Summary
טיהור טנדם הזיקה היא גישה חזקה לזיהוי של שותפים חלבון מחייב. כהוכחה של המושג, מתודולוגיה זו יושמה כדי eIF4E היטב מאופיין ייזום גורם תרגום המשקע שיתוף סלולריים גורמים המארחות מעורב בייזום תרגום. שיטה זו היא להתאים בקלות לכל חלבון רצוי נייד או ויראלי.
Abstract
שלב קריטי ולעיתים קרובות הגבלת בהבנת תפקידו של המארח חלבונים נגיפיים הוא זיהוי של אינטראקציה שותפים חלבונים תאיים או ויראלי. ישנן גישות רבות המאפשרות את הזיהוי של בני הזוג אינטראקציה, כולל מערכת שמרים 2 היברידית, כמו גם למשוך את מבחני באמצעות חלבונים רקומביננטי ו immunoprecipitation של חלבונים אנדוגניים ואחריו זיהוי ספקטרומטריית מסה 1. מחקרים שנעשו לאחרונה הדגיש את התועלת של טיהור פעמיים זיקה בתיווך תג, יחד עם שני צעדים elution ספציפיים זיהוי של חלבונים אינטראקציה. גישה זו, כינה טנדם טיהור זיקה (TAP), שימש בתחילה בשמרים 2,3 אך לאחרונה הותאם לשימוש בתאי יונקים 4-8.
כהוכחה מושג של הקמנו טיהור זיקה טנדם (TAP) שיטה באמצעות היטב מאופיין אוקריוטים תרגום ייזום FACטור eIF4E 9,10. eIF4E הסלולרי גורם התרגום הוא מרכיב קריטי של המתחם eIF4F הסלולר מעורב בייזום יתר תלויה התרגום 10. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס Etch טבק (TeV) מחשוף רצף פרוטאז. תג TAP השתמשו במחקר הנוכחי מורכב משני יחידות ז חלבון פפטיד מחייב streptavidin מופרדים על ידי וירוס טבק Etch (TeV) מחשוף פרוטאז רצף 8. לוותר על הצורך של הדור של שורות תאים משובטים, פיתחנו שיטה מהירה שמסתמכת על הביטוי של החלבון-TAP מתויג הפיתיון מן הפלסמיד שמרו episomally מבוסס על pMEP4 (Invitrogen). ביטוי eIF4E Murine מתויג מזה פלסמיד נשלט באמצעות קדמיום כלוריד מושרה האמרגן metallothionein.
תמוגה של התאים המבטאים וטיהור זיקה לאחר מכן באמצעות קשירה Rabbit IgG agarose, מחשוף TeV פרוטאז, קשירה streptavidin agarose צמודות elution ביוטין לאחר מכן זיהו חלבונים ספציפיים רבים, ככל הנראה, eIF4E הנפתח (בהשוואה לשלוט שורות תאים המבטאים את תג TAP לבד). זהותם של חלבונים התקבלו על ידי כריתה של להקות מ 1D ספקטרומטריית SDS-PAGE ובעקבות המוני במקביל. המרכיבים שזוהו כללו את החלבונים eIF4E ידועים מחייבים eIF4G ו 4EBP-1. בנוסף, רכיבים אחרים של המתחם eIF4F, מתוכם eIF4E הוא מרכיב זוהו, כלומר eIF4A פולי ו-חלבון מחייב. היכולת לזהות לא רק בני זוג ידועים מחייבים ישיר, כמו גם חלבונים אינטראקציה משניים, מדגישה עוד יותר את התועלת של גישה זו באפיון של חלבונים של תפקוד לא ידוע.
Protocol
1. דור של שורות תאים: pMEP4 transfection / ביטוי
- Transfect תאים עם וקטור pMEP4 ביטוי ובחר עם 100 מיקרוגרם של hygromycin B / מ"ל (Roche) עד שכל התאים transfected מדומים נהרגו מעל. PMEP4 פלסמיד נשמר episomally כך שאין צורך לבודד שיבוטים ספציפיים.
