Silk Film Culture-systeem voor In vitro Analyse en biomateriaal Ontwerp

Summary

Silk films zijn een nieuwe klasse van biomaterialen gemakkelijk aan te passen voor een scala aan biomedische toepassingen. De gepresenteerde zijde filmcultuur systeem is zeer aangepast aan verschillende

Abstract

Silk films zijn veelbelovend eiwit gebaseerde biomaterialen die kunnen met hoge betrouwbaarheid en economisch worden vervaardigd in een laboratorium-omgeving ^1,2. Deze materialen zijn wenselijk omdat ze een zeer beheersbare afmetingen en materiaaleigenschappen, biocompatibel en bevorderen celadhesie, kunnen worden gewijzigd door topografische patroon of chemisch wijzigen het oppervlak, en kan worden gebruikt als opslagplaats voor biologisch actieve moleculen drug delivery toepassingen ^3-8. Daarnaast zijn zijde films zijn relatief eenvoudig om op maat ontwerpen, kunnen worden ontworpen om op te lossen binnen enkele minuten of na verloop van jaren in vitro of in vivo, en zijn te produceren met het extra voordeel dat het erg transparant in de natuur en daarom uitermate geschikt voor grafische toepassingen ^{9 - 13.} De cultuur-systeem methodiek hier gepresenteerd is een schaalbare aanpak voor een snelle beoordeling van de cel-zijde filmoppervlakinteracties. Van bijzonder belang is het gebruik van oppervlak gevormde zijde films verschillen in celproliferatie en reacties van cellen voor aanpassing ^12,14 bestuderen. De geplaatste cultures werden gekweekt op zowel micro-gevormde en vlakke zijde film substraten en beoordeeld via tijdsverloop fase contrast beeldvorming scanning elektronenmicroscopie en biochemische beoordeling van metabolische activiteit en nucleïnezuur inhoud. Kortom, de zijde film in-vitro-cultuur systeem biedt een aanpasbare experimentele opstelling geschikt zijn voor de studie van de cel-oppervlakte-interacties op een biomateriaal substraat, die vervolgens kunnen worden geoptimaliseerd en vervolgens vertaald in vivo modellen. Opmerkingen met behulp van de cultuur-systeem hier gepresenteerde worden momenteel gebruikt om te helpen bij toepassingen, variërend van basis-cel interacties aan medische apparatuur ontwerpen, en dus relevant zijn voor een brede waaier van biomedische terreinen.

Protocol

1. Fabricage van Siliconen Rubber Mallen

1. Maak of koop een gewenste topografische ondergrond voor het gieten. Voor deze publicatie een standaard 100 mm geëtst siliciumplak wordt beschreven (figuur 1).
2. Weeg polydimethylsiloxaan (PDMS) oppotten (component A) en katalysator (component B) oplossing in een 1:9 verhouding (9 g potgrond en 1 g katalysator), zoals bepaald in de gekochte kit.
3. Meng oplossingen voor uitharding proces te starten.
4. Plaats silicium oppervlak van een wafer binnen een casting schotel.
5. Weeg 4,5 g van PDMS oplossing op silicium wafer.
6. Spread PDMS oplossing aan 100 mm diameter gebied van de wafer oppervlak.
7. Kantel wafer te PDMS oplossing gelijkmatig te verspreiden.
8. Bedek wafer met diameter van 100 mm petrischaal deksel.
9. Plaats gieten setup in 60 ° C oven gedurende de nacht, waardoor er zeker van dat uitharding plaatsvindt op een vlakke ondergrond.
10. Plaats genezen PDMS / silicium wafer in 70% ethanolbad voor de verwijdering.
11. Beginnen met het verwijderen van PDMS wafer door gebruik te maken scheermesje naar de rand van (gehele omtrek) eerst op te heffen.
12. Trek voorzichtig PDMS uit met pincet binnen een 70% ethanol bad zorg dat u siliconenrubber gieten scheuren.
13. Punch Out individuele PDMS vormen met behulp van 14 mm perforator. Deze diameter is ontworpen om te passen in een 24-wells plaat setup.

