Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Enkel og robust In vivo Og In vitro Fremgangsmåde for at studere Virus Assembly

Published: March 1, 2012 doi: 10.3791/3645

Summary

En enkel, effektiv og robust måde til at synkronisere levering af multiple virale komponenter til planteceller ved hjælp af

Abstract

I virus med positiv-sense RNA genomer patogene for mennesker, dyr og planter, afkom Indkapsling til modne og stabil virioner er et kardinalpunkt fase under etablering af infektion i en given vært. Derfor undersøgelse af encapsidation tyder de oplysninger om know-how af mekanismen regulering viruskonstruktion at danne infektiøse viruspartikler. Sådanne oplysninger er afgørende for at formulere nye metoder til at bremse virus spredes og sygdomsbekæmpelse. Virus indkapsling kan studeres in vivo og in vitro. Genom indkapsling in vivo er en yderst reguleret selektiv fremgangsmåde involverer makromolekylære interaktioner og subcellulær rumopdeling. Derfor, studere fører til dissekere begivenhederne omfatter virus encapsidering in vivo ville give grundlæggende viden til at forstå, hvordan virus formere sig og samle. For nylig in vitro encapsidering er blevet udnyttet til forskning inden for biomedicinske imaging og terapeutiske anvendelser. Ikke-kappeklædte plantevirus står langt fremme i venture af in vitro indkapsling af negativt ladede fremmed materiale. Brome mosaikvirus (BMV), en ikke-kappeklædte multikomponent RNA-virus er patogene for planter, er blevet anvendt som et modelsystem til undersøgelse genom emballage in vivo og in vitro. Til indkapsling assays i Nicotiana benthamiana planter, Agrobacterium-medieret transient ekspression betegner som agroinfiltration, er en effektiv og robust metode til synkroniserede afgivelse og ekspression af flere komponenter til den samme celle. I denne fremgangsmåde bliver en suspension af Agrobacterium tumefaciens celler, der bærer binære plasmid vektorer, der bærer cDNA'er af desiredviral mRNA'er infiltreret ind i intercellulære rum withina blad med noget mere sofistikeret end en 1 ml engangssprøjte (uden nål). Denne proces resulterer i overførsel af DNA-insertet i planteceller, T-DNAinsertet er transient i kernen og derefter transskriberet af værten polymerase II, hvilket fører til forbigående ekspression. Den resulterende mRNA transkript (udjævnet og polyadenyleret) derefter eksporteres til cytoplasmaet til oversættelse. Efter 24 til 48 timers inkubering, kan dele af infiltrerede blade udtages prøver for microscopyor biokemiske analyser. Agroinfiltration tillader et stort antal (hundreder til tusinder) af celler kan transficeres samtidigt. Til in vitro indkapsling, er oprensede virioner i BMV dissocieret i capsidprotein ved dialysering mod dissociation puffer indeholdende calciumchlorid efterfulgt af fjernelse af RNA og ikke-dissocierede virioner ved centrifugering. Genom depleteret capsidprotein subunits derefter samles med ønskede virale genom komponenter eller ikke-virale bestanddele, såsom indocyanine farvestof.

Protocol

1. Plantematerialet

  1. Nicotiana benthamiana planter, der skal anvendes i indkapsling assayet skal være 4 blade trin (ca. 3-4 uger gamle planter).