- התאים המכילים את הווקטור pMEP4 יכול להיגרם על ידי טיפול עם 10 מיקרומטר CdCl 2 במשך 16 שעות. הביטוי inducibility חייבת להיות מאושרת על בקנה מידה קטן לפני הגברה של שורות תאים. חלבון סטפס מתויג ניתן לאתר בקלות כמו חלבון תחומים ז לאגד נוגדנים מ כמעט כל המינים. עבור בקנה מידה גדול purifications בדרך כלל 10 confluent 175 ס"מ 2 צלוחיות של תאים נדרשים. זה משווה ל כ 2 X10 8 תאים המבטאים.
2. Lysate תא הכנה
- מגרדים תאים לתוך PBS ולשלב לתוך צינור אחד 50 מ"ל. ספין 1200X GFאו 5 דקות (זה אמור להוביל 2-3 מ"ל של תאים דחוסים בתור התחלה, אשר מפחית עד כ - 1.5 מ"ל לאחר שטיפה).
- שוטפים את התאים שלוש פעמים קרה כקרח PBS (50 MLS בכל פעם).
- Lyse תאים במאגר 5 מ"ל תמוגה (50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 מ"מ NaCl, גליצרול 5%, 0.2% NP-40, 1.5 מ"מ MgCl 2, 25 מ"מ NAF, 1 mM Na 3 VO 4 ו מעכב פרוטאז ). הערה: NAF, Na 3 VO 4 ו מעכבי פרוטאז יש להוסיף טרי. פיפטה למעלה ולמטה 10 פעמים לפני היציאה במשך 5 דקות על קרח. מזרק מעלה מטה 5-10 פעמים באמצעות מחט קהה לפני שעזב שוב על קרח למשך 5 דקות על קרח. חזור על syringing ולהשאיר במשך 5 דקות נוספות על קרח.
- להקפיא להפשיר lysate פעמיים (קרח נוזלי N 2 / או יבש אתנול). אל תאפשר מדגם להגיע יותר מ 4 ° C. הערה: ניתן לאחסן את המדגם ב -80 ° C עד שיש לך זמן לעבד.
- Aliquot מדגם לתוך צינורות 1.5 מ"ל ולהסיר תאים unlysed ו-Debris על ידי צנטריפוגה (10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס, 16,000 X ז).
- שחזור supernatant, לשלב צינור 15 פלקון מ"ל ו (אופציונלי) לעבור כמה 0.45 מיקרומטר סינון לפני נטילת דגימה של 20 μl כימות תשואה חלבון. הסר aliquot עוד 50 μl לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 1).
3. קשירה הארנב IgG-agarose
(הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת)
- בעדינות resuspend IgG-agarose ארנב פתרון (Sigma-Aldrich) על ידי מתערבל בבקבוק. קח 380 μl של IgG agarose (באמצעות קצה לחתוך 1ml פיפטה) ולהסיר משלוח / פתרון משמר ידי צנטריפוגה דקה 1. לשטוף שלוש פעמים agarose במאגר תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. התשואה הסופית של agarose צריך להיות בערך 250 μl של חרוזים ארוזים.
- הוסף lysate תא פינה מ -2.6 (ב אמבט 15 מ"ל הבזה) כדי שטוף הארנב-IgG agarose ו דגירה במשך 3 שעות (או לילה) בשעה 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב.
- לסובב את החרוזים agarose במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 2). הערה: TAP מתויג חלבון אמור להיות מזוהה עם החרוזים.
4. TeV מחשוף פרוטאז
(הערה: ספינים כל צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4oC דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת)
- לשטוף את הארנב IgG חרוזים agarose שלוש פעמים חיץ תמוגה צונן (4 ° C) באמצעות צנטריפוגה להבהיר (הערה: מאגר תמוגה לא יכילו מעכבי פרוטאז). יש להיזהר שלא להסיר או לאבד את כל החרוזים במהלך השלבים כביסה.
- לשטוף את החרוזים כמה עוד פעמיים עם חיץ TeV-פרוטאז המחשוף (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 מ"מ NaCl, ו -0.2% NP-40) באמצעות צנטריפוגה להבהיר. לאחר שטיפת האחרון בזהירות להסיר את כל liפאונד מן החרוזים.
