Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Vurdere Nedsatt Metabolske endringer under Progressive Colonization of Germ-free Mouse av 1 H NMR spektroskopi

Published: December 15, 2011 doi: 10.3791/3642

Summary

En progressiv kolonisering prosedyren er beskrevet å vurdere nærmere dens innvirkning på verten hepatisk metabolisme. Colonization er overvåket non invasiv ved å evaluere urinutskillelse av mikrobiell co-metabolitter av NMR-baserte metabolske profilering mens hepatisk metabolisme er vurdert av High Resolution Magisk Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering av intakt biopsi.

Abstract

Det er velkjent at gut bakterier bidra betydelig til verten homeostase, og gir en rekke fordeler som immune beskyttelse og vitamin syntese. De leverer også verten med en betydelig mengde næringsstoffer, noe som gjør dette økosystemet et vesentlig metabolsk organ. I forbindelse med økende bevis for koblingen mellom tarmflora og metabolsk syndrom, forstå metabolske samspillet mellom verten og dens gut microbiota blir en viktig utfordring i moderne biologi. 1-4

Colonization (også referert til som normalisering prosessen) betegner etablering av mikro-organismer i et tidligere bakterie-fritt dyr. Mens det er en naturlig prosess som skjer ved fødselen, er det også brukt i voksen bakterie-fritt dyr for å kontrollere tarmen floral økosystemet og videre bestemme dens innvirkning på verten metabolismen. En vanlig prosedyre for å kontrollere koloniseringen prosessen er å bruke sonde metoden med en single eller en blanding av mikro-organismer. Denne metoden resulterer i en meget rask kolonisering og presenterer den ulempen ved å være ekstremt stressende 5. Det er derfor nyttig å minimere stress og å få en tregere kolonisering prosess for å observere gradvis virkningen av bakteriell etablering på verten metabolismen.

I dette manuskriptet, beskriver vi en prosedyre for å vurdere endring av hepatisk metabolisme under en gradvis kolonisering prosess med et ikke-destruktiv metabolske profilering teknikk. Vi foreslår å overvåke gut mikrobiell kolonisering ved å vurdere gut mikrobiell metabolsk aktivitet reflekteres av urinutskillelse av mikrobiell co-metabolitter av 1 H NMR-baserte metabolske profilering. Dette gir en styrking av stabilitet i tarmen mikrobiell aktivitet utover stabil etablering av tarmen mikrobielle økosystem vanligvis vurdert ved å overvåke fecal bakterier ved DGGE (denaturering gradient gel elektroforese). 6kolonisering foregår i en konvensjonell åpne omgivelser og er initiert av en skitten kull tilgriset av konvensjonelle dyr, som vil fungere som kontroller. Gnagere blir coprophagous dyr, sikrer dette en homogen kolonisering som tidligere beskrevet. 7

Nedsatt metabolske profilering måles direkte fra et intakt leverbiopsi bruker 1 H High Resolution Magisk Angle Spinning NMR-spektroskopi. Dette semi-kvantitative teknikken tilbyr en rask måte å vurdere, uten å skade cellestrukturen, de viktigste metabolittene som triglyserider, glukose og glykogen for å ytterligere estimere komplekse samspillet mellom koloniseringen prosessen og hepatisk metabolisme 7-10. Denne metoden kan også brukes på alle vev biopsi 11,12.

