Bedömning av förändringar Nedsatt Metabola Under Progressiv koloniseringen av bakteriefri mus med ¹ H NMR-spektroskopi

Summary

En progressiv kolonisering förfarande beskrivs att ytterligare utvärdera dess effekter på värden levermetabolism. Colonization övervakas icke invasivt genom att utvärdera urinutsöndringen av mikrobiell samarbete metaboliter med hjälp av NMR-baserade metabolisk profilering medan levermetabolismen bedöms av tröjan Magiska Angle Spinning (HR MAS) NMR profilering av intakt biopsi.

Abstract

Det är väl känt att tarmbakterier bidra avsevärt till värden homeostas, vilket ger en rad fördelar såsom immun skydd och vitamin syntes. De levererar också värd en ansenlig mängd näringsämnen, vilket gör detta ekosystem en viktig metabolisk orgel. I samband med allt fler bevis om kopplingen mellan tarmfloran och det metabola syndromet, förstå den metaboliska interaktionen mellan värden och dess tarmfloran blir en viktig utmaning i modern biologi. ^1-4

Colonization (även kallad normaliseringsprocess) betecknar inrättandet av mikroorganismer i en tidigare bakteriefri djur. Även om det är en naturlig process som uppstår vid födseln, är det också ges till vuxna bakteriefri djur för att kontrollera tarmen blommor ekosystemet och ytterligare bestämma dess påverkan på värden ämnesomsättningen. Ett gemensamt förfarande för att kontrollera kolonisationen processen är att använda sondmatning metod med en single eller en blandning av mikroorganismer. Metoden ger en mycket snabb kolonisering och presenterar nackdelen med att vara extremt stressande ^5. Det är därför lämpligt att minimera stress och att få en långsammare kolonisering process för att följa successivt effekterna av bakteriell etablering på värden ämnesomsättningen.

I detta manuskript, beskriver vi ett förfarande för bedömning ändring av levermetabolismen under en successiv kolonisering process med hjälp av ett icke-förstörande tekniken metabolisk profilering. Vi föreslår att övervaka kolonisering tarmen mikrobiella genom att bedöma i tarmen aktivitet mikrobiell metabolism återspeglas i urinutsöndringen av mikrobiell samarbete metaboliter med ¹ H NMR-baserade metabolisk profilering. Detta möjliggör en uppskattning av stabiliteten i tarmen mikrobiell aktivitet utanför stallet inrättandet av tarmen mikrobiella ekosystem vanligtvis kontrolleras genom avföringen bakterier genom DGGE (denaturering elektrofores gradient gel). ⁶kolonisering sker i en konventionell öppen miljö och inleds med en smutsig kull som förorenats med konventionella djur, som fungerar som kontroller. Gnagare är coprophagous djur, säkerställer detta en homogen kolonisering som tidigare beskrivits. ⁷

Nedsatt metabolisk profil mäts direkt från en intakt leverbiopsi med ^ett H Hög Vinkel upplösning Magiska Spinning NMR-spektroskopi. Detta semikvantitativ tekniken erbjuder ett snabbt sätt att bedöma, utan att skada cellstruktur, huvudmetaboliterna som triglycerider, glukos och glykogen för att ytterligare uppskatta det komplexa samspelet mellan kolonisation processen och levermetabolismen ^7-10. Denna metod kan också tillämpas på alla vävnad biopsi ^11,12.