- להכין תערובת TeV מחשוף פרוטאז, עבור מדגם זה כולל 467.5 μl H 2 O, 25 μl 20x TeV חוצץ (Invitrogen), 5 μl 0.1M DTT ו -2.5 μl (25 U) TeV פרוטאז (Invitrogen). הוסף 500 μl של תערובת זו מחשוף TeV מדגם זה של חרוזים ארז ולהעביר את התערובת כולה צינור 1.7 מראש משומנים מ"ל (שחקן המשנה). לפני הדגירה להסיר aliquot μl 30 לניתוח שלאחר מכן (דוגמה 3).
- דגירה התגובה פרוטאז TeV לילה ב 4 ° C בעזרת מערבל מסתובב. שים לב קצרים יותר פעמים incubations ניתן להשתמש בהתאם לאופי של חלבון הפיתיון את הנגישות של האתר מחשוף TeV פרוטאז אבל הפעם הדגירה מינימלית יש לקבוע באופן אמפירי.
5. קשירה Ultralink streptavidin ללא יכולת לזוז פלוס חרוזים
(הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת)
6. ביוטין elution של פפטיד מחייב streptavidin וחלבון הפיתיון
(הערה: כל הספינים צריך להתבצע גרם 1200X בצנטריפוגה בקירור ב 4 ° C למשך דקה 1, אלא אם כן צוין אחרת)
- Elute החלבונים המתויגים מן חרוזים streptavidin על ידי הוספת 500 μl של PBS: ביוטין (1 mM D-ביוטין) ו דוגרים על 4 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (או לילה) בעזרת מערבל מסתובב.
- לסובב את החרוזים streptavidin במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס ולהסיר supernatant לצינור מ"ל 1.5 מראש משומנים (הערה: מדובר במדגם הסופי / elution (דוגמה 7).
- להוסיף עוד 500 ביוטין μl: PBS על חרוזים streptavidin הנותרות דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 2-3 שעות (או לילה) בעזרת מערבל מסתובב.
- מחדשכבול לשלב 6.2 ולשלב שני elutions (דוגמה 7). Elution זו הסופי ניתן לאחסן ב -80 ° C.
- כדי להעריך את היעילות של elution ביוטין, להקפיא את החרוזים streptavidin הנותרים ומרתיחים לאחר מכן במאגר מדגם SDS (לדוגמא 8) (המלצות: LaneMarker מדגם 5x חיץ בין הפחתת פישר).
7. ריכוז החלבון
- Eluate הסופי (לדוגמא 7) צריך להיות מרוכזים לקראת ניתוח בשל ריכוז החלבון נמוכה בנפח גבוה יחסית. זה יכול להשיג באמצעות משקל מולקולרי נמוך (פחות מ 5 KDA) עמודות Vivaspin ספין (Vivascience). במטרה לרכז את עוצמת הקול כדי μl פחות מ 100. מדגם זה האחרון ניתן להרתיח ומאוחסנים במאגר מדגם חלבון (המלצות: 5x LaneMarker צמצום מדגם חיץ בין פישר).
8. אנליזה
- דוגמאות 1-8 יכול להיות מנותח על ידי כתם המערבי כדי לקבוע את היעילות של לנתץ. הערה: נוגדנים משני ביותר יהיהצולבות להגיב עם חלבון ה-G תחומים של חלבון איחוי אבל זה הוסר לאחר המחשוף פרוטאז TeV.
- לדוגמא 7 ניתן לנתח על ידי 1D או 2D SDS-PAGE. צביעה ניתן לבצע באמצעות כסף או Coomassie (המלצות: מכתים SilverQuest כסף קולואידיות ערכות כחול Coomassie צביעה של Invitrogen). זיהוי החלבון ניתן לבצע באמצעות ספקטרומטר מסה.
