Summary
Tandem affinitetsoprensning er en robust fremgangsmåde til identifikation af protein-bindende partnere. Som proof of concept, blev denne metode anvendt på velkarakteriserede translationsstart faktor eIF4E til co-bundfald værtscellesystemerne faktorer involveret i oversættelse initiering. Denne fremgangsmåde kan let tilpasses til enhver cellulært eller viralt protein.
Abstract
En kritisk og ofte begrænsende trin i forståelsen af funktionen af værten og virale proteiner er identifikationen af interagerende cellulære eller virale protein partnere. Der er mange fremgangsmåder, der tillader identifikation af interagerende partnere, herunder gær-to hybrid-system samt nedbryde assays under anvendelse af rekombinante proteiner og immunopræcipitation af endogene proteiner, efterfulgt af massespektrometri identifikation 1. Nylige undersøgelser har vist nytten af dobbelt-affinitetsmærke medieret rensning, kombineret med to specifikke elueringstrin i identifikationen af interagerende proteiner. Denne fremgangsmåde, betegnet Tandem Affinitetsoprensning (TAP), blev oprindeligt anvendt i gær 2,3, men mere nylig er blevet tilpasset til brug i pattedyrceller 4-8.
Som proof-of-concept har vi etableret en tandem affinitetsrensningen (TAP), der bruger velkarakteriserede eukaryote translationsstart facTor eIF4E 9,10. Det cellulære oversættelse faktor eIF4E er en kritisk komponent af den cellulære eIF4F komplekse involveret i Cap-afhængige translationsstart 10. TAP tag anvendes i den nuværende undersøgelse er sammensat af to Protein G-enheder og en streptavidin-bindingspeptid adskilt af en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasespaltning sekvens. TAP tag anvendes i den nuværende undersøgelse er sammensat af to Protein G-enheder og en streptavidin-bindingspeptid adskilt af en Tobacco Etch Virus (TEV) proteasespaltning sekvens 8. At give afkald behovet for dannelse af klonale cellelinier, vi udviklet et hurtigt system, baseret på ekspressionen af TAP-mærkede bait-proteinet fra en episomalt opretholdes plasmid baseret på pMEP4 (Invitrogen). Ekspression af mærkede murine eIF4E fra dette plasmid blev kontrolleret under anvendelse af cadmiumchlorid inducerbare metallothioneinpromotor.
Lysering af de udtrykkende celler og efterfølgende affinitetsoprensning via binding til rabbit IgG agarose, TEV-protease-spaltning, til at binde til streptavidin bundet agarose og efterfølgende biotin eluering identificeret talrige proteiner tilsyneladende specifikke for eIF4E pull-down (sammenlignet med kontrol cellelinier, der udtrykker TAP tag alene). Identiteten af de proteiner blev opnået ved udskæring af båndene fra 1D SDS-PAGE og efterfølgende tandem massespektrometri. De identificerede komponenter, der følger de kendte eIF4E proteiner eIF4G og 4EBP-1. Desuden andre komponenter i eIF4F komplekset som eIF4E er en komponent blev identificeret, nemlig eIF4A og poly-A-bindende protein. Evnen til at identificere ikke kun kendt direkte bindende partnere samt sekundære interagerende proteiner, hvilket yderligere understreger nytten af denne tilgang i karakterisering af proteiner med ukendt funktion.
Protocol
1. Dannelse af cellelinier: pMEP4 transfektion / ekspression
- Transficere celler med pMEP4 ekspressionsvektoren og vælge med 100 ug af hygromycin B / ml (Roche), indtil alle mock-transficerede celler er blevet dræbt. Den pMEP4 Plasmidet bibeholdes episomalt så der er ingen behov for at isolere specifikke kloner.
- Celler indeholdende pMEP4 vektoren kan induceres ved behandling med 10 pM CdCI2 i 16 timer. Udtryk og inducibilitet bør bekræftes på en lille skala, før forstærkning af de cellelinier. TAP-mærket protein kan let påvises som protein G-domæner binder til antistoffer fra næsten alle arter. For oprensninger i stor skala typisk 10 konfluente 175 cm2 kolber med celler er påkrævet. Dette svarer til cirka 2 X10 8 udtrykkende celler.
2. Cellelysat præparat
- Skrabe cellerne i PBS og kombineres til en enkelt 50 ml rør. Spin 1200X gfeller 5 minutter (dette bør resultere i 2-3 ml pakkede celler til at begynde med, som reduceres til cirka 1,5 ml efter vask).
- Vaskes cellerne tre gange i iskold PBS (50 ml hver gang).