Protocol

1. Kolonisering av bakterie-fritt dyr og prøvetaking

  1. Fjern bakterie-fritt dyr fra isolatorer og huse dem i en konvensjonell reindrift rom i bur er utstyrt med filter foran konvensjonelle dyr som vil tjene som kontroller (Figur 1).
  2. Bland halvparten av kullet (3 dager gammel) tatt fra kontroll konvensjonelle bur med kullet av bakterie-fritt dyr. Hold alltid 1 / 3 av de skitne konvensjonelle kullet hver gang det er nødvendig å fornye den for å opprettholde et nivå av bakterier (holde det minst i 3 dager).
  3. Samle urin i en 1,5 mL microtube ved håndtering musen over røret og hjelpe vannlating ved å forsiktig massasje av tarmen. Snap-fryse umiddelbart i flytende nitrogen. Oppbevar minst ved -40 ° C til NMR analyse. Et minimum volum på 20 mL er nødvendig for oppkjøpet med en 5 mm NMR sonde, men det er anbefalt å bruke 30 mL å forbedre kvaliteten på metabolske profilering.
  4. Dyr skal be avlives uten bruk av bedøvelse for å unngå konfunderende NMR resonanser pga hepatisk metabolisme av anesthetic forbindelser (for eksempel bruke cervikal forvridning fulgt av bekreftelse av død ved exsanguination)

2. Anbefaling for innsamling av leverbiopsi

  1. Ikke bruk produkter som inneholder alkohol for å unngå forurensning. Vask verktøy å bruke bare vann eller saltløsning.
  2. Ikke perforere galleblæren. I tilfelle av galle lekke, vask vev straks med vann eller saltløsning.
  3. Samle leverbiopsier (ca. 15-50 mg) fra venstre lapp som vist i Figur 2. For reproduserbar biopsier, samle konsekvent i sentrum av venstre lapp unngå de perifere områdene der vev er tynnere.
  4. Snap fryse biopsier i flytende nitrogen umiddelbart og lagre dem ved -80 ° C til NMR analyse.

3. 1 H NMR oppkjøpet av urin microvolume

  • Forbered 0.2m natriumfosfat buffer løsning i D2O (99,8%), pH 7,4 inneholder 1 mm 3 - (trimethylsilyl) propionsyre-d 4 (TSP).
  • Bland 30 mL av urin med 30 mL av natrium fosfat buffer.
  • Overfør 50 mL av blandet løsningen i 1,7 mm NMR kapillarrør (figur 3 (2)) med en 50 mL glassprøyte utstyrt med en metall nål (OD 0,5 mm). Vær forsiktig for å unngå bobler.
  • Monter kapillær adapter (Figur 3 (3)) på toppen av kapillær inneholder urinprøve og plassere den inn i en 2,5 mm NMR microtube for 5 mm NMR proben (figur 3 (1)). Bruk denne kombinasjonen av rør som en vanlig 5 mm NMR rør for spektral oppkjøpet.
  • Bruk utvinning stang (figur 3 (4)) for å fjerne kapillære fra 2,5 mm NMR rør ved å skru den kapillære adapteren forsiktig å trekke den ut.
  • . 4 1 H HR MAS NMR av leveren vev biopsi: prøveopparbeidelse

    1. MAS rotor komponenter og verktøybeskrevet i Figur 4.
    2. Sett biopsi (ca 15-50 mg) i zirkonium rotor (Figur 4 (1)) og fyll resten av volumet med rene D 2 O for NMR lås. Vær nøye med å ikke gjøre noen bobler, fordi dette vil endre kvaliteten på etterfølgende shimsingen og kvaliteten på datainnsamling.
    3. Sett inn 50 mL Teflon mellomledd (Figur 4 (2)) ved hjelp av sylindriske skruen (Figur 4 (5)). Skru det og kalibrere den med dybdemåler på kortsiden (Figur 4 (8)). På dette trinnet, er det viktig å betale en spesiell oppmerksomhet til prøven fordi en del av det kan lekke gjennom spacer hullet. Hvis dette er tilfelle, da en del av biopsi er ødelagt og prøve vekt er ikke lenger pålitelig. Det er derfor nødvendig å starte igjen fra begynnelsen utarbeidelse av prøven.
    4. Plasser thead pin (Figur 4 (3)) og skru den forsiktig med skrutrekker (Figur 4 (6)). Tørke ut eventuelle gjenværende vannet med et stykke vev.
    5. Plasser lokket (Figur 4 (4)) påtoppen av rotoren og sett det inn i rotoren packer (Figur 4 (6)). Trykk hardt til hetten er på plass. Det skal ikke være noe plass igjen mellom rotoren og cap.
    6. Marker halvparten av bunnen av rotor med en sort tusj penn for å tillate optisk spinne sats deteksjon.
    7. Plasser rotoren inne i NMR spektrometer og begynne å spinne på 5 kHz. Skaff 1 H NMR spekteret bruker CPMG puls sekvens 13 i henhold til produsentens retningslinjer.
    8. Bruk α anomeric glukose resonans ved 5,22 ppm (doublet) å kalibrere NMR spektra.
    9. Å pakke rotoren, fortsetter ved å fjerne lokket med cap remover (Figur 4 (9)). Skru thead pin og fjerne Teflon spacer hjelp av sylindriske skruen. Vask grundig med vann og vaskemiddel.