2. De productie van zijde oplossing

1. Breng 2 liter gedestilleerd water (dH ₂ O) aan de kook in een glazen beker ^7.
2. Snijd 5 g van Bombyx mori zijderups cocons in drieën.
3. Gooi uitgebreid besmet cocons, zoals aangegeven door een te grote insecten deeltjes het bekleden van het inwendige cocon oppervlak.
4. Meet 4,24 g natriumcarbonaat.
5. Voeg langzaam natriumcarbonaat tot het kookpunt dH ₂ O volume om over te koken van water te voorkomen, en laat het volledig is opgelost voordat u verder gaat.
6. Voeg cocon stukken aan de kook dH
7. Na het koken goed uitlekken dH ₂ O in de gootsteen en de ring uit de zijde-extract met de hand om het overtollige water te verwijderen.
8. Was zijde driemaal extract gedurende 20 minuten. elk in 1 L van dH ₂ O in een lab beker, en gebruik een roervlo om het volume te circuleren binnen de beker.
9. Na het wassen, ring uit de zijde-extract met de hand en plaats zijde fiber-extract in een chemische kap mogelijk te maken voor het drogen voor een 12 uur. periode.
10. De volgende dag, wegen de gedroogde zijde vezels, die typisch is ~ 3,5 g: ___________-g
11. Bereid 9,3 M LiBr oplossing voor een 20% w / v oplossing van zijde. Gebruik volgende vergelijkingen de nodige gewicht en volumes te berekenen:
    1. (Silk-extract gewicht van stap 10) x (4) = ___________-mL van het totaal 9,3 M LiBr oplossing
    2. [(807.705) x (LiBr volume van deel 11, A)] / 1000 = ___________ g LiBr toe te voegen aan dH ₂ O
    </ Li>
12. Voeg gemeten LiBr gewicht in een glazen beker van de volgende dH ₂ O volume:
    1. (0,8) x (berekende volume van stap 11, A) = ___________ ml dH ₂ O
13. Giet deze oplossing in een geschikt formaat maatcilinder, en Breng de oplossing tot aan de uiteindelijke volume, zoals berekend in het kader 11.a.
14. Plaats de zijde-extract in de beker en giet LiBr oplossing over de zijdevezels zorg ervoor dat de zijde vezels worden ondergedompeld in LiBr oplossing met behulp van een lab spatel.
15. Plaats de opgeloste zijde in 60 ° C oven gedurende 4 uur:
    Start tijd: ___________
    Eindtijd: ___________
16. Met behulp van een geschikte grootte spuit het opstellen van 12 ml van de zijde oplossing. Plaats een 18G naald op het einde van de spuit, en vervolgens de oplossing te injecteren in een dialyse cassette (3.500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Na het vullen van de cassette, trekken de resterende lucht uit de cassette met de lege spuit.
17. Plaats filled dialyse cassette binnen 1 L van DH ₂ O.
18. Wijzig dH ₂ O volume na 1 uur, 4 uur, 8 uur en vervolgens om 12 uur 3x voor een totaal van 6 veranderingen:
    1. Begin: ___________
    2. 1 uur: ___________
    3. 4HR: ___________
    4. 8 uur: ___________
    5. 12 uur: ___________
    6. 12 uur: ___________
    7. 12 uur: ___________
    8. Einde: ___________
19. Na dialyse, langzaam het verzamelen van de zijde oplossing van cassettes met een spuit. Plaats oplossing in 10.000 g beoordeeld centrifugebuizen.
20. Centrifugeer tweemaal de oplossing bij 10.000 g bij 4 ° C gedurende 20 min elk. Na elke centrifugeren plaats supernatant in een nieuwe buis.
21. Store THR zijde oplossing in 4 ° C koelkast.
22. Pipetteer 2 monsters van 0,5 ml zijde oplossing in kleine wegen schotel, en plaats af te wegen gerechten in een 60 ° C droge oven gedurende 12 uur of totdat de zijde oplossing droogt.
23. Weeg het resterende vaste zijde film uit both monsters zijde oplossing procent gewicht te meten om het volume te eiwitconcentratie:
    1. Gewicht van de gecombineerde 2 zijde film monsters: ___________ mg
    2. (Gewicht van 23.A) x (100) = ___________% zijde