- Lyserer celler i 5 ml lysispuffer (50 mM Tris-HCI (pH 7,5), 125 mM NaCl, 5% glycerol, 0,2% NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 og proteaseinhibitor ). Bemærk: NaF, Na 3 VO 4 og proteasehæmmere bør tilføjes frisk. Afpipetteres op og ned 10 gange, før de forlader i 5 minutter på is. Sprøjter op og ned 5-10 gange ved anvendelse af en stump kanyle, inden de forlader igen på is i 5 minutter på is. Gentag syringing og lad yderligere 5 minutter på is.
- Fryse-tø-lysatet gange (flydende N2 / eller tøris og ethanol). Ikke tillader prøven at nå mere end 4 ° C. Bemærk: Du kan gemme denne prøve ved -80 ° C, indtil du har tid til at behandle.
- Alikvot på 1,5 ml rør og fjerne ikke-lyserede celler og debris ved centrifugering (10 minutter ved 4 ° C, 16.000 x g).
- Genvinde supernatant, kombineres i et 15 ml Falcon-rør og (eventuelt) passerer gennem et 0,45 um filter, før tager en 20 ul prøve til proteinudbytte kvantificering. Fjerne en yderligere 50 pi alikvot til efterfølgende analyse (prøve 1).
3. Binding til kanin-IgG-agarose
(Bemærk: Alle træk skal udføres ved 1200X g i en afkølet centrifuge ved 4 ° C i 1 minut, medmindre andet er angivet)
- Forsigtigt resuspenderes kanin-IgG-agarose-opløsning (Sigma-Aldrich) ved omrystning flaske. Tage 380 ul af IgG-agarose (ved anvendelse af en cut 1 ml pipettespids) og fjernelse af shipping / konserveringsmiddel opløsningen ved centrifugering i 1 minut. Vask agarose tre gange i afkølet lysisbuffer (4 ° C) under anvendelse af centrifugering til klarhed. Den slutudbyttet af agarose være omkring 250 ul pakkede perler.
- Tilsæt fjernet cellelysat fra 2,6 (i et 15 ml Falcon karrete) til den vaskede kanin-IgG-agarose og inkuberes i 3 timer (eller natten over) ved 4 ° C under anvendelse af en roterende blander.
- Vågeblus agaroseperlerne i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten med henblik på efterfølgende analyse (Prøve 2). Bemærk: TAP mærket protein bør nu være forbundet med perlerne.
4. TEV-protease-spaltning
(Bemærk: Alle træk skal udføres ved 1200X g i en afkølet centrifuge ved 4 ° C. i 1 minut, medmindre andet er angivet)
- Vask kanin IgG agarosekugler tre gange i afkølet lysisbuffer (4 ° C) under anvendelse af centrifugering for at afklare (bemærk: lysisbuffer bør ikke indeholde proteaseinhibitorer). Der bør udvises forsigtighed for ikke at fjerne eller miste eventuelle perler under vasketrinene.
- Vaske perlerne yderligere to gange med TEV-protease-spaltning buffer (10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 100 mM NaCI og 0,2% NP-40) under anvendelse af centrifugering til klarhed. Efter den sidste vask fjern forsigtigt lipund fra perlerne.
- Fremstilling af en TEV proteasespaltningssted blanding, for hver prøve indbefatter 467,5 gl H2O, 25 pi 20x TEV buffer (Invitrogen), 5 pi 0,1 M DTT og 2,5 ul (25 U) TEV-protease (Invitrogen). Tilsæt 500 pi af denne TEV spaltning blanding til hver prøve af pakkede perler og overføre hele blandingen til en 1,7 ml præ-smurte rør (Costar). Før inkubation fjernes en 30 ul aliquot til efterfølgende analyse (prøve 3).
- Inkubér TEV-protease reaktionen natten over ved 4 ° C under anvendelse af en roterende blander. Bemærk, at kortere inkuberinger gange kan anvendes afhængigt af arten af bait-proteinet og tilgængeligheden af TEV-protease-spaltningssted, men den minimale inkubationstiden skal bestemmes empirisk.
5. Binding til ULTRALINK immobiliseret streptavidin Plus perler
(Bemærk: Alle træk skal udføres ved 1200X g i en afkølet centrifuge ved 4 ° C i 1 minut, medmindre andet er angivet)
6. Biotin eluering af streptavidin-bindingspeptid og bait-protein
(Bemærk: Alle træk skal udføres ved 1200X g i en afkølet centrifuge ved 4 ° C i 1 minut, medmindre andet er angivet)
- Eluering mærkede proteiner fra de streptavidin-perler ved tilsætning af 500 pi PBS: Biotin (1 mM D-biotin) og inkubering ved 4 ° C i 3 timer (eller natten over) ved hjælp af en roterende blander.
- Spin ned streptavidinkugler i 5 minutter ved 4 ° C og fjern supernatanten til et 1,5 ml præ-smurte rør (Bemærk: Dette er den endelige prøve / eluering (prøve 7).