    5. Representant Resultater

    Gut mikrobiell aktivitet kan overvåkes ved hjelp av urin metabolsk profilering. Et stort antall urin mikrobiellco-metabolitter identifiserbare ved 1 H NMR har blitt beskrevet i litteraturen 7,14-17. Disse mikrobielle co-metabolitter er spesielt nyttig å overvåke koloniseringen prosessen som de gir en rask og ikke-invasiv måte å beregne når det nyetablerte økosystem er stabil. Figur 5A illustrerer tydelig inntrykk av gut mikrobiell co-metabolitter over kolonisering prosessen. Denne illustrasjonen viser en urin metabolsk profil oppnådd ved å følge prosedyren beskrevet i trinn 2 for et dyr kolonisert 20 dager å bruke fremgangsmåten som er beskrevet i trinn 1. Dette dyret har ikke skille ut noe indoxyl sulfat og svært lite mengder av phenylacetylglycine (PAG) og p-cresol sulfat ved bakterie-free state (dag 0-blå). Som kolonisering utvikler seg, disse 3 markører for protein metabolismen av tarmen microbiota øke betraktelig for å nå en likevekt på dag 20 (rød). Dette er spesielt lett å overvåke for en gruppe dyr som illustrert i figur 5B bruker PAGresonans. Dette diagrammet ble oppnådd ved å integrere arealet under resonanser uthevet i grått i Figur 5A (δ 7,40 til 7,43), tilsvarende en spesifikk resonans (triplett) av PAG for en gruppe på 7 dyr.

    1 H High Resolution Magisk Angle Spinning (HR MAS) NMR spektroskopi er en ikke destruktiv teknikk som gir rask og reproduserbar oppkjøp av metabolske profiler av enhver form for biopsi 18 år. I denne protokollen, brukte vi denne kraftige teknikk for å få en nedsatt metabolsk profil av 2 mus før (blå) og etter (rød) kolonisering (figur 6). Denne figuren illustrerer godt den informasjonen som kan utledes fra et MAS NMR-basert metabolske profil. Tallrike aminosyrer samt metabolitter avledet fra energisk metabolisme som glukose, glykogen, laktat, triglyserider, (D)-3-hydroxybutyrate og nicotinurate kan visualiseres. Disse profilene inneholder også informasjon som er relevant til oksidativt stress (dvs. ascorbic enCid, glutation), nukleotid metabolisme (dvs. inosine, uridine) og metylamin metabolisme (dvs. kolin, Trimethylamine-N-oksid). I dette eksemplet er det veldig klart at bakterie-free mus viser nesten ingen glykogen og svært lave mengder glukose og triglyserider som ble tidligere utgitt syv.

    Figur 1.
    Figur 1. Oversikt over kolonisering protokollen. Bakterie-free og konvensjonelle dyr er plassert i bur er utstyrt med filtre side ved side og deres kull utveksles å tillate progressive koloniseringen fra de konvensjonelle tarmen microbiota (1). Gut mikrobiell aktivitet er overvåket ved hjelp av 1 H NMR-baserte metabolske profilering (2-3). Levermetabolisme er vurdert av en H HR MAS NMR-baserte metabolske profilering (4-5).

