Immunology and Infection

無菌マウスでのプログレッシブ植民地時代に肝代謝変化を評価する¹ H NMR分光法

Published: December 15, 2011 doi: 10.3791/3642

¹School of Chemistry, Food and Pharmacy, The University of Reading, ²Department of Nutritional Sciences, The University of Reading

Summary

プログレッシブ植民地化の手順は、さらにホストの肝代謝への影響を評価するために記述されています。肝代謝が高分解能マジック角スピニング（人事MAS）無傷の生検のNMRプロファイリングによって評価されている間植民地化は、NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄を評価することにより、侵襲的、非監視されます。

Abstract

それは、腸内細菌がこのような免疫保護とビタミンの合成など、さまざまな利点を提供し、ホストの恒常性に大きく貢献することはよく知られています。彼らはまた、このエコシステムに不可欠な代謝の臓器作り、栄養素のかなりの量のホストを指定します。ホストとその腸内細菌叢との間の代謝相互作用を理解する腸内細菌叢とメタボリックシンドロームとの間のリンク、の増加する証拠の文脈では、現代生物学の重要な課題となってきています^。1-4

植民地化は（また、正規化のプロセスとも呼ばれる）の元無菌動物における微生物の設立を指定します。それは、出生時に発生する自然なプロセスですが、それはまた腸花生態系を制御し、さらにホストの代謝への影響を判断するために成人無菌動物で使用されています。植民地化のプロセスを制御するための一般的な手順は、singlで強制経口投与の方法を使用することです。eまたは微生物の混合物。このメソッドは、非常に迅速に植民地化の結果^、5非常にストレスであることの不利を提示。したがって、ストレスを最小限に抑え、徐々にホストの代謝上の細菌の設立の影響を観察するために低速の植民地化のプロセスを取得すると便利です。

この原稿では、我々は非破壊メタボリックプロファイリング技術を使用して徐々に植民地化の過程で肝代謝の変更を評価する手順を説明します。我々は^、1 H NMRベースの代謝プロファイリングによる共同代謝微生物の尿中排泄により反射された腸内微生物の代謝活性を評価することによって、腸内微生物のコロニー形成を監視するために提案する。これは通常、DGGE（勾配ゲル電気泳動を変性）による糞便細菌を監視することにより評価した腸内微生物生態系の安定した設置を超える腸内微生物活性の安定性の理解が可能になります^。6植民地化は、従来のオープンな環境で行われ、汚れたゴミ対照となる従来の動物、で汚れたによって開始されます。糞食性の動物がいるげっ歯類は、これは前述のように均質な植民地化を保証^します

肝代謝プロファイリングは、NMR分光法をスピニング¹ H高分解能マジック角を使用して無傷の肝生検から直接測定されます。この半定量的な手法は、さらに植民地化のプロセスと肝代謝^70から10の間の複雑な相互作用を推定するために、セル構造に損傷を与えることなく、そのようなトリグリセリド、グルコースとグリコーゲンなどの主要な代謝物を評価するための素早い方法を提供しています。このメソッドは任意の組織生検^11,12に適用することもできます。

Protocol

1。無菌動物とサンプル採取の植民地化

無菌アイソレーターと家それらのコントロール（図1）となる従来の動物の前にフィルターを装備したケージの中で、従来の飼育室内から動物を取り外します。
無菌動物のくずで制御従来のケージから取り出したゴミ（3日齢）の半分を混ぜる。常に汚れた従来のゴミの1 / 3は、細菌のレベルを（少なくとも3日間それを保つ）を維持するためにそれを更新する必要があるたびにしてください。
チューブの上にマウスを処理することにより、1.5 mLのマイクロチューブに尿を収集し、静かに腸をマッサージによって排尿を助ける。スナップインの凍結液体窒素で直ちに。 NMRの分析まで、少なくとも-40℃で保管してください。 20μLの最小体積は5mm NMRプローブで取得するために必要ですが、メタボリックプロファイリングの質を向上させるために30μLを使用することをお勧めします。
動物Bすべきeは、麻酔薬の化合物の肝代謝（例えば、放血によって死の確認に続いて頸椎脱臼を使用）による交絡NMR共鳴を避けるためにどんな麻酔を使用せずに安楽死させ