Protocol

1. Kolonisering av bakterie-fria djur och provtagning

1. Ta bort bakteriefri djur från isolatorer och hus dem i en konventionell djurhållning rum i burar utrustade med filter framför den konventionella djur som kommer att fungera som kontroller (Figur 1).
2. Blanda hälften av kullen (3 dagar gamla) som tagits från kontroll konventionella bur med strö av grodden-fria djur. Håll alltid 1 / 3 av det smutsiga konventionella kullen varje gång det är nödvändigt att förnya för att upprätthålla en nivå av bakterier (hålla det åtminstone för 3 dagar).
3. Samla urin i en 1,5 ml mikrorör genom att hantera musen över röret och hjälp urinering genom att försiktigt massera tarmen. Snap-fryser omedelbart i flytande kväve. Förvaras vid minst -40 ° C tills NMR-analys. En minsta volym av 20 mikroliter krävs för förvärvet med en 5 mm NMR-sond, men det rekommenderas att använda 30 mikroliter att förbättra kvaliteten av metabol profilering.
4. Djur bör Be avlivas utan användning av bedövningsmedel för att undvika felkällor NMR resonanser på grund av nedsatt metabolism av bedövning föreningar (till exempel använda halsdislokation följt av bekräftelse död genom exsanguination)

2. Rekommendation för insamling av leverbiopsi

1. Använd inte någon produkt som innehåller alkohol för att undvika kontaminering. Tvätta verktyg med hjälp av enbart vatten eller saltlösning.
2. Inte perforera gallblåsa. I händelse av galla läcka, tvätta vävnad omedelbart med vatten eller saltlösning.
3. Samla leverbiopsier (ca 15-50 mg) från vänster lob som visas i Figur 2. För reproducerbara biopsier, samla konsekvent i mitten av den vänstra lob undvika perifera områden där vävnad är tunnare.
4. Snap frysa biopsier i flytande kväve omedelbart och förvara dem vid -80 ° C tills NMR-analys.

3. ¹ H NMR förvärv av urin microvolume

Bered 0,2 natriumlösning fosfatbuffert i D2O (99,8%), pH 7,4 innehållande 1 mm 3 - (trimetylsilyl) propionsyra-D ₄ (TSP).

Blanda 30 mikroliter urin med 30 mikroliter av natrium fosfatbuffert.

Överför 50 mikroliter av blandade lösningen i 1,7 mm NMR kapillärrör (Figur 3 (2)) med hjälp av en 50 mikroliter glas spruta försedd med en metall nål (OD 0,5 mm). Var försiktig för att undvika bubblor.

Montera kapillär-adapter (Figur 3 (3)) ovanpå den kapillära innehåller urin prov och placera den i en 2,5 mm NMR mikrorör för 5 mm NMR-sond (Figur 3 (1)). Använd denna kombination av tuber som en vanlig 5 mm NMR slang för spektrala förvärvet.

Använd utvinning staven (Figur 3 (4)) för att ta bort kapillära från 2,5 mm NMR-röret genom att skruva kapillär adaptern försiktigt dra ut det.

. 4 ¹ H HR-MAS NMR av levervävnad biopsi: provberedning

1. MAS rotorkomponenter verktygbeskrivs i Figur 4.
2. Sätt biopsi (ca 15-50 mg) till zirkonium rotorn (Figur 4) (1) och fyll resten av volymen med ren D ₂ O för NMR lås. Var noga med att inte göra några bubblor eftersom detta skulle förändra kvaliteten på efterföljande mellanlägg och kvaliteten på datainsamling.
3. Sätt 50 mikroliter Teflon spacer (Figur 4 (2)) med hjälp av cylindriska skruven (Figur 4 (5)). Skruva loss den och kalibrera den med hjälp av djupmått på kortsidan (Figur 4 (8)). I detta steg är det viktigt att betala en särskild uppmärksamhet på prov eftersom en del av det kan läcka genom spacer hålet. Om så är fallet, då en del av biopsi förstörs och provets vikt är inte längre tillförlitlig. Det är därför nödvändigt att börja om från början förberedelserna av provet.
4. Placera THEAD stift (Figur 4 (3)) och skruva fast det försiktigt med skruvmejsel (Figur 4 (6)). Torka ut eventuellt kvarvarande vatten med en bit vävnad.
5. Placera locket (bild 4 (4)) vidtoppen av rotorn och sätta in den i rotorn packare (Figur 4 (6)). Tryck bestämt tills locket är på plats. Det ska inte finnas något utrymme kvar mellan rotor och lock.
6. Markera hälften av botten av rotorn med hjälp av en svart tuschpenna för att möjliggöra optisk detektion spinn.
7. Placera rotorn inuti NMR-spektrometer och börja snurra vid 5 kHz. Förvärva ¹ H NMR-spektrum med CPMG pulssekvens ¹³ enligt tillverkarens anvisningar.
8. Använd α anomera glukos resonans vid 5,22 ppm (dublett) för att kalibrera NMR-spektra.
9. Att packa upp rotorn, fortsätt genom att ta bort locket med hjälp av locket plockaren (Figur 4 (9)). Skruva THEAD stift och ta bort Teflon spacer med cylindriska skruv. Tvätta ordentligt med vatten och diskmedel.