2. Afgivelse og ekspression af funktionelle virale genom komponenter til planteceller ved agroinfiltration

  1. Dag 1: Agrobacterium-stamme (f.eks EH 105 eller GV 3101) huser pCass-BMV RNA 1, BMV RNA 2 og BMV RNA 3 1,2 dyrkes på LB-agarplader suppleret med 50 mg / ml kanamycin (selekterer for Den pCASS vektoren) og 100 mg af rifampicin (selekterer for Agrobacterium). Inkubation udføres ved 28 ° C i to dage.
  2. Dag 3: podes enkelt koloni fra LB-agarplade i 2 ml LB-bouillon indeholdende 50 mg / ml kanamycin og 100 mg / ml rifampicin i 1 dag ved 28 ° C i orbital-rysteapparat indstillet til 250 omdrejninger pr.
  3. Dag 4: pode 50 ml af LB-bouillon supplemented med 50 mg / ml kanamycin og 100 mg / ml rifampicin, 10 mM MES pH 5,6 og 100 mM acetosyringon med en ml af kulturen i en 250 ml Erlenmeyer-kolbe i 16 timer ved 28 ° C på rysteapparat ved 250 rpm .
  4. Dag 5: overføres kulturen (når OD600 nåede 1,0) til en Oak Ridge rør eller sterilt Falcon-rør og centrifugeres i 10 minutter ved 5000 rpm ved 4 ° C.
  5. Pellet opløses i 10 ml 10 mM MgCl2 og centrifugeres i 10 minutter ved 5000 rpm ved 4 ° C, gentages trin en gang mere for at sikre fuldstændig fjernelse af antibiotikum.
  6. Suspender pelleten i 10 ml puffer indeholdende 10 mM MgCl2 og 10 mM MES (pH 5,6).
  7. Måle OD600 for hver kultur på BMV RNA 1, RNA 2 og RNA 3 og juster til 0,1 OD600 under anvendelse af 10 mM MgCl2 og 10 mM MES (pH 5,6).
  8. Blandes 1 ml hver alle tre 0,1 OD 600 kultur suspensioner.
  9. Tilsæt 100 mM af acetosyringon, mix gently og holde blandingen uforstyrret ved stuetemperatur i 3 timer.
  10. Trække kulturen suspensionen i 1 ml. sprøjte uden kanyle.
  11. Infiltrere den ovennævnte kultur suspensionen i abaxial side 2-3 og ekspanderet blade af N. benthamiana (5 blade fase, 3-4 uger gamle planter) ved forsigtigt at trykke sprøjten til halvdelen af abaxial overflade af blad.
  12. Gentag denne infiltration procedure til andre blade.
  13. Hold infiltrerede planter i det grønne hus med 24 ° C.
  14. Høst infiltreret blade 3 til 4 dage efter infiltrering (dpi).

3. Oprensning af BMV virioner

  1. Saml N. benthamiana efterlader agroinfiltrated med en blanding indeholdende alle tre vildtype BMV agrotransformants.
  2. Slibe blade i en steril morter med lige volumen (w / v) af BMV ekstraktionsbuffer (0,5 M NaAc, 0,08 M ​​MgAc, pH 4,5 og 1/100 volumen af ​​β-mercaptoethanol, som skal tilsættes umiddelbart før anvendelse) 3. For at maksimere virusudbytte, anbefales det at tilføje syrevasket sand (~ 0,5-1 g), der letter let formaling og effektivt cellesprængning.
  3. Filtrer bladekstrakt gennem 2-3 lag musselin klud og indsamle byge.
  4. Igen slibe det tilbageholdte portion på musselin klæde med samme volumen BMV ekstraktionsbuffer til den oprindelige vægt af bladmateriale.
  5. Gentages filtrering med anvendelse af musselin klud. Disse trin bør udføres ved 4 ° C.
  6. Filtratet opløsningen til et centrifugerør, og der tilsættes lige så stort volumen forafkølet chloroform og vortex (eller ryste) i 5 minutter ved stuetemperatur, indtil farven af ​​suspensionen bliver lysegrøn.
  7. Centrifugeres emulgerede opløsningen i 15 minutter ved 12.000 rpm ved 4 ° C.
  8. Den vandige fase, og der omrøres i 30 minutter på magnetomrører for at fjerne eventuelle tilbageværende chloroform.
  9. Overføre suspensionen til en steril ultracentrifugerør.
  10. 3.
  11. Centrifugeres ved 30.000 rpm i 3 timer i en Beckman ultracentrifuge ved 4 ° C.
  12. Supernatanten kasseres, og suspenderer pellet ønskede volumen af ​​BMV suspension puffer (til fremstilling af suspensionen buffer fortyndet BMV ekstraktionsbuffer til 1/10 med sterilt destilleret vand).
  13. Den delvist oprensede viruspartikler præparat fra ovenstående trin underkastes 10-40% sucrose densitetsgradientcentrifugering i 150 minutter ved 28 tusind rpm ved 4 ° C.
  14. Opsaml virus båndet enten manuelt eller ved en fraktionator. Den virus Bandet vises blåt under hvidt lys belysning.
  15. Fortyndes saccharoseopløsning indeholdende virusprøven mindst 50% med virussuspension puffer.
  16. Centrifuger fortyndet virus indeholdende saccharoseopløsningen i 3 timer ved 30.000 rpm i en Beckman ultracentrifuge ved 4 ° C.
  17. Endelig suspenderes højtoprensede viruspellet i et ønsket volumen af ​​viros suspension puffer.
  18. Måle koncentrationen af virionet (mg / ml) under anvendelse af spektrofotometer ved OD 260.