    Figur 2.
    Figur 2. Mouse leverr anatomi. Leveren vises som den flate siden av orgelet ansikter bordet. For reproduserbar biopsier, anbefales det å alltid samle inn prøver fra midten av venstre lapp som indikert av den stiplede rektangelet.

    Figur 3.
    Figur 3 1.7 mm NMR kapillære kit å jobbe med microvolumes Key..: 1: 2,5 mm NMR microtube, 2: 1,7 mm NMR kapillarrør, 3: Capillary adapter, 4: Extraction stang.

    Figur 4.
    . Figur 4 MAS rotor utstyr Key. 1: MAS rotor, 2: 50 mL Teflon spacer, 3: Thead pin, 4: cap, 5: sylindrisk skrue, 6: skrutrekker, 7: rotor packer, 8: dybdemåler.

    Figur 5.
    Figur 5. Evolution of urin metabolske profiler under colonization.

    1. Zoom på aromatiske regionen i spektra mellom 6.8 til 7.8 ppm der mikrobielle co-metabolitter kan visualiseres. 1 H NMR spektra var avledet fra en enkelt person på dag 0 (blå), 4 (grønn), 15 (oransje) og 20 (red) post-kolonisering. Den grå sone tilsvarer det området som ble integrert for å gjøre diagrammet i B. Key: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine; Indoxyl-S: Indoxyl sulfat, Hans: Histidin; p-Cresol-S: p-Cresol sulfat; PAG : Phenylacetylglycine.
    2. Gjennomsnittlig PAG konsentrasjon under koloniseringen (n = 7). Student t-test ble brukt for å sammenligne forskjellen i PAG konsentrasjon på ulike tids-punkter: a: p <0,05 sammenlignet med dag 0; b: p <0,01 sammenlignet med dag 10.

    Figur 6.
    Figur 6. Typiske 600 MHz 1 H HR MAS NMR spektra av leverbiopsier avledet fra bakterie-fritt (blå) og ex-bakterie-fritt (red) mus. Fet protoner er ansvarlig for triglyserid resonans Key. 3-HB: 3-hydroxybutyrate, GSH: redusert glutation, TGS: Triglyserider, TMAO: Trimethylamine-N-oksid.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    I denne protokollen, beskrev vi en progressiv kolonisering prosedyre i et åpent miljø for å ytterligere undersøke effekten av tarmen microbiota på levermetabolisme vurderes av en H HR MAS NMR profilering av intakt biopsi. Ulike metoder for kolonisering har blitt beskrevet i litteraturen. De vanligste metodene for å kolonisere dyr med en definert microbiota er oral sonde eller forurenset drikkevann 19,20. Fecal inokulasjon kan også brukes som tidligere beskrevet 21. Koloniseringen Metoden som presenteres her er hentet fra en "normalisering" metode for bakterie-fritt dyr beskrevet av Koopman JP et al. i 1986 22. I denne publikasjonen, plasserte forfatterne et levende konvensjonelle dyr inn i isolatoren mellom bakterie-fritt dyr. Men det er ikke alltid mulig å holde dyr i isolatorer, spesielt hvis de trenger å bli manipulert under koloniseringen prosessen (dette er spesielt vanskelig hvis sample collection er nødvendig). Et alternativ er derfor å huse ex-bakterie-fritt dyr i en konvensjonell åpent miljø i nærvær av kullet som er tilsølt med konvensjonelle dyr som vil bli brukt som kontroller. På denne måten er dyr manipulasjon for å kolonisering minimal og dette resulterer i lavere vekt sammenlignet med oral sonde. Denne metoden gir også en progressiv kolonisering av tarmen som er nærmere en naturlig kolonisering prosess, og tilbyr en homogen kolonisering av dyr deler samme bur som demonstrert ved DGGE (denaturering Gradient Gel elektroforese) vurdering av mikrobiell DNA-profiler (tilgjengelig som supplerende materiale i claus et al. 7).

