Простая и надежная В естественных условиях И В пробирке Подход к изучению вируса Ассамблеи

Summary

Простой, эффективный и надежный способ синхронизировать поставки несколько вирусных компонентов в клетках растений с помощью

Protocol

1. Завод материал

1. Nicotiana benthamiana растений, которые будут использоваться в encapsidation анализа должны быть на 4 листа этапе (примерно в 3-4 недельных растений).

2. Доставка и выражение функциональной вирусных компонентов генома растительной клетки на agroinfiltration

1. День 1: штамм Agrobacterium (например, EH 105 или GV 3101) укрывает pCass-BMV РНК 1, BMV РНК 2 и BMV РНК 3 ^1,2 выращивают на LB агаром дополнена с 50 мг / мл канамицина (выбирает вектор pCASS) и 100мг/мл рифампицина (выбирает для Agrobacterium). Инкубация проводится при 28 ° С в течение двух дней.
2. День 3: прививки одной колонии с пластинки LB агар в 2 мл LB бульон, содержащий 50 мг / мл канамицина и 100 мг / мл рифампицина в течение 1 дня при 28 ° C в орбитальный шейкер установить на 250 оборотов в минуту.
3. День 4: Инокулировать 50 мл добавки бульон LBиздание с 50 мг / мл канамицина и 100 мг / мл рифампицина, 10 мМ MES рН 5,6, 100 мМ acetosyringone с одним мл культуры в 250 мл колбу в течение 16 часов при 28 ° С на орбитальном шейкере при 250 RPM .
4. День 5: Трансфер культуры (при OD ₆₀₀ достиг 1.0) для труб Oak Ridge или стерильную пробирку Сокол и центрифуги в течение 10 минут при 5000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C.
5. Растворить осадок в 10 мл 10 мМ MgCl ₂ и центрифуги в течение 10 минут при 5000 RPM при температуре 4 ° C, Повторите этот шаг еще раз, чтобы обеспечить полное удаление антибиотиков.
6. Приостановить осадок в 10 мл буфера, содержащего 10 мМ MgCl ₂ и 10 мМ MES (рН 5.6).
7. Измерить OD ₆₀₀ для каждой культуры РНК БМВ 1, 2 и РНК, РНК 3 и настроить до 0,1 OD ₆₀₀ с помощью 10 мМ MgCl ₂ и 10 мМ MES (рН 5.6).
8. Смешайте 1 мл всех трех 0,1 OD ₆₀₀ взвеси культуры.
9. Добавить 100 мМ acetosyringone, смешать джентльменют и держать смесь спокойно при комнатной температуре в течение 3 часов.
10. Нарисуйте культуры суспензии в 1 мл. шприц без иглы.
11. Проникнуть выше суспензионной культуры в абаксиальной сторону 2-3 хорошо расширенной листьев N. benthamiana (5 листьев этапе, 3-4 недельных растений), слегка нажав шприца до половины абаксиальной поверхности листа.
12. Повторите эту процедуру проникновения в другие листья.
13. Держите проникли растений в зеленый дом с 24 ° C.
14. Урожай проникли листья от 3 до 4 дней после проникновения (точек на дюйм).

3. Очистка вирионов BMV

1. Соберите Н. benthamiana оставляет agroinfiltrated с смеси, содержащей все три дикого типа BMV agrotransformants.
2. Измельчить листья в стерильной пестик и ступка с одинаковым объемом (вес / объем) в BMV экстракционного буфера (0,5 М NaAc; 0,08 м MgAc, рН 4,5 и 1/100 объема β-меркаптоэтанол, которая должна быть добавлена ​​непосредственно перед употреблением) ^3. Для увеличения выхода вируса, рекомендуется добавить промытый песок кислоты (~ 0,5-1 г), что облегчает эффективное измельчение и разрушение клетки.
3. Фильтрация экстракта листьев через 2-3 слоя ткани марли и собрать волнение.
4. Снова растереть сохранила часть на ткани марли с равным объемом буфера для экстракции BMV к первоначальному весу листьев.
5. Повторите процедуру, используя фильтрацию ткани марли. Эти меры должны осуществляться при температуре 4 ° C.
6. Перенесите раствор фильтрата в центрифужную пробирку и добавьте равное количество предварительно охлажденной хлороформа и вихря (или дрожание) в течение 5 минут при комнатной температуре до цвета суспензии оказывается светло-зеленые.
7. Центрифуга эмульгированных решение в течение 15 минут при 12000 оборотов при 4 ° C.
8. Соберите водную фазу и перемешивают в течение 30 минут на магнитной мешалкой, чтобы удалить остатки хлороформа.
9. Передача подвески стерильную пробирку ультрацентрифуге.
3.
10. Центрифуга на 30000 оборотов в минуту в течение 3 часов в ультрацентрифуге Beckman при 4 ° C.
11. Удалите супернатант и приостановить гранул в нужном объеме буфера подвески БМВ (подготовка подвески буфер разбавленных добычи BMV буфера до 1/10 с дистиллированной водой).
12. Частично очищенных вирионов подготовки сверху шаг подвергается 10-40% сахарозы центрифугированием в градиенте плотности за 150 минут при 28 000 оборотов в минуту при температуре 4 ° C.
13. Соберите группу вирусов вручную или ректификации. Вирус группы появится синий под белым светом освещения.
14. Развести сахарозы раствор, содержащий вирус образца не менее 50% с вирусом буфер подвески.
15. Центрифуга разбавленных вирусом, содержащим раствор сахарозы в течение 3 часов при 30 000 оборотов в минуту в ультрацентрифуге Beckman при 4 ° C.
16. Наконец приостановить высокоочищенного вирус шарик в нужном объеме вирнам подвески буфера.
17. Измерение концентрации вирионов (мг / мл), используя спектрофотометр на OD _260.

Примечание: на основе РНК, коэффициент экстинкции для BMV составляет 5 ^4.

19. Проверьте чистоту вирионов при просмотре под TEM (рис.)

4. Подготовка капсида белковых субъединиц в пробирке сборки

1. Подготовить 1 л 1x вирус диссоциации буфера (0,5 М CaCl _2, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 1,0 мМ ЭДТА, 1,0 мМ DTT и 0,5 мМ PMSF) ^5.
2. Подготовить диализа мембраны в соответствии с Sambrook и др. ^6.
3. Внесите необходимые концентрации очищенного вируса в диализе сумку.
4. Поместите вирусом, содержащим диализа мешок в стакан, содержащий вирус 1x диссоциации буфера.
5. Диализировать 24 часов при температуре 4 ° C whilэлектронной перемешивании.
6. Соберите решение от диализа мешок после 24 часов и центрифуги при 12000 х г в течение 15 мин при 4 ° C. Это позволит отделить BMV РНК из диссоциированных вирионов.
7. Соберите супернатант и центрифуги в 35 000 оборотов в минуту в центрифуге Beckman в течение 3 часов при температуре 4 ° С до гранул любой не-диссоциированных вирусной частицы.
8. Соберите супернатант.
9. На этом этапе важно, чтобы удалить загрязнения РНК вириона из капсида диссоциированных белковых субъединиц. Для этого супернатант из шага 8 должны быть подвергнуты очередной раунд за ночь сборку капсида белковых субъединиц без добавления РНК (РНК в буфер 1x сборки, см. ниже), а затем высокоскоростного центрифугирования (30000 оборотов в минуту в течение 3 часов при 4 ° C) в гранулах любой собранный вирионов. После этого сборка шаг, супернатант, содержащий белковых субъединиц пальто были бы свободны от любых остаточных загрязняющих РНК. Однако для обеспечения этого, рекомендуется выполнить дополнительные в Vitro сборки только с пальто белковых субъединиц с помощью РНК 1x сборки буфера. После того, как за одну ночь сборки, подготовки должны быть свободны от собранных вирионов (проверьте с помощью ПЭМ).
10. Определить концентрацию капсида белковых субъединиц путем измерения на OD 254 и 280 нм или другие методы, такие как анализ Брэдфорда.
11. Выполните 12-15% SDS-PAGE следуют западной пятном, чтобы определить целостность диссоциированных капсида белковых субъединиц.

5. В пробирке сборке вирионов РНК, содержащая

1. Подготовить РНК-транскрипты быть вновь собраны в вирионов и расчета концентрации ^7.
2. Смешайте капсида белковых субъединиц РНК и запись в соотношении 1:5 (вес / вес) ^5.
3. Нанесите полученную смесь на диализе сумку и надежной защиты, чтобы избежать утечек.
4. Подготовить 1000 мл. РНК 1x сборки буфера (50 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl, рН 7,2, 10 мМ KCl, 5 мМ MgCl _2, 1,0 мМ DTT) ^5.
5. Поместите диализа мешок с реакционной смеси против буфера сборки 1x в стакан и размешайте.
6. Диализировать повторной сборки реакции при температуре 4 ° С в течение 24 часов, осторожно перемешивая.
7. Соберите смесь из диализа сумку через 24 часа, добавить 1,5 мл буфера РНК сборки.
8. Передайте эту смесь через Centricon-100 столбцов путем центрифугирования на низкой скорости (2000 мкг) в течение 30 минут.
9. Промойте колонку раза с 1,5 мл буфера сборки при температуре 4 ° С в течение 30 мин.
10. Повторите описанную выше промывки в два раза.
11. Наконец, вымывается повторной сборки вирионов центрифугированием при 10000 г при 4 ° С в течение 5 мин.
12. Оцените вириона концентрации в ОП 260 нм.

6. Производство оптических Вирусный Ghosts (OVGs)

1. Добавить индоцианина зеленого (ICG) ⁸ очищенных белков капсида на желаемый коэффициент концентрации (весовое соотношение индоцианина зеленого и белок капсида, используемые в настоящем докладе, 1:10) г тщательно перемешать с помощью пипетки.
2. Диализировать белок капсида и МКГ решение против OVG буфера сборки (1 М NaCl, 50 мМ NaAc, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ DTT, pH4.8) при 4 ° С в течение 24 часов.
3. После 24 часов, сбор решение от диализа мешок (12 кДа размер пор) и центрифуги в 90 000 оборотов в минуту в течение 1 часа при температуре 4 ° С (рис. B)
4. Удалить супернатант и приостановить гранул в буфер подвески БМВ по встряхивая или что позволяет приостановить сам по себе в BMV подвески буфер ночи при 4 ° C.
5. Убедитесь, что морфология OVGs с помощью ПЭМ (рис. C).
6. Измерить абсорбцию от 240 нм до 950 нм, используя спектрофотометр (Cary 50, Varian Inc), наличие МКГ подтверждается подписью поглощения пики около 700 нм и 790 нм ^8. (Рис. D)
7. Типичный МКГ флуоресценции пики при ~ 700 нм и ~ 800 нм, можно увидеть на 620 нм возбуждение OVG решение (рис. D) с помощью spectrofluorometer (Fluorolog 3 Jobin-Yvon).

_title "> 7. Результаты представитель

Рисунок A. ПЭМ-изображение негативно окрашенных вирионов BMV очищенный от N. benthamiana растений agroinfiltrated смесью всех трех дикого типа agroconstructs BMV (масштаб бар = 100 нм).

Рисунок B. гранул в пробирке собрали МКГ содержащих OVGs после высокоскоростного центрифугирования.

Рисунок C. ПЭМ-изображение негативно окрашенных МКГ содержащие OVGs (масштаб бар = 100 нм).

Рисунок D. поглощения (вверху) и флуоресценции (внизу) спектров OVGs. Длины волны возбуждения для OVG излучения сокак 620 нм.

Discussion

Agroinfiltration здесь подход может широко применяться для широкого спектра вирусов растений. Отличительная особенность этого подхода синхронизированы поставку нескольких agroconstruct в ту же камеру, что является главным недостатком, обычно связанные с обычно используется механический посев вирусов растений. В естественных условиях и в пробирке сборки исследований с использованием вируса мозаики костра в качестве модели может проводиться эффективно Следующие несколько советов. (I) Для успешного проникновения Н. benthamiana уходит, не поливать растения за 24 часа до проникновения, (II) Agrobacterium подвески культура будет распространяться на внутриклеточные пространства с легкостью, если проникновение проводились между 4-5 вечера, (III), оптическая плотность культуры не должна превышать 1,0 на OD _600. Проникновение agrocultures с более высокой плотности клеток, как известно, вызывает токсичность клеток и старения листьев ^9,10, которые могли бы серьезно повлиять на репликацию вируса и последующего вирионаобразование; (IV) во время проникновения мягкое давление должно применяться на абаксиальной стороне листа, чтобы предотвратить обширные повреждения листьев, которые могут вызвать иммунный ответ у растений; (у) Сахароза градиента плотности от 10% до 40% может быть сделано в трубке, сделав 25% сахарозы в буфер подвески БМВ (путем добавления высокой концентрации и низкая концентрация и разделив его на 2, т. е. 10% + 40% / 2 = 25%) и немедленно заморозить при -80 ° С в течение 2 -4 часа и далее позволяет сахарозы таять медленно, держа его на ночь при 4 ° С в прямом положении.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MES Sodium salts	Sigma-Aldrich	M2993
Indocyanine green	Sigma-Aldrich	I2633
Beckman ultracentrifuge	Beckman Coulter Inc.	Model: L8-70M
Centricon-100 column	EMD Millipore	YM-100
Spectrophotometer	Varian, Inc.	Part number 10068900
Spectrofluorometer	Fluorolog 3, Jobin-Yvon.	Part number FL3-21