5. Representativa resultat

Gut mikrobiell aktivitet kan övervakas med hjälp av urin metabolisk profilering. Ett stort antal urin mikrobiellco-metaboliter identifieras av ¹ H NMR har beskrivits i litteraturen ^7,14-17. Dessa mikrobiell co-metaboliter är särskilt användbara för att övervaka kolonisationen processen eftersom de ger en snabb och icke-invasiv sätt att uppskatta när det nybildade ekosystemet är stabil. Figur 5a visar tydligt intryck av tarmen mikrobiell samarbete metaboliter över koloniseringen processen. Denna siffra visar en urin metabol profil som erhålls genom att följa det förfarande som beskrivs i Steg 2 för ett djur koloniserade 20 dagar med hjälp av anvisningarna i steg 1. Detta djur har inte utsöndrar någon indoxyl sulfat och mycket lite mängd phenylacetylglycine (PAG) och p-kresol sulfat vid bakteriefri state (dag 0-blå). Som kolonisering fortskrider, dessa 3 markörer av protein metabolism av tarmfloran öka betydligt för att nå en jämvikt vid dag 20 (röd). Detta är särskilt lätt att följa för en grupp av djur som visas i Figur 5B med PAGresonans. Detta diagram erhölls genom att integrera området under resonanser markerade med grått i figur 5A (δ 7,40-7,43), vilket motsvarar en viss resonans (triplett) av PAG för en grupp av 7 djur.

¹ H Hög upplösning Magiska Angle Spinning (HR MAS) NMR-spektroskopi är en icke förstörande teknik som möjliggör snabb och reproducerbar förvärv av metaboliska profiler av någon typ av biopsi ^18. I detta protokoll använde vi denna kraftfulla teknik för att få en profil nedsatt metabolisk av 2 möss före (blå) och efter (röd) kolonisation (Figur 6). Denna siffra illustrerar väl den information som kan härledas från ett MAS NMR-baserad metabola profil. Många aminosyror samt metaboliter från energisk metabolism, såsom glukos, glykogen, laktat, triglycerider (D)-3-hydroxybutyrate och nicotinurate kan visualiseras. Dessa profiler innehåller också information av betydelse för oxidativ stress (dvs askorbinsyra encid, glutation), nukleotid metabolism (dvs inosin, uridin) och metylamin metabolism (dvs kolin, trimetylamin-N-oxid). I detta exempel är det mycket tydligt att bakteriefri mus visar nästan inget glykogen och mycket små mängder av glukos och triglycerider som har tidigare publicerats ^7.

Figur 1. Översikt över kolonisering protokollet. Bakteriefri och konventionella djuren hålls i burar försedda med filter sida vid sida och deras kullar utbyts att tillåta progressivt kolonisering från den konventionella tarmfloran (1). Gut mikrobiell aktivitet övervakas med hjälp av ^en H NMR-baserade metabolisk profil (2-3). Levermetabolismen bedöms av ^en H HR MAS NMR-baserade metabolisk profil (4-5).

Figur 2. Mus borr anatomi. Levern visas som den platta sidan av orgeln ansikten bordet. För reproducerbara biopsier, är det tillrådligt att alltid samla in prover från mitten av den vänstra lob vilket framgår av den streckade rektangeln.