3. Voorbereiding van Silk Films en Cultuur System Setup

1. Bereid PDMS casting oppervlakken door reiniging met doorzichtige tape om stof te verwijderen.
2. Schoon PDMS substraten door het weken in 70% EtOH en was drie keer met dH ₂ O.
3. Plaats 14 mm PDMS mallen op houder plaat, die typisch is een 24-wells plaat deksel.
4. Om een 50 micrometer dikke film te produceren, 70 μls van 8% zijde oplossing verspreid over PDMS mallen met behulp van een vloeistof verspreiden instrument dat typisch is een 1 ml spuit ^2.
5. Laat de zijde films te drogen onbedekt een schone bank waarop een luchtstroom druk van 150 Pa gedurende 90 min of tot films droog.
6. Zodra films zijn droge plaats geheel van de films, waaronder PDMS moud, in een water-annealen kamer voor> 4 uur aan een in water onoplosbare folie. Dit is typisch een lege kamer exsiccator met water in de bodem van het bassin getrokken in een 25 kPa vacuüm ^15.
7. Verwijder de zijde films uit het water-gloeien kamer en plaats op een schone bank.
8. Bereid een 70% EtOH bad binnen een 35 mm petrischaaltje, en plaats controle substraten (dat wil zeggen glas of plastic oppervlakken) en roestvrij stalen ringen in putten voor ten minste 10 minuten te steriliseren.
9. Verwijder de zijde films uit PDMS mallen met behulp van een tang, dompel ze in 70% EtOH, en plaats monster in 24-wells plaat ingevuld met 1 ml van 70% EtOH ervoor te zorgen bedrukte zijde naar boven gericht is om voor celadhesie.
10. Na het plaatsen van elke zijde film monster in een overeenkomstige goed plaats roestvrij stalen ring gewichten (11,65 mm binnendiameter, 15.45 mm buitendiameter, en 1,18 mm dikte) op de top.
11. Laat monsters met ringen om incubeer gedurende 10 minuten om de steriliteit te garanderen.
12. Remove EtOH en was elk monster 3x met 1 ml PBS. Laat elke wasbeurt zitten voor 5 minuten om te zorgen voor volledige diffusie.
13. Verwijder PBS met behulp van glazen pipet opzuigen, terwijl zorg ervoor dat meerderheid van de luchtbellen te verwijderen onder zijde film monsters.
14. Bereid cellijn voor het zaaien. Als voorbeeld trypsinize menselijke cornea-limbale epitheel (HCLE) cellijn met 0,25% trypsine en ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) oplossing van 7 min. Schakel trypsine met behulp van 01:01 volume van Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) passage media met 10% FBS toegevoegd. Centrifugeer getrypsiniseerd HCLE cellen, voeg 8-ml keratinocyt serum vrije media (K-SFM) naar celpellet, zachtjes schudden om HCLEs verspreiden, en het genereren van cellen.
15. Voorbeeld 500 pi van HCLE schorsing per putje meestal met behulp van een 10.000 cellen / cm ² dichtheid.
16. Plaats culturen binnen incubator bij 37 ° C en 5% CO ₂ en voer de gewenste experimentele protocol.

4. Representatieve resultaten

<p class = "jove_content">
Figuur 1. Stroomschema illustreren verkorte 10-stap-proces van zijde filmproductie en cultuur systeem voorbereiding.

Figuur 2. (A) 21-dye reeks patroon lijn oppervlak topografieën geproduceerd op een diameter van 90 mm ​​silicium wafer in dienst standaard fotolithografische en droge etstechnieken. (B) Silk films bewaart de originele parallelle lijn patroon functies na het gieten op PDMS vormen van oppervlakken. (C) Schematische tonen feature size ontwerp gekozen om cellulaire afstemming te bevorderen. (D) Doorsnede van zijde film illustreren behouden parallel gevoerd patroon oppervlak.

Figuur 3. Rasterelektronenmicrografieën van HCLE cellijn vast te houden aan (A) patroonen (B) vlakke zijde films op dag 2 in cultuur. HCLE culturen blijven woekeren tot confluentie op (C) patronen en (D) vlakke oppervlakken op dag 8 in cultuur.

Figuur 4. (A, D, G) met patroon en (B, E, H) vlakke zijde films cultuur HCLE cellen hoger dan bij (C, F, I) glas controle substraten bij (AC) dag 1, (DF) dag 4, en (GI) dag 8 in de cultuur. (J) CyQuant nucleïnezuur inhoud en (K) (3 - (4,5-dimethylthiazool-2-yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromide bromide (MTT) metabolisme assay gegevens blijkt HCLE levensvatbaarheid van zowel patroon en vlakke zijde filmsubstraten in vergelijking met glas stuurvlakken in de tijd (schaalbalken = 100 pm).

Video 1. Time lapse fase-contrast beeldvorming van HCLE cellen migreren over een patroon zijde film oppervlak tijdens een 18 uur. periode. Cellen werden gezaaid op 10k/cm ² dichtheid en gekweekt gedurende 2 uur. voor de beeldvorming. Klik hier om de film te bekijken .

Video 2. Time lapse fase-contrast beeldvorming van HCLE cellen migreren over een vlakke TCP controle-oppervlak tijdens een 18 uur. periode. Cellen werden gezaaid op 10k/cm ² dichtheid en gekweekt gedurende 2 uur. voor de beeldvorming. Klik hier om de film te bekijken .