    Overvåking av kolonisering prosessen ved urin metabolske profilering er en invasiv, enkel, rask og effektiv måte å oppdage når den mikrobielle aktiviteten blir stabil. Ettersom det er ikke nødvendig å manipulere dyr hver dag for slike formål, som vist i figur 5B, er stress nivået holdes påsitt minimum. Det er bemerkelsesverdig å nevne at selv om kolonisering er initiert av et kull som er tilsølt med konvensjonell kontroll dyr, er det nødvendig å holde et likt antall av disse kontroll dyrene som vil tillate en å beregne blandet effektene av stress og aldring på levermetabolisme. Andre teknikker basert på massespektrometri (MS) som GC-MS (gasskromatografi) eller LC-MS (Liquid Chromatography) kan også brukes til å bestemme urin mikrobiell co-metabolitter, samt å få en metabolsk profil av væskeprøver (dvs. urin, plasma, vev utdrag), men de kan ikke brukes på intakt vev biopsi. GC-MS har blitt brukt til målrettede analyser av stabile flyktige fettsyrer 23. Denne teknikken krever en derivatisering skritt som introduserer skjevheter som må vurderes nøye i løpet av dataanalyse 24. LC-MS kan være spesielt nyttig for å bedre påvisning av mikrobielle co-metabolitter i målrettet profilering 25. Selvvilkårlige LC-MS metabolske profilering vesentlig bedre følsomhet med lav konsentrasjon metabolitter, kan identifisering være vanskelig, og et stort antall oppdaget metabolitter kan forbli tilordnet 26. Derfor har de fleste av de vilkårlige metabonomic studiene er utført ved hjelp av endimensjonal 1 H NMR-baserte plattformer. En interessant drøfting av ulike analysemetoder tilgjengelig for metabolske profilering formål har vært nylig ble publisert av Ryan et al. 27.

    Levermetabolisme ble vurdert av ikke destruktive 1 H HR MAS NMR-spektroskopi. Denne metoden ble valgt fordi den ikke nødvendiggjør en ekstraksjon skritt som ødelegger vev og fører til oksidasjon av svært reaktive forbindelser som glutation. 1 H NMR-baserte metabolske profilering presenterer også fordelen av å tilby en vilkårlige metabolsk profil av biopsi. Det gjør dermed observasjon av et stort spekterav metabolitter dekker energisk, aminosyre, nukleotid, metylamin og oksidativt stress relaterte veier. Den eneste begrensningen er deteksjonsgrensen, som varierer i henhold til et sammensatt molekylære struktur. Faktisk er deteksjonsgrensen bestemt av den kjemiske (dvs. metabolitt) konsentrasjon samt antall protoner gi resonans peak og deres kjemiske miljø. Identifisering av metabolitt resonanser kan også være vanskelig basert på 1 H HR MAS NMR spektra alene og det er derfor anbefalt å utføre noen ekstra 2D NMR eksperimenter for å bekrefte oppdrag (dvs. J-løst, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC eksperimenter 28-30) 31,32. Denne 1 H HR MAS NMR teknikk er ofte brukt for metabonomic studier, i så fall bruk av multivariat statistikk (også kalt mønstergjenkjenning metoder) er nødvendig 33. The 1 H NMR-baserte metabolske profilering metoder beskrevet i denne protokollen har vært mye brukt til ulike biologiske forhold og er ikke begrenset til analysen av urinen og leveren prøver 34-36. Generell prøveopparbeidelse protokoller for NMR-baserte metabonomics har blitt gjennomgått av Beckonert et al. 18,37.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Vi har ingenting å avsløre.