2。肝生検のコレクションのための勧告

汚染を避けるために、アルコールを含む製品を使用しないでください。水のみまたは生理食塩水を使用してツールを洗ってください。
胆嚢穿孔しないでください。胆汁の漏れの場合には、水または生理食塩水ですぐに組織を洗う。
図2に示すように、左葉から肝生検（15-50約100mg）を収集する。再現可能な生検のために、組織が薄くなって周辺地域を避けて左葉の中心に一貫して収集する。
直ちに液体窒素中で凍結生検をパチンと-80に保管しておきます° CのNMR分析まで。

尿微量^3。1 H NMRの取得

D2O（99.8％）、1mMの3を含む液（pH7.4）中0.2Mリン酸ナトリウム緩衝液を準備- （トリメチルシリル）プロピオン酸- dの_{4（TSP）。}

リン酸ナトリウム緩衝液の30μLと尿の30μLを混合。

金属針（外径0.5 mm）を装備した50μLガラスシリンジを用いて1.7mmのNMRキャピラリーチューブ（図3（2））に混合液の50μLを移す。気泡を避けるように注意してください。

毛細血管を含む尿サンプルの上にキャピラリアダプタ（図3（3））に適合と5mm NMRプローブ（図3（1））のための2.5 mmのNMRのマイクロチューブに入れてください。スペクトル取得のための定期的な5 mmのNMR管にチューブのこの組み合わせを使用してください。

それを引き出すために静かにキャピラリアダプタをねじ込んで2.5 mmのNMRチューブからキャピラリーを削除するには、抽出のロッド（図3（4））を使用してください。

。肝組織生検の4 ¹ H人事MAS NMR法：試料調製

ローターのコンポーネントとツールがあるMAS図4で説明しています。
ジルコニウムローターに生検を（15-50約20mg）を挿入します（図4（1））とNMRロック用の純粋なD ₂ Oでボリュームの残りを埋める。これはデータ収集のその後のシミングと質の質を変えてしまうので、どんな泡をしないように注意してください。
円筒状のネジ（図4（5））を使用して50μLテフロンスペーサー（図4（2））を挿入します。ネジを外し、それと短い側の深さゲージ（図4（8））を使用して、それを校正する。このステップでは、それの部分がスペーサーの穴から漏れる可能性があるため、サンプルに固有の注意を払うことが重要です。このような場合は、その後、生検の一部が破壊され、サンプルの重量は、信頼性はなくなりました。それは、このように最初から再度サンプルの準備を開始する必要があります。
THEADピン（図4（3））に置き、ねじ回し（図4（6））で軽く固定します。組織片を持つ任意の残留水を完全に乾かす。
でキャップ（図4（4））を配置ローターの上部とローターパッカー（図4（6））に挿入します。キャップが所定の位置になるまでしっかりと押します。ローターとそのキャップの間に残されたスペースは存在しないはずです。
光学的スピン速度の検出を可能にするために黒のマーカーペンを使ってローターの底部の半分をマークします。
NMR分光計の内部にローターを配置し、5 kHzで回転し始める。メーカーのガイドラインに従ってCPMGパルスシーケンス^13を用いて¹ H NMRスペクトルを取得する。
NMRスペクトルを較正するために5.22 ppmの（二重線）で、αアノマーグルコースの共鳴を使用してください。
ローターをアンパックするには、キャップリムーバー（図4（9））を使用してキャップを除去することによって進んでください。ネジを外しTHEADピンと円筒形のネジを使用して削除テフロンスペーサー。徹底的に水と洗剤を使って洗う。

5。代表的な結果

腸内微生物の活動は、尿中の代謝プロファイリングを使用して監視できます。尿中の微生物の数が多い¹ H NMRによって同定共同代謝物は、文献^7,14-17に記載されている。これらの微生物の共同代謝物は、彼らが新たに設立された生態系が安定しているときに推定するために、迅速かつ非侵襲的な方法を提供するように植民地化のプロセスを監視するために特に有用です。図5Aは、明らかに植民地化のプロセスを介し腸の微生物の共同代謝物の外観を示しています。この図は、動物のためのステップ2で説明した手順に従うことによって得られる尿中代謝プロファイルは、ステップ1で説明した手順を使用して20日を植民地化を示しています。この動物は、無菌状態（0日目-青）で任意のインドキシル硫酸とphenylacetylglycine（PAG）及びp -クレゾール硫酸の非常に少ない量を排出していない。植民地化が進むにつれ、腸内細菌によるタンパク質代謝のこの3つのマーカーは、20日目（赤）で平衡に達するために大幅に増加する。 PAGを使用して、図5Bに示すように、これは動物のグループを監視するための特に簡単です。共鳴。この図は7動物のグループのために、PAGの特定の共鳴（三重）に対応する図5Aに灰色で強調表示されて共鳴（δ7.40から7.43）、下の面積を積分して得られた。

¹ H高分解能マジック角スピニング（人事MAS）NMR分光法は、生検¹⁸の任意の種類の代謝プロファイルを迅速かつ再現性の買収を可能にする非破壊技術です。このプロトコルでは、我々は（青）と後（赤）のコロニー形成（図6）前2マウスの肝代謝のプロファイルを取得するために、この強力な技術を使用していました。この図はよくMAS NMRベースの代謝プロファイルから導出することができる情報を示しています。多数のアミノ酸だけでなく、例えばグルコース、グリコーゲン、乳酸、トリグリセリド、（D）-3 -ヒドロキシ酪酸とnicotinurateなどのエネルギー代謝から得られる代謝産物を可視化することができる。これらのプロファイルはまた、酸化ストレス（すなわちアスコルビンに関連する情報が含まれていますCID、グルタチオン）、ヌクレオチド代謝（すなわちイノシン、ウリジン）およびメチルアミンの代謝（すなわちコリン、トリメチルアミン- N -オキシド）。この例では、それは、無菌マウスはほとんどグリコーゲンやブドウ糖とトリグリセリドの非常に低い量として以前に^7を公開したが表示されないことが非常に明確です。

図1。
図1。植民地化のプロトコルの概要。無菌と、従来の動物が側とその仔は、従来の腸内細菌叢（1）からプログレッシブ植民地化を可能にするために交換されることで、フィルタの側面を装備したケージに収容されています。腸内微生物の活動は^、1 H NMRベースの代謝プロファイリング（2-3）を使用して監視されます。肝代謝は^、1 H人事MAS NMRベースの代謝プロファイリング（4-5）によって評価される。

図2。
図2。マウスのライブRの解剖学。肝臓は、そのような臓器の平らな面として表示されているテーブルに直面している。再現可能な生検の場合は、それは破線の長方形で示されるように常に左葉の中央からサンプルを収集することをお勧めします。

図3。
図3 microvolumesで動作するように1.7ミリメートルNMRキャピラリーキットキー ：。。：1 2.5 mmのNMRマイクロチューブ、2：1.7ミリメートルNMRキャピラリーチューブ、3：キャピラリアダプタ、4：抽出ロッド。

図4。
図4 MASローター装備キー ：。。：1 MASローター、2：50μLテフロンスペーサー、3：THEADピン、4：キャップ、5：円筒形のネジ、6：ドライバー、7：ローターパッカー、8：深さゲージ。

図5。
図5。colonizatio時の尿中代謝プロファイルの進化nの

微生物の共同代謝を可視化できる6.8から7.8 ppmの間のスペクトルの芳香族領域でズーム^。1 H NMRスペクトルは0日目（青）で、単一の個体由来した、4（緑）、15（オレンジ）と20 （赤）ポスト植民地化。インドキシル硫酸、彼の：：ヒスチジン、p -クレゾール- S：、：1 - MeHistamine：インドキシル- S 1 - methylhistamineグレーゾーンはBキーで図を作るために統合された領域に対応するp -クレゾール硫酸; PAG ：Phenylacetylglycine。
植民地化中の平均PAGの濃度（N = 7）。スチューデントのt検定は、様々なタイムポイントでPAGの濃度差を比較するために使用されていました：P 0日目に比べて<0.05、B：P <0.01は、10日目に比べて。

図6。
図6。無菌（青）と元無菌（再由来する肝生検の典型的な600 MHzの¹ H人事MAS NMRスペクトルD）マウス。大胆な陽子は、トリグリセリドの共鳴する責任がありますキー：3 - HB：3 -ヒドロキシ酪酸、GSH：還元型グルタチオン、TGS：トリグリセリド、TMAO：トリメチルアミン- N -オキシド。