Discussion

Het gebruik van kunstmatige zijde films als een substraat voor celkweek heeft aan populariteit gewonnen in de afgelopen twee decennia als gevolg van uitgebreide karakterisering van de materiaaleigenschappen van dit eiwit en beter begrip van het biomateriaal nut ^3,8. De cultuur hier beschreven systeem is een nieuwe in vitro testsysteem voor de beoordeling van het celoppervlak interacties op patroon zijde film biomateriaal substraten ^7. Het systeem zorgt voor een diepgaande analyse van de cellulaire interacties in de tijd dat eenvoudig kan worden vastgesteld voor high-throughput het verzamelen van gegevens. Dit wordt grotendeels ingeschakeld omdat zijde films beschikken over een aantal van afstembare biomateriaal eigenschappen die kunnen worden aangepast om rechtstreeks van invloed zijn celfunctie ^8,9,12, zoals: controle van oppervlakte micro / nano-oppervlakte topografie ^7; verschillende oppervlakchemie door middel van covalente modificatie of adsorptie biologisch actieve moleculen ^13; robuust mechanischeanical eigenschappen ^15,16, controle van het materiaal hydrofiliciteit / hydrofobiciteit ^16; bulk laden van biologische verbindingen voor release ^4,8,17 en gecontroleerde ontbinding / enzymatische afbraak tarieven door middel van controle van de secundaire structuur (beta sheet inhoud) ^11,18,19 .

De transparantie zijde films wordt bereikt door zachtgloeien de films gedurende tijd onder vacuüm bij aanwezigheid van waterdamp ^7,15. Deze verwerking kan benadering voor de vorming van β-sheet secundaire structuur, bevordering van de oplosbaarheid van het materiaal in water terwijl een minimale diffractie van licht ^15. Deze transparantie van films is de sleutel in staat te stellen direct live-cell imaging die kunnen worden gebruikt onder een aantal beeldvormende technieken (dat wil zeggen wide-field en fluorescentie) met behulp van een willekeurig aantal microscoop systemen ^12,20. Naast levende cellen beeldvorming, kan zijde films eenvoudig uit the cultuur systeem zorgen voor extra fixatie en analyse. Aldus de grote verscheidenheid van directe experimentele evaluatie kan worden uitgevoerd op dit systeem toepassing zijn op een grote verscheidenheid van cellen / weefsel bronnen voor vele technische velden ^{3,8,9,12,13,21.} De tijdsverloop imaging resultaten illustreren real-time data cultuur worden verzameld en als voorbeeld werden gebruikt om te tonen hoe oppervlaktetopografie cel interacties beïnvloedt. De representatieve resultaten tonen hoe zijde film biomaterialen worden gebruikt om HCLE cultuur groei te ondersteunen en amendeerbaar een aantal standaard cellulaire proliferatie en metabolische assays (Fig. 4). Bovendien worden de kweken vastgesteld en verwerkt scanning elektronen imaging of andere protocollen (Fig. 3).

Zijde film substraten worden in het laboratorium met hoge getrouwheid, consistentie en relatief goedkope (Fig. 1). Hierdoor reproduciheid in zowel cultuur-systeem installatie en experimentele resultaten. Het is aangetoond dat water-gloeien verwerking stabiele zijde filmmateriaal in cultuur aangetast, is gedefinieerd in afwachting de concentratie van proteasen in oplossing ^2,15,22 produceert. Als gevolg van deze materialen kunnen worden gebruikt voor langere tijd voor langdurige celkweek, of blijven geïmplanteerd maanden of jaren afhankelijk fysiologische locatie ^8. Bovendien heeft recent werk aangetoond dat zowel het eiwit en materiaaleigenschappen van water gehard zijde films stroken van partij tot partij waardoor reproduceerbare kweek zoals aangetoond door verschillende mechanische en biofysische testmethoden ^15,16. Daarnaast is het materiaal van het oppervlak blijkt grote trouw onder de film partijen, zoals aangegeven door SEM, atomic force micrscopy (AFM), en onderzoeken in celculturen {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. Materiaal stabilheid en consistentie is een belangrijke factor om de manier waarop de cel zal de cultuur substraat voelen door de verschillende mechanotransductie paden, en uiteindelijk een gewenste / ongewenste cellulaire respons ^25,26.

Historische normen voor cultuur substraten, zoals weefselkweek behandeld plastic of glas, voldoende substraten voor celhechting. Deze materialen kunnen niet gewijzigd verdere nut in vivo. Het kan gezien worden dat een zijde film biomateriaal kan worden aangepast in vitro, en als experimentele verwachtingen bereikt de aangepaste film kan direct worden omgezet in een in vivo model. Dergelijke gekoppeld ontwerp van in vitro en in vivo experimenten biedt een groot voordeel voor dergelijke implanteerbare zijde biomaterialen op andere substraten die routinematig worden gebruikt in vitro.