Ligning 1

Note: Baseret på RNA-indhold, ekstinktionskoefficient for BMV er 5 4.

  1. Kontroller renheden af ​​virioner ved at se under TEM (Fig. A)

4. Fremstillinq af capsidprotein underenheder til in vitro-samling

  1. Fremstille en liter 1x virus dissociation puffer (0,5 M CaCl2, 50 mM Tris HCI, pH 7,5, 1,0 mM EDTA, 1,0 mM DTT og 0,5 mM PMSF) 5.
  2. Forberede dialysemembran ifølge Sambrook et al 6.
  3. Dispensere ønskede koncentration af oprenset virus i en dialysepose.
  4. Anbring virusholdige dialyseposen i et bægerglas indeholdende 1 x virus dissociation buffer.
  5. Dialysere 24 timer ved 4 ° C while omrøring.
  6. Opsamle opløsningen fra dialyseposen efter 24 timer og centrifugeres ved 12.000 xg i 15 minutter ved 4 ° C. Dette vil adskille BMV RNA fra de dissocierede virioner.
  7. Opsamle supernatanten, og der centrifugeres ved 35.000 rpm i Beckman centrifuge i 3 timer ved 4 ° C for at pelletere eventuelle ikke-dissocierede viruspartikel.
  8. Opsamle supernatanten.
  9. På dette stadium er det bydende nødvendigt at fjerne eventuelle forurenende virionpartikler RNA fra dissocierede capsidproteinet subunits. For at gøre dette skal supernatanten fra trin 8 underkastes en anden runde af natten over gensamling af capsidprotein subunits uden tilsætning af RNA (i RNA 1x samling buffer, se nedenfor) efterfulgt af en høj hastighed centrifugering (30.000 rpm i 3 timer ved 4 ° C) for at pelletere eventuelle samlede virioner. Efter denne montering trin ville supernatanten indeholdende coating proteinunderenheder være fri for eventuelt resterende kontaminerende RNA. For at sikre dette er det tilrådeligt at udføre en yderligere i volumenitro gensamling med kun overtrække proteinunderenheder anvendelse af RNA 1x samling buffer. Efter natten over gensamling, skal præparatet være fri af sammensatte virioner (kontrollere hjælp TEM).
  10. Bestemmelse af koncentrationen af ​​capsidproteinet underenheder ved måling ved OD 254 og 280 nm eller ved andre metoder, såsom Bradford-assay.
  11. Udføre 12-15% SDS-PAGE efterfulgt af Western blot for at bestemme integriteten af ​​de dissocierede capsidprotein underenheder.