Figur 3 1,7 mm NMR kapillär kit att arbeta med microvolumes Nyckel:.. 1: 2,5 mm NMR mikrorör, 2: 1,7 mm NMR kapillärrör, 3: Kapillär adapter, 4: Extraction spö.

. Figur 4 MAS rotor utrustning Nyckel: 1.: MAS rotor, 2: 50 mikroliter Teflon spacer, 3: THEAD pin, 4: mössa, 5: cylindrisk skruv, 6: skruvmejsel, 7: rotor förpackare, 8: djupmått.

Figur 5. Utveckling av urin metaboliska profiler under colonization.

1. Zoom på aromatiska region i spektrat mellan 6,8-7,8 ppm, där mikrobiell samarbete metaboliter kan visualiseras. ¹ H NMR-spektra härrör från en enda individ vid dag 0 (blå), 4 (grön), 15 (orange) och 20 (röd) efter kolonisationen. Den grå zonen motsvarar det område som var integrerade för att göra diagram i B. Nyckel: 1-MeHistamine: 1-methylhistamine, indoxyl-S: indoxyl sulfat, Hans: histidin, p-kresol-S: p-kresol sulfat, PAG : Phenylacetylglycine.
2. Genomsnittlig PAG koncentrationen under kolonisationen (n = 7). Students t-test användes för att jämföra skillnaden i PAG koncentration vid olika tid-punkter: a: p <0,05 jämfört med dag 0, b: p <0,01 jämfört med dag 10.

Figur 6. Typisk 600 ^MHz-1 H HR-MAS NMR-spektra av leverbiopsier från bakteriefri (blå) och ex-bakteriefri (återd) möss. Fet protoner är ansvariga för triglycerider resonans Key:. 3-HB: 3-hydroxybutyrate, GSH: reducerat glutation, TGS: Triglycerider, TMAO: trimetylamin-N-oxid.

Discussion

I detta protokoll, beskrev vi en progressiv kolonisering förfarande i en öppen miljö för att ytterligare undersöka effekten av tarmfloran om levermetabolism bedömas av ^en H HR-MAS NMR profilering av intakt biopsi. Olika metoder för kolonisering har beskrivits i litteraturen. De vanligaste metoderna för att kolonisera djur med ett definierat mikrobiota är oral sondmatning eller förorenat dricksvatten ^19,20. Fekal inokulationen kan också användas som tidigare beskrivits ^21. Koloniseringen metod som presenteras här kommer från en "normalisering" metod för bakteriefri djur som beskrivs av Koopman JP et al. 1986 ^22. I denna publikation, placerade författarna en levande konventionella djur i isolatorn bland bakteriefri djur. Det är dock inte alltid möjligt att hålla djuren i isolatorer, särskilt om de måste manipuleras under kolonisationen processen (detta är särskilt svårt om prov ColleInsatser krävs). Ett alternativ är därför att huset före bakteriefri djur i en konventionell öppen miljö i närvaro av kullen som förorenats med konventionella djur som kommer att användas som kontroller. På detta sätt är djur manipulation för att kolonisation minimala och detta resulterar i mindre stress än oral sondmatning. Denna metod ger också en progressiv kolonisering av tarmen som ligger närmare en naturlig kolonisering process och ger en homogen kolonisering av djur som delar samma bur som bevisas av DGGE (Denaturering Gradient gelelektrofores) bedömning av mikrobiella DNA-profiler (finns som kompletterande material i Claus et al. ^7).