- Tilføje en anden 500 pi Biotin: PBS til de resterende streptavidinkugler og inkuber ved 4 ° C i 2-3 timer (eller natten over) ved hjælp af en roterende blander.
- Retørv trin 6,2 og kombinere de to elueringer (prøve 7). Denne endelige eluering kan opbevares ved -80 ° C.
- At vurdere effektiviteten af biotin eluering, fryses de resterende streptavidinkugler og koges senere i SDS-prøvebuffer (prøve 8) (anbefalinger: LaneMarker 5x reducere prøvepuffer fra Fisher).
7. Proteinkoncentration
- Den endelige eluat (prøve 7) skal koncentreres før analyse på grund af lav proteinkoncentration og forholdsvis store mængder. Dette kan opnås ved hjælp af lav molekylvægt (<5 kDa) Vivaspin spinkolonner (Vivascience). Ret til at koncentrere sig ned for lydstyrken til mindre end 100 gl. Denne endelige prøve kan koges og lagres i protein prøvebuffer (anbefalinger: LaneMarker 5x reducere prøvebuffer fra Fisher).
8. Analyse
- Prøver 1-8 kan analyseres ved western blot for at bestemme effektiviteten af pull down. Bemærk: De fleste sekundære antistoffer vilkrydsreagerer med Protein G domæner af fusionsproteinet, men dette fjernes efter TEV-protease-spaltning.
- Prøve 7 kan analyseres ved 1D eller 2D SDS-PAGE. Farvning kan udføres ved hjælp af sølv eller Coomassie (anbefalinger: SilverQuest sølvfarvning og Kolloide Blue Coomassie-farvning kits fra Invitrogen). Protein identifikation kan udføres under anvendelse af massespektrometri.
9. Repræsentative resultater
Et eksempel på 1D SDS-PAGE-analyse af den endelige eluering (prøve 7) fra protokollen til at identificere bindingspartnere af TAP kodet eIF4E er tilvejebragt i figur 2. Dette repræsenterer gel afspejler komplekse og rigelige art eIF4E interaktioner med andre proteiner i cellen. Sammenligning med den negative kontrol også vist i figur 2, dannes ud fra en cellelinie, der udtrykker kun TAP tag, illustrerer specificiteten af denne eIF4E madding pull-down. I dette tilfælde 15% af den koncentrerede endelige eluering (Prøve7) blev analyseret ved 1D SDS-PAGE under anvendelse af kommercielt tilgængelige færdigstøbte gradientgeler, før de farves under anvendelse af Silverquest sølvfarvning kit fra Invitrogen.
Typisk 50-85% af det resterende koncentrerede endelige eluering (prøve 7) analyseres med kolloid-Coomassie-farvning (Invitrogen). Prøver (gelskiver / bånd) fra hele banen blev derefter ekstraheret og analyseret ved massespektrometri.
Proteiner identificeret i eIF4E pull-down blev filtreret over bindingspartnerne fra den negative kontrol til at identificere ikke-specifikke bindingspartnere. De endelige identificerede proteiner under anvendelse af denne proces af TAP kodning eIF4E kan ses i figur 2, som er repræsentativ for de normale proteiner identificeret ved hjælp af denne teknik. Desuden blev et antal af de eIF3 underenhederne også identificeret (data ikke vist).
Figur 1. Skematisk afbildning aftandem affinitetsoprensning procedure. seks trin tandem affinitetsoprensning (TAP) Protokollen involverer cellelinie generation cellelyse, kanin-IgG-agarose immuno-udfældning, TEV-protease-spaltning, streptavidin vulst affinitetsoprensning og endelig biotin eluering.
Figur 2. Tandem affinitetsoprensning af det murine eIF4E proteinet. Interacting partnere N terminalt TAP mærkede eIF4E blev oprenset fra eukaryote HEK293-celler under anvendelse vedlagte protokol. En 20% fraktion af den endelige eluering (prøve 7) blev analyseret ved SDS-PAGE på en forstøbt 4-12% gradient-gel (TAP-eIF4E bane). En tilsvarende analyse blev udført for mærket alene (TAP bane). Proteiner blev identificeret ved anvendelse af sølvfarvning. Proteiner efterfølgende identificeret ved massespektrometri af den samme prøve fremhæves på denne gel.
Forkortelser: eIF4G; eukaryot translationsinitiering faktør 4 gamma PABP; polyA bindende protein, eIF4A: eukaryot translationsinitiering faktor 4 alfa, SBP-eIF4e medens de resterende TAP bait-protein indeholdende streptavidin-bindingspeptid fusioneret til eukaryote translationsinitiering faktor 4E, 4EBPs; eukaryot translationsinitiering faktor 4E binding proteiner, eIF4eNiF1l eukaryot translationsinitiering faktor 4E kerneimport faktor 1, SBP, den resterende streptavidin-bindingspeptid fra TEV kondenseret TAP peptid.
Discussion
TAP tagging teknik illustreret her viser en meget specifik og stringent fremgangsmåde til isolering af de bindende partnere bait-proteiner i eukaryote celler. Denne fremgangsmåde kan anvendes til både cellulære og virale proteiner. Vores kendskab er dette første gang en sådan teknik er blevet anvendt til translationsinitiering faktor eIF4E. Identifikation af den kendte eIF4E bindende proteiner eIF4G og 4EBPs at bruge denne teknik bekræfter gyldigheden af en sådan fremgangsmåde. Desuden identifikation af den resterende del af eIF4F komplekset nemlig eIF4A og PABP bekræfter, at indirekte interaktion og tertiære komplekser forbliver intakte under rensningsprocessen. Identifikation af multiple isoformer af de kanoniske eIF4e proteiner var også tydelige. Disse beskrives mere detaljeret i figur 2.
Med hensyn til de begrænsninger fremgangsmåde bør bestemt udvises forsigtighed med hensyn til valgaf bait-protein, og hvorvidt at placere TAG mærket i den N-eller C-terminalen. Det kan være tilrådeligt at udføre et funktionelt assay eller undersøge lokalisering af fusionsproteinet ved mikroskopi før fuld skala oprensning for at sikre, tagged derivat er funktionel. Integreret membran eller kerneproteiner ikke nødvendigvis blive frigivet ved de relativt milde detergenter er beskrevet i lysis trin. Som med alle immunopræcipitationer og lignende pull-down assays, kan der foretages modifikationer til arten og koncentrationen af detergentet i lyseringspuffer at øge effektiviteten af lysis. Den ioniske koncentration af lysis-og vaske puffere kan også modificeres til at forøge eller formindske stringensen af oprensningen. Det er også muligt at udføre den indledende oprensning under standardbetingelser milde betingelser (beskrevet ovenfor), men derefter dividere streptavidinkugler (afsnit 5.8) i 4-5 portioner, som kan derefter vaskes under stigende ionisk congelserne. Dette kan gøre det muligt for brugeren at identificere de optimale betingelser at fjerne ikke-specifikke interagerende proteiner. Hele processen kan også udføres under anvendelse af forbigående transfektion, hvor de samvirkende parter er kendt og deres tilstedeværelse eller fravær bestemmes ved efterfølgende western blot alene. I dette tilfælde vil vi foreslå to 100cm 2 retter af celler hver transficeret med 8 ug af ekspressionsplasmid. Denne modificerede fremgangsmåde er især nyttig ved undersøgelse af evnen af mutant derivater af TAP-fusionsproteinet til at interagere med kendte bindingspartnere.
Analyse prøverne 1 til 8 på sølvfarvede SDS-PAGE-geler (eller ved western-blot, hvis et antistof er tilgængeligt) er en fremragende måde til fejlfinding, bør teknikken ikke frembringe acceptable resultater. Effektiviteten af de enkelte affinitet baserede udfældning og specifikt eluering kan analyseres ved hjælp af denne systematiske prøver. Prøver man at otte bør tages under optimization af protokollen for hver ny madding.
Den TAP tagging teknik giver en kraftig og robust alternativ til andre metoder, såsom GST pull-downs, gær to hybrid-analyser etc. Den dobbelte affinitetsrensningen og specifikke elueringstrin (TEV spaltning og biotin eluering) giver specificitet og stringens at blive fastholdt på et højt niveau i hele oprensningsprocedure. Kritisk denne teknik kan anvendes til ethvert protein, og derfor repræsenterer en fremragende fremgangsmåde til identificering bindingspartnere for et protein målet af interesse.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne forskning blev finansieret af en Wellcome Trust Senior Fellowship tildelt til Dr. Ian Goodfellow.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 | |
| Rabbit IgG Agarose | Sigma-Aldrich | A2909 | |
| AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce, Thermo Scientific | 53116 | |
| Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 | |
| SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| Microcapillary pipette tips | VWR international | 37001-150 | |
| NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX | |
| CdCl2 | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| 5x SDS Sample Buffer | Fisher Scientific | PN39000 |
References
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Blackwell, C., Brown, J. D. The application of tandem-affinity purification to Candida albicans. Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).
- Cochrane, A. Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function. Virology. 388 (1), 103-111 (2009).
- Fernandez, E. Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins. Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).
- Gloeckner, C. J. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag. Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).
- Holowaty, M. N. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).
- Burckstummer, T. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E. EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).
- Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. Eukaryotic initiation factor 4E. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).
