एक प्राकृतिक उपनिवेशण प्रक्रिया के लिए करीब है और उसी पिंजरे DGGE माइक्रोबियल डीएनए प्रोफाइल के मूल्यांकन (ढाल जेल वैद्युतकणसंचलन denaturing) (पूरक सामग्री के रूप में उपलब्ध द्वारा प्रदर्शन के रूप में साझा पशुओं के एक समरूप उपनिवेशण प्रदान करता है पेट की एक प्रगतिशील उपनिवेशण है क्लॉस एट अल. 7).
मूत्र चयापचय रूपरेखा द्वारा उपनिवेशन प्रक्रिया की निगरानी एक noninvasive, आसान, जल्दी और प्रभावी तरह का पता लगाने के लिए जब माइक्रोबियल गतिविधि स्थिर हो जाता है. के रूप में यह आवश्यक नहीं है हर दिन जानवरों के ऐसे प्रयोजन के लिए, हेरफेर के रूप में चित्रा 5B में दिखाया गया है, तनाव के स्तर पर रखा हैइसकी न्यूनतम. यह उल्लेखनीय है उल्लेख है कि भले ही उपनिवेशण एक पारंपरिक नियंत्रण जानवरों द्वारा गंदे कूड़े के द्वारा शुरू की है, यह उन नियंत्रण जानवरों की संख्या बराबर है जो एक तनाव का मिश्रित प्रभाव का आकलन करने के लिए और यकृत चयापचय पर उम्र बढ़ने के लिए अनुमति देगा रखने के लिए आवश्यक है. अन्य जीसी - एमएस (गैस क्रोमैटोग्राफी) या LC-एमएस (तरल क्रोमैटोग्राफी) के रूप में मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) पर आधारित तकनीक भी मूत्र माइक्रोबियल सह चयापचयों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से निर्धारित करने के लिए तरल नमूने के एक चयापचय प्रोफ़ाइल (यानी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है मूत्र, प्लाज्मा, ऊतक के अर्क), लेकिन वे बरकरार ऊतक बायोप्सी पर लागू नहीं कर सकते हैं. जीसी - एमएस सफलतापूर्वक स्थिर अस्थिर फैटी एसिड 23 के लक्षित विश्लेषण करने के लिए लागू किया गया है. इस तकनीक में एक derivatization जो कदम biases है कि ध्यान से डेटा विश्लेषण 24 के दौरान विचार किया जाना है परिचय की आवश्यकता है. LC-एमएस विशेष रूप से उपयोगी हो करने के लिए लक्षित 25 रूपरेखा में माइक्रोबियल सह चयापचयों का पता लगाने में सुधार कर सकते हैं. हालांकिअलक्षित चयापचय LC-एमएस रूपरेखा काफी कम एकाग्रता चयापचयों का पता लगाने संवेदनशीलता में सुधार, पहचान मुश्किल हो सकता है और पता चला चयापचयों की एक बड़ी संख्या 26 असाइन नहीं की गई रह सकता है सकते हैं. इसलिए, अलक्षित metabonomic अध्ययन के ज्यादातर एक आयामी 1 एच एनएमआर आधारित प्लेटफॉर्म का उपयोग कर प्रदर्शन किया गया है. विभिन्न विश्लेषणात्मक चयापचय रूपरेखा उद्देश्यों के लिए उपलब्ध तरीकों का एक दिलचस्प चर्चा हाल ही में किया गया है रयान एट अल द्वारा प्रकाशित 27.
यकृत चयापचय गैर विनाशकारी 1 एच एचआर MAS एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मूल्यांकन किया गया था. इस विधि क्योंकि यह एक निष्कर्षण कदम है जो glutathione जैसे उच्च प्रतिक्रियाशील यौगिकों के ऑक्सीकरण में ऊतक और परिणाम को नष्ट कर देता है 1 एच चयापचय एनएमआर आधारित प्रोफाइलिंग भी बायोप्सी की एक अलक्षित चयापचय प्रोफ़ाइल की पेशकश का लाभ प्रस्तुत की जरूरत नहीं है के लिए चुना गया था. यह इस प्रकार एक बड़ी रेंज के निरीक्षण की अनुमति देता हैऊर्जावान, अमीनो एसिड, nucleotide, methylamine और oxidative तनाव से संबंधित रास्ते को कवर चयापचयों का. केवल प्रतिबंध का पता लगाने की सीमा है जो एक यौगिक की आणविक संरचना के अनुसार बदलता रहता है. दरअसल, सीमा का पता लगाने (यानी metabolite) रासायनिक एकाग्रता के रूप में अच्छी तरह के रूप में अनुनाद चोटी और उनकी रासायनिक वातावरण देने के प्रोटॉन की संख्या के द्वारा निर्धारित किया जाता है. 1 एच एचआर MAS एनएमआर अकेले स्पेक्ट्रा के आधार पर metabolite अनुनादों की पहचान भी मुश्किल हो सकता है और यह इस प्रकार के लिए कुछ अतिरिक्त 2D एनएमआर प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए कार्य (यानी जम्मू हल, मधुर, TOCSY, HSQC, HMBC प्रयोगों 28-30) की पुष्टि करने की सलाह दी है 31,32. यह 1 एच एचआर MAS एनएमआर तकनीक सामान्यतः metabonomic अध्ययन है, जो मामले में बहुभिन्नरूपी आँकड़े (भी बुलाया पैटर्न मान्यता तरीकों) का उपयोग आवश्यक है 33 के लिए प्रयोग किया जाता है. 1 एच एनएमआर आधारित चयापचय की रूपरेखा इस प्रोटोकॉल में वर्णित विधियों को बड़े पैमाने पर विभिन्न जैव के लिए लागू किया गया हैतार्किक शर्तों और मूत्र और जिगर 34-36 नमूने के विश्लेषण के लिए सीमित नहीं हैं . जनरल एनएमआर आधारित metabonomics के लिए नमूना तैयार प्रोटोकॉल Beckonert एट अल द्वारा किया गया है 18,37 की समीक्षा की..
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
सभी एनएमआर उदाहराणदर्शक उदाहरण के रूप में इस्तेमाल किया स्पेक्ट्रा पहले प्रकाशित 7 अध्ययन है जो आर्थिक रूप से नेस्ले द्वारा समर्थित किया गया था से व्युत्पन्न हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Table of specific reagents and equipment: | |||
| 2.5 mm microtube | New Era | NE-H5/2.5-V-Br | |
| 1.7 mm capillary tube | Sigma-Aldrich | NORS175001 | |
| Capillary adapter | New Era | NE-325-5/1.7 | |
| Extraction rod | New Era | NE-341-5 | |
| HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit | Bruker Corporation | HZ07213 | |
| Tool kit for 50 μL inserts | Bruker Corporation | B2950 | |
| Advance III 600 MHz NMR | Bruker Corporation | ||
| 1H HR MAS NMR solid probe | Bruker Corporation | ||
| Deuterium oxide 99.9 % | Sigma-Aldrich | 530867-1L | |
| 3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP) | Sigma-Aldrich | 269913 | |
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