9. נציג תוצאות
דוגמה של ניתוח SDS-PAGE 1D של elution הסופי (לדוגמא 7) מ פרוטוקול זה לזהות שותפים מחייב של eIF4E TAP מתויג מסופק באיור 2. זה ג'ל נציג משקף את האופי המורכב ורב של אינטראקציות eIF4E עם חלבונים אחרים בתא. השוואה עם שליטה שלילי הראו גם באיור 2, שנוצר מקו תא להביע רק את תג ברז, ממחישה את הייחודיות של eIF4E זה התגרה הנפתח. ב 15% זה המופע של elution הסופי מרוכז (לדוגמא7) נותח על ידי SDS-1D באמצעות זמינים מסחרית מראש יצוק ג'ל הדרגתיים לפני מוכתמים באמצעות מכתים כסף Silverquest ערכת מן Invitrogen.
בדרך כלל 50-85% הנותרים של elution הסופי מרוכז (לדוגמא 7) הוא ניתח עם Coomassie Colloidal כתם (Invitrogen). דוגמאות (פרוסות ג'ל / להקות) מהנתיב כל חולצו ואז ונותחו על ידי ספקטרומטר מסה.
החלבונים שזוהו eIF4E הנפתח סוננו נגד השותפים מחייב משליטת שלילית לזהות שאינם ספציפיים שותפים מחייב. החלבונים הסופיים זוהו באמצעות תהליך של תיוג eIF4E TAP ניתן לראות באיור 2, שהוא נציג של חלבונים רגילים שזוהו באמצעות טכניקה זו. כמו כן, מספר יחידות משנה את eIF3 זוהו גם (מידע לא מוצג).
באיור 1. סכמטי שלבמקביל הליך זיקה טיהור. צעד 6 טנדם זיקה טיהור (TAP) פרוטוקול כרוך קו תא הדור, תמוגה התא, שפן IgG agarose חיסונית רטיבות, מחשוף TeV פרוטאז, streptavidin טיהור חרוז זיקה ו elution ביוטין לבסוף.
איור 2. טנדם טיהור הזיקה של חלבון eIF4E Murine. אינטראקציה שותפים של N סופני הקשה על מתויג eIF4E טוהרו מ HEK293 התאים האיקריוטים באמצעות פרוטוקול המצורף. חלק 20% elution הסופי (לדוגמא 7) נותח על ידי-SDS על הג'ל יצוקה שיפוע 4-12% (TAP-eIF4E נתיב). ניתוח דומה בוצע עבור תג בלבד (מסלול TAP). חלבונים זוהו באמצעות צביעת כסף. החלבונים שזוהו לאחר מכן על ידי ספקטרומטריית מסה של מדגם זהה מודגשים על ג'ל זה.
קיצורים: eIF4G; אוקריוטים התחלת התרגום פריץ4 גמא שחקן, PABP, חלבון פולה מחייב, eIF4A: תרגום אוקריוטים ייזום גורם 4 אלפא, SBP-eIF4e: TAP הנותרים הפיתיון חלבון המכיל את פפטיד מחייב streptavidin התמזגו כדי 4E תרגום אוקריוטים ייזום גורם, 4EBPs, תרגום אוקריוטים ייזום 4E גורם מחייב חלבונים, ייזום eIF4eNiF1l אוקריוטים התרגום גורם 4E גרעינית יבוא גורם 1, SBP, פפטיד streptavidin שנותר מחייב מ פפטיד TAP TeV unfused.
Discussion
תיוג TAP אייר הטכניקה כאן מדגים שיטה ספציפית מאוד מחמירים של בידוד השותפים מחייב של חלבונים בתאים האיקריוטים הפיתיון. גישה זו ניתן ליישם גם חלבונים תאיים ווירוסים. למיטב ידיעתנו, זוהי הפעם הראשונה כגון טכניקת הוחל eIF4E התחלת התרגום גורם. זיהוי eIF4G ידוע eIF4E חלבונים מחייב את 4EBPs באמצעות טכניקה זו מאשרת את תקפותה של גישה כזאת. בנוסף, זיהוי של הרכיב הנותר של המתחם eIF4F, כלומר eIF4A, ו PABP מאשר כי האינטראקציה עקיפה מתחמי שלישוני נותרו על כנן במהלך תהליך טיהור. זיהוי isoforms מרובות של החלבונים קנוניים מחייב eIF4e ניכרה גם. אלה מתוארים בפירוט רב יותר באיור 2.