    Acknowledgments

    Alle NMR spektra brukes som illustrerende eksempler er hentet fra en tidligere publisert studie 7 som var økonomisk støttet av Nestlé.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Table of specific reagents and equipment:
    2.5 mm microtube New Era NE-H5/2.5-V-Br
    1.7 mm capillary tube Sigma-Aldrich NORS175001
    Capillary adapter New Era NE-325-5/1.7
    Extraction rod New Era NE-341-5
    HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit Bruker Corporation HZ07213
    Tool kit for 50 μL inserts Bruker Corporation B2950
    Advance III 600 MHz NMR Bruker Corporation
    1H HR MAS NMR solid probe Bruker Corporation
    Deuterium oxide 99.9 % Sigma-Aldrich 530867-1L
    3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP) Sigma-Aldrich 269913

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Cani, P. D., Delzenne, N. M. Gut microflora as a target for energy and metabolic. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care. 10, 729-734 (2007).
    2. Ley, R. E., Turnbaugh, P. J., Klein, S., Gordon, J. I. Microbial ecology: human gut microbes associated with obesity. Nature. 444, 1022-1023 (2006).
    3. Raoult, D. Obesity pandemics and the modification of digestive bacterial flora. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 27, 631-634 (2008).
    4. Turnbaugh, P. J., Backhed, F., Fulton, L., Gordon, J. I. Diet-induced obesity is linked to marked but reversible alterations in the mouse distal gut microbiome. Cell. Host. Microbe. 3, 213-223 (2008).
    5. Balcombe, J. P., Barnard, N. D., Sandusky, C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp. Top. Lab. Anim. Sci. 43, 42-51 (2004).
    6. Muyzer, G., Smalla, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology. Antonie van Leeuwenhoek. 73, 127-141 (1998).
    7. Claus, S. P. Colonization-induced host-gut microbial metabolic interaction. MBio. 2, (2011).
    8. Waters, N. J. High-resolution magic angle spinning 1H NMR spectroscopy of intact liver and kidney: optimization of sample preparation procedures and biochemical stability of tissue during spectral acquisition. Anal. Biochem. 282, 16-23 (2000).
    9. Bollard, M. E. High-resolution 1H and 1H-13C magic angle spinning NMR spectroscopy of rat liver. Magnetic resonance in medicine. 44, 201-207 (2000).
    10. Lindon, J. C., Holmes, E., Nicholson, J. Pattern recognition methods and applications in biomedical magnetic resonance. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 39, 1-40 (2001).
    11. Tate, A. R. Distinction between normal and renal cell carcinoma kidney cortical biopsy samples using pattern recognition of (1)H magic angle spinning (MAS) NMR spectra. NMR. Biomed. 13, 64-71 (2000).
    12. Wang, Y. Topographical variation in metabolic signatures of human gastrointestinal biopsies revealed by high-resolution magic-angle spinning 1H NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 3944-3951 (2007).
    13. Meiboom, S., Gill, D. Modified spin-echo method for measuring nuclear relaxation times. The review of scientific instruments. 29, 688-691 (1958).
    14. Nicholson, J. K., Holmes, E., Wilson, I. D. Gut microorganisms, mammalian metabolism and personalized health care. Nat. Rev. Microbiol. 3, 431-438 (2005).
    15. Martin, F. P. Effects of probiotic Lactobacillus paracasei treatment on the host gut tissue metabolic profiles probed via magic-angle-spinning NMR spectroscopy. Journal of Proteome Research. 6, 1471-1481 (2007).
    16. Swann, J. R. Variation in Antibiotic-Induced Microbial Recolonization Impacts on the Host Metabolic Phenotypes of Rats. J. Proteome. Res. , (2011).
    17. Jacobs, D. M., Gaudier, E., van Duynhoven, J., Vaughan, E. E. Non-digestible food ingredients, colonic microbiota and the impact on gut health and immunity: a role for metabolomics. Curr. Drug. Metab. 10, 41-54 (2009).