Övervakning av kolonisering genom att urin metabolisk profilering är en icke-invasiv, lätt, snabbt och effektivt sätt att upptäcka när den mikrobiella aktiviteten blir stabil. Eftersom det inte är nödvändigt att manipulera djur varje dag för detta ändamål, som visas i figur 5B, är stressnivån hålls påsitt minimum. Det är anmärkningsvärt att nämna att även om kolonisering initieras av en kull som förorenats med konventionella djur i kontrollgruppen, är det nödvändigt att hålla ett lika stort antal av dessa djur i kontrollgruppen, som kommer att tillåta en att uppskatta blandade effekter av stress och åldrande på levermetabolism. Andra tekniker baserade på masspektrometri (MS) som GC-MS (gaskromatografi) eller LC-MS (Liquid Chromatography) kan också användas för att bestämma urin mikrobiell samarbete metaboliter samt att erhålla en metabol profil av flytande prover (dvs. urin, plasma, vävnader extrakt), men de kan inte appliceras på intakt vävnad biopsi. GC-MS har framgångsrikt tillämpats på riktade analyser av stabila flyktiga fettsyror ^23. Denna teknik kräver en derivatisering steg som introducerar systematiska fel som måste övervägas noga vid dataanalys ^24. LC-MS kan vara särskilt användbart för att förbättra upptäckten av mikrobiell co-metaboliter i riktade profilering ^25. Även omoriktade LC-MS metabolisk profil avsevärt förbättrar känslighet för låg koncentration metaboliter, kan identifikation vara svårt och ett stort antal upptäckta metaboliter kan vara lediga ^26. Därför har de flesta av de oriktade metabonomic studier som utförts med hjälp av en endimensionell ¹ H NMR-baserade plattformar. En intressant diskussion om de olika analysmetoder som finns tillgängliga för metabolisk profilering ändamål har nyligen publicerats av Ryan et al. ^27.

Levermetabolismen bedömdes av icke förstörande ¹ H HR-MAS NMR-spektroskopi. Denna metod har valts eftersom den inte kräver en extraktionen som förstör vävnaden och leder till oxidation av mycket reaktiva föreningar såsom glutation. ¹ H NMR-baserade metabolisk profilering presenterar även den fördelen att en oriktade metabola profil biopsi. Det gör alltså observation av ett stort antalav metaboliter som täcker energisk, aminosyra, nukleotid, metylamin och oxidativ stress relaterade vägar. Den enda begränsningen är detektionsgränsen som varierar beroende på ett substansens molekylstruktur. Det är detektionsgränsen bestäms av den kemiska (dvs metabolit) koncentration och antalet protoner ger resonans topp och deras kemiska miljö. Identifiering av metaboliten resonanser kan också vara svårt baserat på ¹ H HR-MAS NMR-spektra ensam och det är därför rekommenderas att utföra några extra 2D NMR-experiment för att bekräfta uppgifter (dvs J-löst, COSY, TOCSY, HSQC, HMBC experiment ^{28-30) 31,32.} Denna ¹ H HR-MAS NMR teknik vanligen används för metabonomic studier, i vilket fall användning av multivariat statistik (även kallad mönsterigenkänning metoder) är nödvändig ^33. Den ¹ H NMR-baserade metabolisk profilering metoder som beskrivs i detta protokoll har i stor utsträckning tillämpas på olika biologiska förhållanden och är inte begränsade till analysen av urin och prover lever ^34-36. Allmänna provberedning protokoll för NMR-baserade metabonomik har granskats av Beckonert et al. ^18,37.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Table of specific reagents and equipment:
2.5 mm microtube	New Era	NE-H5/2.5-V-Br
1.7 mm capillary tube	Sigma-Aldrich	NORS175001
Capillary adapter	New Era	NE-325-5/1.7
Extraction rod	New Era	NE-341-5
HR-MAS rotor BL4 with 50 μL spherical Teflon spacer kit	Bruker Corporation	HZ07213
Tool kit for 50 μL inserts	Bruker Corporation	B2950
Advance III 600 MHz NMR	Bruker Corporation
1H HR MAS NMR solid probe	Bruker Corporation
Deuterium oxide 99.9 %	Sigma-Aldrich	530867-1L
3-(trimethylsilyl)propionic acid-d4 (TSP)	Sigma-Aldrich	269913