לגבי המגבלות של הגישה, טיפול מסוים יש לנקוט לגבי הבחירהשל חלבון הפיתיון ואם לא למקם את תג TAG ב-N-C או הסופית. זה יכול להיות מומלץ לבצע assay תפקודית או לבחון את הלוקליזציה של החלבון היתוך על ידי מיקרוסקופ לפני טיהור בהיקף מלא כדי להבטיח את הנגזרת מתויג הוא פונקציונלי. קרום נפרד או חלבונים גרעיני לא בהכרח שפורסמו על ידי התנאים חומר ניקוי עדין יחסית המתוארים בשלב תמוגה. כמו בכל immunoprecipitations ו דומים הנפתח מבחני, שינוי יכול להתבצע לטבע ריכוזים של חומר ניקוי במאגר תמוגה כדי להגביר את היעילות של תמוגה. ריכוז יוני של מאגרים תמוגה ולהתרחץ גם להיות שונה כדי להגדיל או להקטין את ההחמרה של טיהור. כמו כן ניתן לבצע טיהור ראשוני בתנאים קלים רגילים (כמתואר לעיל), אך לאחר מכן מחלקים את החרוזים streptavidin (סעיף 5.8) לתוך aliquots 4-5, שיכולים לאחר מכן להיות שטופים תחת קון יונית הגדלתditions. זה עשוי לאפשר למשתמש לזהות את התנאים האופטימליים, כי להסיר שאינם ספציפיים חלבונים אינטראקציה. התהליך כולו עשוי גם להתבצע באמצעות transfection חולף שבו השותפים באינטראקציה ידועים ונוכחותם או היעדרם נקבע על ידי כתם המערבי לאחר מכן בלבד. במקרה זה הייתי מציע שתי מנות של 100 ס"מ 2 תאים כל transfected עם מיקרוגרם 8 הביטוי פלסמיד. הליך זה שונה הוא השימוש בפרט כאשר בוחנים את היכולת של נגזרים מוטציה של חלבון TAP-Fusion לתקשר עם בני זוג ידועים מחייב.
ניתוח הדגימות 1 עד 8 על מוכתמים כסף SDS-עמוד ג'ל (או על ידי כתם המערבי אם נוגדן זמין) היא דרך מצוינת של פתרון בעיות, טכניקה לא תצליח להפיק תוצאות מתקבלות על הדעת. היעילות של משקעים כל זיקה מבוסס elution ספציפי ניתן לנתח שימוש בגישה זו דגימה שיטתית. דוגמאות אחד עד שמונה יש לנקוט במהלך optimשנפלו על הקרקע הפורייה של פרוטוקול לפיתיון כל חדש.
הטכניקה תיוג TAP מספק אלטרנטיבה חזקה ויציבה לגישות אחרות כגון GST למשוך ומורדות, שמרים שני מבחני היברידיות וכו 'טיהור זיקה כפולה צעדים elution ספציפיים (מחשוף TeV ו elution ביוטין) לספק הספציפיות להחמיר כדי להישמר רמה גבוהה לאורך כל תהליך טיהור. קשה טכניקה זו ניתן להחיל על כל חלבון ולכן מייצג שיטה מצוינת לזיהוי שותפים מחייב עבור היעד חלבון של עניין.
Disclosures
אין ניגוד עניינים הצהיר.
Acknowledgments
מחקר זה מומן על ידי עמיתי הקרן Wellcome בכיר הוענק לד"ר איאן גודפלו.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 | |
| Rabbit IgG Agarose | Sigma-Aldrich | A2909 | |
| AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce, Thermo Scientific | 53116 | |
| Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 | |
| SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| Microcapillary pipette tips | VWR international | 37001-150 | |
| NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX | |
| CdCl2 | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| 5x SDS Sample Buffer | Fisher Scientific | PN39000 |
References
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Blackwell, C., Brown, J. D. The application of tandem-affinity purification to Candida albicans. Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).
- Cochrane, A. Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function. Virology. 388 (1), 103-111 (2009).
- Fernandez, E. Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins. Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).
- Gloeckner, C. J. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag. Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).
- Holowaty, M. N. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).
- Burckstummer, T. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E. EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).
- Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. Eukaryotic initiation factor 4E. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).