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Discussion

このプロトコルでは、我々はさらに無傷の生検の¹ H人事MAS NMRのプロファイリングにより評価された肝代謝で腸内細菌の影響を調査するためにオープンな環境で進歩的な植民地化の手順を説明した。植民地化の様々な方法が文献に記載されている。定義された細菌を持つ動物を植民地化する最も一般的な方法は強制経口投与または汚染された飲料水^19,20です。糞便の接種は、前述の²¹として使用することができます。ここで紹介する植民地化の方法は、コープJPらによって記述された無菌動物の"正常化"の方法から派生しています。 1986年^22インチ本書では、著者らは、無菌動物の間でアイソレーターに生きて、従来の動物を置く。しかし、それは、アイソレータで動物を維持するためには必ずしも可能ではないサンプルコレなら彼らは植民地化のプロセス中に操作する必要がある場合は特に（これは特に困難です。ction）が必要です。代替は、ごみの存在下で、従来のオープンな環境で家の元無菌動物することにあるコントロールとして使用される従来の動物によって汚した。このように、植民地化の目的のために動物の操作は最小限で、低い応力でこの結果は、強制経口投与と比較して。また、このメソッドは、自然の植民地化のプロセスに近い場所にあると微生物のDNAプロファイルのDGGE（変性剤濃度勾配ゲル電気泳動）評価（の補足資料として利用で示すように同じケージを共有している動物の同種の植民地化を提供して腸内の進歩的な植民地化することができますクラウスら^7）。

尿中の代謝プロファイリングによる植民地化のプロセスを監視すると、微生物の活動が安定したことを検出する非侵襲的、簡単、迅速かつ効果的な方法です。それは図5Bに示すように、そのような目的のために毎日動物を操作する必要はないので、ストレスのレベルがに保たれているその最小。それは、植民地化が落葉、従来のコントロール動物で汚れたによって開始されている場合でも、それは一つのストレスの混合効果を推定し、肝代謝の老化を可能にするそれらのコントロール動物の数と同じ数を保つために必要であることを言及することは注目に値する。このようなGC - MS（ガスクロマトグラフィー）やLC - MS（液体クロマトグラフィー）などの質量分析（MS）に基づいて、他の技術もまた、液体サンプルの代謝プロファイル（すなわちを得るために尿中の微生物の共同代謝物と同様に決定するために使用することができます尿、血漿、組織抽出物）、それらは無傷の組織生検に適用することはできません。 GC - MSが正常に安定した揮発性脂肪酸²³の標的分析に適用されています。この手法は、慎重にデータ分析²⁴中に考慮する必要がバイアスを導入する誘導体化ステップを必要とします。 LC - MSは、ターゲットプロファイリング²⁵の共同代謝微生物の検出を向上させるために特に役立ちます。ものの非標的LC - MSメタボリックプロファイリングは、実質的に低濃度の代謝物の検出感度を向上させる、識別が困難になる可能性がありますし、検出された代謝物の多数は^、26を割り当てられていないままになることがあります。したがって、非標的メタボノミクス研究のほとんどは、一次元¹ H NMRベースのプラットフォームを使用して行われている。メタボリックプロファイリングの目的で利用できる様々な分析方法の興味深い議論は、最近、ライアンらによって出版されている^。27。

肝代謝を非破壊¹ H HR MAS NMR分光法により評価した。それは例えば、グルタチオンなどの反応性の高い化合物の酸化における組織と成果を破壊する抽出工程を必要としないので、このメソッドは、選択された¹ H NMRベースの代謝プロファイリングは、生検の関連性の低い代謝プロファイルを提供することの利点をも提示する。それは、このように広い範囲の観察を可能にエネルギッシュな、アミノ酸をカバーする代謝物、塩基、メチルアミンおよび酸化ストレスに関連する経路。唯一の制限は、化合物の分子構造に応じて変化する検出限界です。確かに、検出限界は、化学物質（すなわち代謝物）濃度だけでなく、共鳴のピークとその化学的環境を与える陽子の数によって決定されます。代謝共鳴の同定は、また一人で¹ H人事MAS NMRスペクトルに基づいて、困難な場合があり、これは次のように割り当てを（すなわち、TOCSY、HSQC、HMBC実験^{28-30、COSY、J}分解^）を確認するためにいくつかの余分な2D NMR実験を実行することをお勧めします^31,32。この¹ H人事MAS NMR法は、一般的にメタボノミクス研究に使用され、その場合、多変量統計情報の使用は、（パターン認識の手法も呼ばれる^）33が必要である。このプロトコールに記載されて¹ H NMRベースの代謝プロファイリング法は、広く様々な生物に適用されています論理的な条件とは、尿及び肝臓試料^34〜36の分析に限定されない。 NMRベースのメタボノミクスのための一般的なサンプル調製プロトコルがBeckonert らによって検討されています^。18,37。

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Disclosures

我々は、開示することは何もない。

Acknowledgments

例示的な例として使用されるすべてのNMRスペクトルは、財政的にネスレでサポートされていた以前に発行された研究⁷から派生しています。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
¹H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d₄ (TSP)	Sigma-Aldrich	269913