    18. Beckonert, O. High-resolution magic-angle-spinning NMR spectroscopy for metabolic profiling of intact tissues. Nat. Protoc. 5, 1019-1032 (2010).
    19. Hooper, L. V. Methods in microbiology. Sansonetti, P., Zychlinsky, A. 31, Academic Press. 559-589 (2002).
    20. Rahija, R. J. Ch. 7. The mouse in biomedical research. Fox, J. G. , Academic Press. 217-234 (2007).
    21. Goodwin, B. L., Ruthven, C. R., Sandler, M. Gut flora and the origin of some urinary aromatic phenolic compounds. Biochemical Pharmacology. 47, 2294-2297 (1994).
    22. Koopman, J. P. 'Normalization' of germfree mice after direct and indirect contact with mice having a 'normal' intestinal microflora. Lab Anim. 20, 286-290 (1986).
    23. Nishikata, N., Shikata, N., Kimura, Y., Noguchi, Y. Dietary lipid-dependent regulation of de novo lipogenesis and lipid partitioning by ketogenic essential amino acids in mice. Nutrition and Diabetes. 1, 1-12 (2011).
    24. Spagou, K. A GC-MS metabolic profiling study of plasma samples from mice on low- and high-fat diets. J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci. 879, 1467-1475 (2011).
    25. Sanchez-Patan, F., Monagas, M., Moreno-Arribas, M. V., Bartolome, B. Determination of microbial phenolic acids in human faeces by UPLC-ESI-TQ MS. J. Agric. Food. Chem. 59, 2241-2247 (2011).
    26. Roux, A., Lison, D., Junot, C., Heilier, J. F. Applications of liquid chromatography coupled to mass spectrometry-based metabolomics in clinical chemistry and toxicology: A review. Clin. Biochem. 44, 119-135 (2011).
    27. Ryan, D., Robards, K., Prenzler, P. D., Kendall, M. Recent and potential developments in the analysis of urine: a review. Anal. Chim. Acta. 684, 8-20 (2011).
    28. Nagayama, K., Wuthrich, K., Bachmann, P., Ernst, R. R. Two-dimensional J-resolved 1H n.m.r. spectroscopy for studies of biological macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 99-105 (1977).
    29. Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. Two-dimensional spectroscopy. Application to nuclear magnetic resonance. J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1975).
    30. Bodenhausen, G., Ruben, D. J. Natural abundance 15N NMR by enhanced heteronuclear spectroscopy. Chemical. Physics. Letters. 69, 185-189 (1980).
    31. Fan, T. W. -M. Metabolite profiling by one- and two-dimensional NMR analysis of complex mixtures. Progress in nuclear magnetic resonance spectroscopy. 28, 161-219 (1996).
    32. Fan, T., Lane, A. Structure-based profiling of metabolites and isotopomers by NMR. Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy. 52, 48-48 (2008).
    33. Fonville, J. M. The evolution of partial least squares models and related chemometric approaches in metabonomics and metabolic phenotyping. Journal of Chemometrics. 24, 636-649 (2010).
    34. Merrifield, C. A. A metabolic system-wide characterisation of the pig: a model for human physiology. Mol. Biosyst. , (2011).
    35. Tugnoli, V. Molecular characterization of human gastric mucosa by HR-MAS magnetic resonance spectroscopy. International Journal of Molecular Medicine. 14, 1065-1071 (2004).
    36. Sitter, B. Comparison of HR MAS MR spectroscopic profiles of breast cancer tissue with clinical parameters. NMR Biomed. 19, 30-40 (2006).
    37. Beckonert, O. Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nat. Protoc. 2, 2692-2703 (2007).

    Tags

    Immunologi Germ-free dyr kolonisering NMR HR MAS NMR metabonomics
    Vurdere Nedsatt Metabolske endringer under Progressive Colonization of Germ-free Mouse av<sup> 1</sup> H NMR spektroskopi
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Heath, P., Claus, S. P. AssessingMore

    Heath, P., Claus, S. P. Assessing Hepatic Metabolic Changes During Progressive Colonization of Germ-free Mouse by 1H NMR Spectroscopy. J. Vis. Exp. (58), e3642, doi:10.3791/3642 (2011).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter