Summary
Tandem afinite saflaştırma proteinlerine bağlanma ortaklarının belirlenmesi için sağlam bir yaklaşımdır. Kavramı kanıtı olarak, bu metodoloji konak hücre faktörü için inisiyasyon dahil eş-tortu ile iyi karakterize çevirisi başlatma faktörü eIF4E uygulanmıştır. Bu yöntem, kolaylıkla bir hücre ya da viral proteini için uyarlanmıştır.
Abstract
Host ve viral proteinlerin işlevlerini anlamada kritik ve genellikle sınırlayıcı aşama hücresel veya viral proteini ortaklarına etkileşen tanımlanmasıdır. Etkileşen maya da dahil olmak üzere iki hibrid sistemi ortak, yanı sıra, rekombinant proteinlerin ve kütle spektrometrisi tanımlama 1 takiben endojen proteinlerin immünopresipitasyon kullanılarak deneyleri aşağı doğru tanımlanması sağlayan birçok yaklaşım vardır. Son çalışmalar etkileşen proteinlerin tanımlanmasında iki özel elüsyon adımlar ile birleştiğinde çift afinite etiketi aracılı arınma programı, sermiştir. Bu yaklaşım olarak adlandırılan Tandem Affinity Arıtma (TAP), başlangıçta maya 2,3 kullanılmıştır ama son zamanlarda memeli hücrelerinde 4-8 kullanmak için adapte edilmiştir.
Proof-of-concept olarak, iyi karakterize ökaryotik çeviri inisiyasyon fac kullanarak bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemi kurduktor eIF4E 9,10. hücresel çeviri faktörü eIF4E kap-bağımlı çeviri inisiyasyon 10 dahil hücresel eIF4F karmaşık kritik bir bileşenidir. Mevcut çalışmada kullanılan TAP etiketi iki Protein G birimlerden oluşur ve bir streptavidin bağlayıcı peptid Bir Tütün Etch Virüsü (TEV) proteaz bölünme sırası ile ayrılır. Mevcut çalışmada kullanılan TAP etiketi iki Protein G birimlerden oluşur ve bir streptavidin bağlayıcı peptid Bir Tütün Etch Virüsü ile ayrılmış (TEV) proteaz bölünme sırası 8 edilir. Klonal hücre serilerinin jenere edilmesi için ihtiyacı forgo için, pMEP4 (Invitrogen) dayalı bir episomally muhafaza edilen plasmidin TAP-etiketli yem proteininin ifadesi dayanır hızlı bir sistemi geliştirilmiştir. Bu plazmid etiketli fare eIF4E İfadesi kadmiyum klorür indüklenebilir Metallothionein organizatörü kullanılarak kontrol edildi.
R bağlama aracılığıyla ifade eden hücrelerin ve müteakip afinite saflaştırma lizisabbit IgG agaroz, TEV proteaz bölünme, streptavidin bağlantılı agaroz bağlanarak ve (yalnız TAP etiketi ifade hücre hatları kontrol grubuna kıyasla) daha sonra biotin elüsyon açılan eIF4E görünüşte bir çok özel proteinler tanımlanmıştır. Proteinlerin kimlikleri 1D SDS-PAGE ve müteakip tandem kütle spektrometrisi ile bantları çıkarılması ile elde edilmiştir. Tanımlanan bileşenler bilinen eIF4E bağlayıcı eIF4G proteinleri ve 4EBP-1 dahildir. Buna ek olarak, eIF4F kompleksinin, diğer bileşenler, eIF4E bir bileşeni ve eIF4A Poli-A bağlayıcı protein, yani belirlendi olduğu. Bilinen doğrudan bağlayıcı ortak yanı sıra ikincil etkileşen proteinler, sadece tanımlamak için yeteneği fazla işlevi bilinmeyen proteinlerin karakterizasyonu bu yaklaşımın yarar vurgulamaktadır.
Protocol
1. Hücre hatları Üretimi: pMEP4 transfeksiyon / ifade
- PMEP4 ifade vektörü ile hücre transferinde ve tüm sahte transfekte hücrelerini öldürüldü kadar higromisin B / ml (Roche) 100 mikrogram ile seçin. PMEP4 plazmid belirli bir klon izole etmek için gerek yoktur episomally şekilde korunur.
- PMEP4 vektörü içeren hücrelerin 16 saat süreyle 10 uM CDCh 2 ile muamele ile uyarılan edilebilir. İfade ve indüklenebiliyordu hücre hatlarının amplifikasyonu önce küçük ölçekte teyit edilmelidir. Protein G etki hemen hemen tüm türlerden antikorların bağlanma olarak TAP-etiketli protein kolayca tespit edilebilir. Büyük ölçekli saflaştırılması için hücreleri, genellikle 10 konfluent 175 cm 2 şişeler gereklidir. Bu yaklaşık 2 X10 8 salgılayan hücrelerin eşittir.
2. Hücre lizat hazırlığı
- PBS içine hücreleri kazıyın ve tek bir 50 ml tüp birleşir. 1200X gf Spinveya 5 dakika (Bu yıkandıktan sonra yaklaşık 1.5 ml azaltır, başlamak dolu hücrelerin 2-3 ml sebep olmalıdır).
- Buz gibi soğuk PBS (50 ml her seferinde) hücreleri, üç kez yıkanır.
- 5 ml lizis tamponu (hücre parçalayan 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 125 mM NaCl,% 5 gliserol,% 0.2 NP-40, 1,5 mM MgCl2, 25 mM NaF, 1 mM Na 3 VO 4 ve proteaz inhibitörü ). Not: NaF, Na 3 VO 4 ve proteaz inhibitörleri taze ilave edilmelidir. Buz üzerinde 5 dakika ayrılmadan önce 10 kez aşağı yukarı Pipeti ve. Buz üzerinde 5 dakika buz üzerinde tekrar ayrılmadan önce künt bir iğne kullanarak Şırınga aşağı yukarı 5-10 kez. Syringing tekrarlayın ve buz üzerinde daha 5 dakika bekletin.
- (Sıvı N 2 / veya kuru buz ve etanol) iki kez lizat donma-çözülme. Örnek 4 ve daha büyük ° C'ye ulaşmasına izin vermeyin Not: işlemek için zaman ° C'ye kadar -80 bu örnek saklayabilirsiniz.
- 1.5 ml tüpler içine alikotu örnek ve kaldırma Parçalanmayan hücreleri ve dsantrifüjleme (4 at 10 ° C dakika, 16,000 x g) tarafından ebris.
- Süpernatant Kurtar, 15 ml falcon tüp içinde birleştirmek ve (isteğe bağlı) protein verimi ölçümü için 20 mikrolitre numune almadan önce filtre 0.45 mikron geçer. Sonraki analiz (Örnek 1) için bir başka 50 ul alikotu çıkarın.
3. Tavşan IgG-agaroz bağlanarak
(Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C'de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g'de yapılmalıdır)
- Yavaşça şişe dönen tarafından tavşan IgG-agaroz (Sigma-Aldrich) tekrar süspansiyon. IgG agaroz (bir kesim 1ml pipet kullanarak) 380 ul atın ve 1 dakika santrifüj nakliye / solüsyonundan kaldırın. Soğutulmuş lizis tamponu (4 ° C) açıklığa kavuşturmak için santrifüj kullanarak. Yılında agaroz üç kez yıkayın Agaroz nihai verim paketlenmiş boncuklar yaklaşık 250 ul olmalıdır.
- 2.6 (15 ml şahin küvette gelen temizlenmiş hücre lizatı eklee) 4 C'de 3 saat yıkanmış tavşan-IgG ve agaroz inkübe (ya da gece boyunca) ° C arasında bir döner mikser kullanılarak.
- 4 ° C de 5 dakika için agaroz boncukları aşağı doğru dönmeye ve sonraki analiz (Örnek 2) için supernatant kaldırın. Not: protein etiketli TAP artık boncuklu ile ilişkili edilmelidir.
4. TEV proteaz bölünme
(Not: Tüm spin aksi belirtilmedikçe, 1 dakika 4oC bir soğutmalı santrifüj içinde 1200X g yapılmalıdır)
- Soğutulmuş lizis tamponunda tavşan IgG agaroz boncuk üç kez yıkayın (4 ° C) (not: lizis tamponu proteaz inhibitörleri içermemeli) açıklığa kavuşturmak için santrifüj kullanarak. Bakım yıkama adımları sırasında herhangi bir boncuk kaldırmak veya kaybetmek değil alınmalıdır.
- Netleştirmek için santrifüjleme ile TEV-proteaz bölünme tamponu (10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 100 mM NaCl ve% 0.2 NP-40) sahip boncuk bir başka iki kez yıkanır. Son yıkamadan sonra dikkatlice li kaldırmakboncuklar sterlin.
- Bir TEV proteaz bölünme karışım hazırlamak; her bir örnek için 467,5 ul H2O, 25 ul 20x TEV Tamponu (Invitrogen), 5 ul 0.1 M DTT ve 2.5 ul (25 U) TEV Proteaz (Invitrogen) içerir. Paketlenmiş boncuklar her bir örnek için bu TEV bölünme mix 500 ul ekleyin ve 1.7 ml önceden yağlanmış bir tüp (Costar) için tüm karışımı aktarın. Kuluçka öncesi sonraki analiz (Örnek 3) için bir 30 ul alikotu çıkarmak için kullanılır.
- 4 gece boyunca TEV proteaz reaksiyon inkübe ° C Döner karıştırıcı kullanarak. Daha kısa inkübasyonlar kez ampirik olarak tespit edilmelidir yem protein ve TEV proteaz bölünme sitesini ancak minimal inkübasyon süresi erişilebilirlik doğasına bağlı olarak kullanılabilmektedir dikkat ediniz.
5.. İmmobilize Streptavidin Plus, boncuk ULTRALINK bağlanarak
(Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C'de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g'de yapılmalıdır)
6. Streptavidin bağlayıcı peptid ve yem protein biotin elüsyon
(Not: Tüm spin, aksi belirtilmedikçe, 1 dakika süreyle 4 ° C'de soğutulmuş bir santrifüj 1200X g'de yapılmalıdır)
- Biotin (1 mM D-biotin) ve bir döner mikser kullanılarak 3 saat (ya da gece boyunca) için 4 ° C'de inkübe: 500 ul PBS ilave edilerek streptavidin boncuklar ile etiketlenmiş proteinleri elüt edilmesi.
- 4 ° C de 5 dakika streptavidin boncuk aşağı çevirin ve 1.5 ml önceden yağlanmış tüpü (Not süpernatant kaldırmak: Bu senin son örnek / elüsyon (Örnek 7).
- Kalan streptavidin boncuk için PBS ve dönen bir mikser kullanarak 2-3 saat (veya gece) 4 ° C'de inkübe: başka bir 500 ul Biotin ekleyin.
- Returba 6.2 adım ve iki elutions (Örnek 7) birleştirir. Bu, nihai elüsyon -80 ° C'de saklanabilir
- Biotin elüsyon etkinliğini değerlendirmek için, daha sonra SDS numune tamponu (Örnek 8) (: Fisher LaneMarker 5x azaltarak numune tamponu tavsiyeler) kalan streptavidin boncuk dondurma ve kaynatın.
7. Protein konsantrasyonu
- Nihai arındırıldı (Örnek 7), çünkü düşük protein konsantrasyonunu ve nispeten yüksek hacim analizden önce konsantre edilmesi gerekmektedir. Bu, düşük moleküler ağırlıktaki (<5 kDa) Vivaspin sıkma kolon (Vivascience) kullanılarak elde edebilir. Az 100 ul için ses aşağı konsantre hedefliyoruz. Bu son örnek (: Fisher LaneMarker 5x azaltarak numune tamponu öneriler) kaynatılır ve protein örnek tampon saklanabilir.
8. Analiz
- Örnekler 1-8 aşağı çekme etkinliğini belirlemek için western blot ile analiz edilebilir. Not: Çoğu sekonder antikorlar olacakfüzyon protein Protein G etki çapraz reaksiyona ama bu TEV proteaz bölünme sonra kaldırılır.
- Örnek 7 1D veya 2D SDS-PAGE ile analiz edilebilir. Boyama gümüş veya Coomassie (: SilverQuest gümüş boyama ve Invitrogen Kolloidal Mavi Coomassie boyama kitleri öneriler) kullanılarak yapılabilir. Protein tanımlama kütle spektrometrisi kullanılarak gerçekleştirilebilir.
9. Temsilcisi Sonuçlar
TAP etiketli eIF4E bağlayıcı ortaklarına tanımlamak için bu protokolünden nihai elüsyon (Örnek 7) arasında 1D SDS-PAGE ile analiz için bir örnek, Şekil 2'de verilmiştir. Bu temsili jel hücre diğer proteinler ile eIF4E etkileşimlerin kompleksi ve bol doğasını yansıtır. Sadece TAP etiketi ifade eden bir hücre dizisi aynı zamanda elde edilen Şekil 2'de gösterildiği gibi negatif kontrol ile karşılaştırıldığında, açılan baited Bu eIF4E özgünlüğünü göstermektedir. Konsantre son elüsyon bu örneği% 15 (Örnek7) Invitrogen Silverquest gümüş boyama kiti kullanılarak lekelenmektedir edilmeden önce, piyasada bulunan önceden dökme gradyanı kullanılarak jel 1D SDS-PAGE ile analiz edildi.
Tipik olarak, geri kalan konsantre nihai elüsyon (Örnek 7), 50-85% Koloidal Coomassie (Invitrogen) boyası ile analiz edilir. Tüm şeritli Örnekler (jel dilim / bantları) sonra kitle spektrometre tarafından ayıklanır ve analiz edildi.
Açılan eIF4E tanımlanan proteinleri spesifik olmayan bağlanma ortak belirlemektir negatif kontrol gelen bağlayıcı ortaklarına karşı filtre edildi. TAP etiketleme eIF4E bu işlem kullanılarak tespit Nihai protein bu teknik kullanılarak tespit normal proteinler için temsili Şekil 2, görülebilir. Buna ek olarak, eIF3 alt birimlerinin bir sayı, aynı zamanda (veri gösterilmemiştir) tespit edilmiştir.
Şekil 1.. Şematiktandem afinite saflaştırma prosedürü. altı adım tandem afinite saflaştırma (TAP) protokolü hücre hattı üretimi, hücre parçalama, Tavşan IgG agaroz immüno-yağış, TEV proteaz bölünme, streptavidin boncuk afinite saflaştırma ve nihayet biotin elüsyon içerir.
Şekil 2. Fare eIF4E protein Tandem afinite saflaştırma. Ölümcül tagged dokunun N ortakları etkileşimde eIF4E ekli protokol kullanılarak ökaryotik HEK293 hücrelerine arınmış. Nihai elüsyon (Örnek 7) bir 20% fraksiyonu önceden dökme 4-12% gradyanı jel (TAP-eIF4E şeritli) üzerinde SDS-PAGE ile analiz edildi. Eşdeğer bir analizi tek başına etiketi (TAP şerit) için yapıldı. Proteinler gümüş boyama yöntemi kullanılarak belirlenmiştir. Daha sonra aynı örnek kütle spektrometresi tarafından tespit Proteinler jel vurgulanır.
Kısaltmalar: eIF4G; ökaryotik çeviri başlatılması faktör 4 gamma, PABP; poliA bağlayıcı protein, eIF4A: ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4 alfa, SBP-eIF4e; ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E bağlayıcı; ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E ile kaynaşmış, 4EBPs streptavidin bağlayıcı peptid içeren kalan TAP yem protein proteinler, eIF4eNiF1l ökaryotik çeviri başlatma faktörü 4E nükleer ithalat faktör 1, SKB; TEV Birleşmemiş TAP peptid kalan streptavidin bağlayıcı peptid.
Discussion
Burada gösterilen TAP etiketleme tekniği ökaryotik hücrelere in yem proteinlerinin bağlama ortaklarına izole etmek için bir çok özel ve sıkı bir yöntemi göstermektedir. Bu yaklaşım, hücre ve virüs proteinleri hem de uygulanabilir. Bildiğimiz kadarıyla, bu tür bir teknik çeviri başlatma faktörü eIF4E uygulanmış ilk kez. Bu tekniği kullanarak bilinen eIF4E bağlayıcı proteinlerin eIF4G ve 4EBPs belirlenmesi böyle bir yaklaşımın geçerliliğini onaylar. Buna ek olarak, eIF4F kompleksinin kalan bileşeninin tanımlama, yani eIF4A ve PABP dolaylı etkileşimi ve üçüncül kompleksleri saflaştırma işlemi sırasında olduğu gibi kalır olduğunu onaylar. Kanonik eIF4e bağlayıcı proteinlerin birden izoformlarının tanımlama da belli oluyordu. Bu, Şekil 2'de daha ayrıntılı olarak tarif edilmiştir.
Yaklaşımın sınırlamaları ile ilgili olarak, belirli bakım seçimi ile ilgili olarak alınması gerekenyem protein ve N-veya C-terminusta TAG etiketi yerleştirmek için olsun veya olmasın. Bu işlevsel bir test yapmak veya etiketli türevi işlevsel olmasını sağlamak için önce tam ölçekli arıtma için mikroskop ile füzyon proteini lokalizasyonu incelemek için tavsiye edilebilir. İntegral membran veya nükleer proteinlerin mutlaka lizis adımda açıklanan nispeten hafif bir deterjan koşulları tarafından serbest olabilir. Tüm imüno ve benzeri açılan testleri olduğu gibi, değişiklikler lizis verimliliğini artırmak için lizis tamponunda doğa ve deterjan konsantrasyonları için yapılamadı. Lisisi ve yıkama tamponların iyonik konsantrasyonu da saflaştırılması sıkılığına arttırmak veya azaltmak için tadil edilebilecektir. Bu standart ılımlı koşullar (yukarıda anlatılan) altında başlangıç saflaştırma gerçekleştirmek de mümkündür, ancak daha sonra daha sonra artan iyonik Con altında yıkanabilir 4-5 kısma streptavidin boncuklar (bölüm 5.8), bölmekditions. Bu, kullanıcının spesifik olmayan etkileşim proteinler kaldırmak optimal koşulları tanımlamak için etkinleştirebilirsiniz. Tüm süreç de geçici etkileşen ortaklarına bilinmektedir ve bunu takip eden transfeksiyon Western blot ile belirlenir, sadece kendi varlığı ya da yokluğu kullanılarak gerçekleştirilebilir. Bu durumda her plazmid ifade 8 mikrogram ile transfekte hücreler iki 100cm 2 yemekleri öneririm. Bilinen bağlayıcı ortakları ile etkileşim TAP-füzyon proteininin mutant türevlerinin yeteneğini incelerken Bu modifiye işlemi özel kullanım olduğu.
Gümüş lekeli SDS-PAGE jel (ya da western blot tarafından bir antikor varsa) 8 ile örnek 1 incelendiğinde giderme mükemmel bir yoldur, teknik kabul edilebilir sonuçlar üretmek için başarısız. Her yakınlık tabanlı yağış ve özel yıkama etkinliği bu sistematik örnekleme yöntemi kullanılarak analiz edilebilir. Örnekleri 8-1 Optim sırasında alınmalıdırher yeni yem için protokol yatış gerçekleşmedi.
TAP etiketleme tekniği gibi GST gibi diğer yaklaşımlar pull-çıkışlar, vb çift afinite saflaştırma ve belirli elüsyon adımlar (TEV bölünme ve biyotin elüsyon) bir tutulmaları özgüllük ve sıkılığı sağlayacak maya iki hibrid testleri için güçlü ve sağlam bir alternatif sunuyor saflaştırma prosedürü boyunca yüksek düzeyde. Kritik Bu tekniğin bir protein için uygulanabilir ve bu nedenle bir ilgi proteinin hedef için bağlayıcı ortaklarına belirlenmesi için mükemmel bir yöntemi göstermektedir.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu araştırma, Dr Ian Goodfellow verilen bir Wellcome Trust Kıdemli Kardeşliği tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Hygromycin B | Roche Group | 10843555001 | |
| Rabbit IgG Agarose | Sigma-Aldrich | A2909 | |
| AC-TEV Protease | Invitrogen | 12575-015 | |
| Protease inhibitor cocktail | Calbiochem | 539134 | |
| Ultralink Immobilized Streptavidin Plus beads | Pierce, Thermo Scientific | 53116 | |
| Vivaspin 500 centrifugal concentrator (5KDa) | Vivaspin | V50112 | |
| SilverQuest silver staining kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Novex Colloidal Blue Coomassie staining kit | Invitrogen | LC6025 | |
| 1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
| Microcapillary pipette tips | VWR international | 37001-150 | |
| NuPage 4-12% Bis-Tris gradient gels | Invitrogen | NP0322BOX | |
| CdCl2 | Sigma-Aldrich | 202908 | |
| 5x SDS Sample Buffer | Fisher Scientific | PN39000 |
References
- Williamson, M. P., Sutcliffe, M. J. Protein-protein interactions. Biochem. Soc. Trans. 38 (4), 875-878 (2010).
- Rigaut, G. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nat. Biotechnol. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Blackwell, C., Brown, J. D. The application of tandem-affinity purification to Candida albicans. Methods Mol. Biol. 499, 133-148 (2009).
- Cochrane, A. Stable complex formation between HIV Rev and the nucleosome assembly protein, NAP1, affects Rev function. Virology. 388 (1), 103-111 (2009).
- Fernandez, E. Targeted tandem affinity purification of PSD-95 recovers core postsynaptic complexes and schizophrenia susceptibility proteins. Mol. Syst. Biol. 5, 269-269 (2009).
- Gloeckner, C. J. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP tag. Methods Mol. Biol. 564, 359-372 (2009).
- Holowaty, M. N. Protein profiling with Epstein-Barr nuclear antigen-1 reveals an interaction with the herpesvirus-associated ubiquitin-specific protease HAUSP/USP7. J. Biol. Chem. 278 (32), 29987-29994 (2003).
- Burckstummer, T. An efficient tandem affinity purification procedure for interaction proteomics in mammalian cells. Nat. Methods. 3 (12), 1013-1019 (2006).
- Goodfellow, I. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF 4 E. EMBO Rep. 6 (10), 968-972 (2005).
- Goodfellow, I. G., Roberts, L. O. Eukaryotic initiation factor 4E. Int. J. Biochem. Cell Biol. 40 (12), 2675-2680 (2008).