5. In vitro-samling af RNA indeholdende virioner

  1. Forbered RNA-transkriptioner at samles igen i virioner og beregn koncentrationen 7.
  2. Bland capsidprotein underenheder og RNA-transkriptet i et forhold på 1:5 (vægt / vægt) 5.
  3. Dispensere den ovennævnte blanding til en dialysepose og korrekt sikre at undgå lækager.
  4. Forbered 1.000 ml. RNA 1x samling buffer (50 mM NaCI, 50 mM Tris-HCI, pH 7,2, 10 mM KCI, 5 mM MgCl2, 1,0 mM DTT) 5.
  5. Anbring dialyseposen indeholdende reaktionsblandingen mod 1x samling buffer i bægerglasset og omrør.
  6. Dialysere gensamling reaktion ved 4 ° C i 24 timer ved forsigtig omrøring.
  7. Indsamler blandingen fra dialyseposen efter 24 timer, og der tilsættes 1,5 ml af RNA samling buffer.
  8. Passerer denne blanding gennem en Centricon-100 søjle ved centrifugering ved lav hastighed (2000 x g) i 30 minutter.
  9. Vaskes søjlen gang med 1,5 ml af samlingen puffer ved 4 ° C i 30 minutter.
  10. Gentage det ovennævnte vasketrin to gange.
  11. Endelig elueres gensamlet virioner ved centrifugering ved 10.000 g ved 4 ° C i 5 min.
  12. Vurdere virion koncentrationen ved OD 260 nm.

6. Fremstilling af optiske Virale Ghosts (OVGs)

  1. Tilsættes indocyaningrøn (ICG) 8 til det oprensede capsidproteinet på ønsket koncentrationsforhold (vægtforholdet mellem indocyaningrøn og capsid-protein anvendt i denne rapport var 01:10) en d blandes grundigt ved pipettering.
  2. Dialysere capsidproteinet og ICG-opløsning mod OVG konstruktionen buffer (1 M NaCl, 50 mM NaAc, 1 mM EDTA og 1 mM DTT, pH4.8) ved 4 ° C i 24 timer.
  3. Efter 24 timer opsamles opløsningen fra dialyseposen (12 kDa porestørrelse) og centrifugeres ved 90.000 rpm i 1 time ved 4 ° C (fig. B)
  4. Fjern supernatanten og suspenderer pellet i BMV suspension buffer ved hvirvelbehandling, eller når det suspenderes i sig selv i BMV suspension puffer natten over ved 4 ° C.
  5. Kontroller morfologi OVGs af TEM (Fig. C).
  6. Måle absorbansen fra 240 nm til 950 nm ved spektrofotometer (Cary 50, Varian Inc.), tilstedeværelse af ICG bekræftes ved signatur absorbanstoppe ved 700 nm og 790 nm 8. (Fig. D)
  7. De typiske ICG fluorescens toppe ved ~ 700 nm og ~ 800 nm kan ses ved 620 nm excitation af OVG opløsning (fig. D) ved anvendelse spektrofluorometer (Fluorolog 3, Jobin-Yvon).
_title "> 7. Repræsentative resultater

Figur A
Figur A. TEM billede af negativt farvede BMV virioner oprenset fra N. benthamiana planter agroinfiltrated med en blanding af alle tre vildtype BMV agroconstructs (Skalastang = 100 nm).

Figur B
Figur B. pellet af in vitro samlet ICG holdige OVGs efter højhastighedscentrifugering.

Figur C
Figur C. TEM billede af negativt farvet ICG indeholder OVGs (skala bar = 100 nm).

Figur D
Figur D. Absorbans (top) og fluorescens (nederst) spektre af OVGs. Excitationsbølgelængden anvendes OVG emission wsom 620 nm.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Agroinfiltration fremgangsmåde præsenteres her kan bredt anvendes til en bred vifte af plantevirus. Et kendetegnende træk ved denne fremgangsmåde er synkroniseret afgivelse af multiple agroconstruct til den samme celle-en væsentlig ulempe almindeligvis er forbundet med rutinemæssigt anvendes mekanisk inokulering af plantevirus. In vivo og in vitro-samling studier med brome-mosaikvirus som et model kan udføres effektivt ved Følgende par tips. (i) for en vellykket infiltration af N. benthamiana forlader ikke vand planterne i 24 timer før infiltration, (ii) Agrobacterium suspension kultur ville sprede sig til intracellulære rum med lethed, hvis infiltration blev udført mellem 4-5 PM, (iii) Den optiske tæthed af kulturen bør ikke overstige 1,0 ved OD600. Infiltration af agrocultures med højere celletæthed vides at inducere celletoksicitet og blad degeneration 9,10 der kan i alvorlig grad påvirke viral replikation og efterfølgende viriondannelse (iv) I infiltration blid tryk skal påføres på abaxial side af bladet for at forhindre omfattende skade på bladet, som kan udløse immunrespons i planten, (v) sucrose densitet gradient fra 10% til 40% kan fremstilles i et rør ved at 25% saccharose i BMV suspension puffer (ved tilsætning af den højeste koncentration og laveste koncentration og dividere med to dvs. 10% + 40% / 2 = 25%) og straks nedfryses ved -80 ° C i 2 -4 time og yderligere tillader saccharose at tø langsomt ved at holde det natten over ved 4 ° C i en udstrakt stilling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Vi har intet at afsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke flere medlemmer af laboratoriet for deres værdifulde forslag i udviklingen af ​​agroinfiltration og in vitro-samling analyser. Dette arbejde blev finansieret af en bevilling fra University of California. Denne undersøgelse blev støttet i dele af en bevilling fra National Science Foundation (CBET-1.144.237).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
MES Sodium salts Sigma-Aldrich M2993
Indocyanine green Sigma-Aldrich I2633
Beckman ultracentrifuge Beckman Coulter Inc. Model: L8-70M
Centricon-100 column EMD Millipore YM-100
Spectrophotometer Varian, Inc. Part number 10068900
Spectrofluorometer Fluorolog 3, Jobin-Yvon. Part number FL3-21

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Annamalai, P., Rao, A. L. Replication-independent expression of genome components and capsid protein of brome mosaic virus in planta: a functional role for viral replicase in RNA packaging. Virology. 338, 96-111 (2005).
  2. Annamalai, P., Rofail, F., Demason, D. A., Rao, A. L. Replication-coupled packaging mechanism in positive-strand RNA viruses: synchronized coexpression of functional multigenome RNA components of an animal and a plant virus in Nicotiana benthamiana cells by agroinfiltration. J. Virol. 82, 1484-1495 (2008).
  3. Annamalai, P., Rao, A. L. Plant Virology Protocols. Foster, N., Johansen, H. 451, Humana Press. 251-264 (2008).
  4. Lane, L. C. The bromoviruses. Adv. Virus Res. 19, 151-220 (1974).
  5. Choi, Y. G., Rao, A. L. Molecular studies on bromovirus capsid protein. VII. Selective packaging on BMV RNA4 by specific N-terminal arginine residuals. Virology. 275, 207-217 (2000).
  6. Sambrrok, J., Russel, D. W. Molecular Cloning. A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2001).
  7. Dreher, T. W., Rao, A. L., Hall, T. C. Replication in vivo of mutant brome mosaic virus RNAs defective in aminoacylation. J. Mol. Biol. 206, 425-438 (1989).
  8. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical nano-constructs composed of genome-depleted brome mosaic virus doped with a near infrared chromophore for potential biomedical applications. A.C.S. Nano. 5, 1243-1252 (2011).
  9. Voinnet, O., Lederer, C., Baulcombe, D. C. A viral movement protein prevents spread of the gene silencing signal in Nicotiana benthamiana. Cell. 103, 157-167 (2000).
  10. Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis. Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).

Tags

Immunologi Agrobacterium Brome mosaikvirus, Indkapsling dissociation, Nano-teknologi
Enkel og robust<em> In vivo</em> Og<em> In vitro</em> Fremgangsmåde for at studere Virus Assembly
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Chaturvedi, S., Jung, B., Gupta, S., More

Chaturvedi, S., Jung, B., Gupta, S., Anvari, B., Rao, A. L. N. Simple and Robust in vivo and in vitro Approach for Studying Virus Assembly. J. Vis. Exp. (61), e3645, doi:10.3791/3645 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter