Silk Film Kultur System for In vitro Analyse og Biomateriale Design

Summary

Silke film er en hidtil ukendt klasse af biomaterialer let tilpasses til en række biomedicinske anvendelser. Den præsenterede silke filmkultur system er meget fleksibel i en række

Abstract

Silke film er lovende protein-baserede biomaterialer, som kan fremstilles med stor nøjagtighed og økonomisk i en forskningslaboratorium miljø ^1,2. Disse materialer er ønskelige, fordi de har meget kontrollerbar dimensioner og materiale egenskaber, er biokompatible og fremme celleadhæsion, kan modificeres via topografisk mønsterdannelse eller ved kemisk at ændre overfladen, og kan anvendes som et depot for biologisk aktive molekyler til medikamentafgivelse beslægtede ansøgninger ^3-8. Desuden er silke film relativt ligetil at tilpassede design, kan udformes til at opløses inden for minutter eller nedbrydes i løbet af årene in vitro eller in vivo, og producerer med den yderligere fordel af at være transparent i naturen og er derfor særdeles egnet til billeddannelse anvendelser ^{9 - 13.} Kulturen Systemet metode præsenteret her repræsenterer en skalerbar tilgang til hurtige vurderinger af celle-silke filmoverfladeinteraktioner. Af særlig interesse er anvendelsen af overfladeaktive mønstrede silke film at undersøge forskellene i celleproliferation og reaktioner i celler for tilpasning ^12,14. De podede Kulturerne blev dyrket på både mikro-mønstret og flade silke filmsubstrater og derefter vurderes ved hjælp af tidsforløb fasekontrast billeddannelse, scanningselektronmikroskopi og biokemiske vurdering af metabolisk aktivitet og nukleinsyre indhold. Sammenfattende giver silke filmen in vitro kultursystem en tilpasselig forsøgsopstilling er egnet til undersøgelse af celleoverflade-interaktioner på et biomateriale substrat, som derefter kan optimeres, og derefter omsættes til in vivo modeller. Observationer under anvendelse af dyrkningssystemet præsenteres her for øjeblikket anvendes til at hjælpe med ansøgninger fra basale celleinteraktioner med medicinsk anordning udformning, og dermed er relevante for en bred vifte af biomedicinske områder.

Protocol

1. Fabrikation af Silikone forme i gummi

1. Fremstil eller købe en ønsket topografisk overflade til støbning. Denne publikation en standard 100 mm ætsede silicium wafer vil blive beskrevet (fig. 1).
2. Afvej polydimethylsiloxan (PDMS) Potting (komponent A) og katalysator (komponent B) opløsning i en 01:09-forhold (9 g indstøbning og 1 g katalysator) som tilvejebragt i den købte kittet.
3. Bland løsninger grundigt at indlede hærdeprocessen.
4. Place silicium wafer overflade i en støbning fad.
5. Afvejes 4,5 g PDMS opløsning på siliciumskive.
6. Spredning PDMS opløsning for at dække en diameter på 100 mm område af wafer overfladen.
7. Vippe skiven til at sprede PDMS opløsning jævnt.
8. Omfatte wafer med 100 mm diameter petriskål låg.
9. Placer støbning setup i 60 ° C ovn i løbet af natten, hvilket gør sikker på, at hærdning finder sted på en flad overflade.
10. Sted hærdede PDMS / silicium wafer i 70% ethanolbad før fjernelse.
11. Begynd at fjerne PDMS fra wafer ved at bruge barberblad til at løfte kant (hele omkredsen) først.
12. Træk forsigtigt PDMS ud med pincet inden for en 70% ethanol bad være omhyggelig med ikke at rive silikonegummi støbning.
13. Punch Out enkelte PDMS forme ved hjælp af 14 mm huller. Denne diameter er udformet til at passe ind i en 24-brønds plade opsætning.

2. Produktion af Silk Solution

1. Bringe 2 liter destilleret vand _(dH2O) til kogning i en glas-bægerglas ^7.
2. Skær 5 g Bombyx mori Kokoner i tredjedele.
3. Bortskaf omfattende forurenet kokoner som angivet af overdreven insekt partikler belægning den indre kokon overflade.
4. Måle 4,24 g natriumcarbonat.
5. Tilsættes natriumcarbonat langsomt til kogning _dH2O volumen til at forhindre kogning i vand, og tillade fuldstændig opløsning før der fortsættes.
6. Tilføj cocoon stykker til kogning dH
7. Efter kogning, tømmes omhyggeligt dH ₂ O i vasken, og ring ud silke ekstrakt med hånden for at fjerne overskydende vand.
8. Vaskes silke ekstraheres tre gange i 20 min. hver i 1 liter _dH2O i et laboratorium bægerglas, og anvende en omrørerstav til at cirkulere volumen inden bægerglas.
9. Efter vask, ring ud silke ekstrakt med hånden og sted silke fiber-ekstrakt i en kemisk hætte for at tillade tørring i en 12 timer. periode.
10. Næste dag, vejer de tørrede silkefibre, som typisk er ~ 3,5 g: ___________-g
11. Fremstille 9,3 M LiBr opløsning til en 20% w / v opløsning af silke. Udnyt følgende ligninger til at beregne nødvendige vægt og volumen:
    1. (Silk ekstrakt vægt fra trin 10) x (4) = ___________-ml totalt 9,3 M LiBr opløsning
    2. [(807,705) x (LiBr volumen fra del 11.a)] / 1000 = ___________ g af LiBr at tilføje dH ₂ O
    </ Li>
12. Tilføj målt LiBr vægt i et glas bægerglas af følgende dH ₂ O volumen:
    1. (0,8) x (beregnede mængde fra trin 11.a) = ___________ ml _dH2O
13. Hæld denne opløsning i en passende størrelse måleglas, og bringe opløsning op til endeligt volumen som beregnet i del 11.a.
14. Placer silke ekstrakt i bægerglas og hæld LiBr løsning i løbet af de silkefibre og sørg for, silkefibre er nedsænket i LiBr løsning med en lab spatel.
15. Anbring det opløste silke til 60 ° C ovn i 4 timer:
    Start tid: ___________
    Afslut tid: ___________
16. Ved hjælp af en passende størrelse sprøjte udarbejde 12 ml af silke løsning. Anbring en 18G nål på enden af ​​sprøjten, og derefter indsprøjtes i en dialyse kassette (3500 MW coutoff, Slide-A-Lyzer, Thermo Scientific). Efter fyldning af kassetten, trække den resterende luft ud af kassetten med den tømte sprøjte.
17. Place filled dialyse kassette i en L dH ₂ O.
18. Skift dH ₂ O volumen efter 1 time, 4 timer, 8 timer og derefter hver 12 timer 3x i alt 6 ændringer:
    1. Begynd: ___________
    2. 1 time: ___________
    3. 4 timers: ___________
    4. 8 timers: ___________
    5. 12 timer: ___________
    6. 12 timer: ___________
    7. 12 timer: ___________
    8. Slut: ___________
19. Efter dialyse, indsamle langsomt silke løsning fra kassetter med sprøjte. Sted opløsning i 10.000 g bedømte centrifugerør.
20. Centrifugeres opløsningen to gange ved 10.000 g ved 4 ° C i 20 minutter hver. Efter hver centrifugering sted supernatant til et nyt rør.
21. Store Thr silke opløsning i 4 ° C køleskab.
22. Afpipetteres 2 prøver af 0,5 ml silke opløsning i små vejes skål, og et sted vejer retter inde i et 60 ° C tør ovn i 12 timer, eller indtil silke opløsning tørrer.
23. Vejes resterende faststof silke film fra both prøver til måling af silke opløsning procent vægt til volumen proteinkoncentration:
    1. Vægt af kombinerede 2 silke filmprøverne: ___________ mg
    2. (Vægt fra 23.a) x (100) = ___________% silke

3. Forbehandling af silke Film og Kultur systemopsætningsfunktionerne

1. Forbered PDMS støbeoverflader ved at rense med klar tape til at fjerne støv.
2. Ren PDMS substrater ved gennemvædning i 70% EtOH og vaskes tre gange med dH ₂ O.
3. Sted 14 mm PDMS formene på holdepladen, som typisk er en 24-brønds plade låg.
4. At fremstille en 50 um tyk film, spredes 70 μls på 8% silke løsning på PDMS formene ved hjælp af en væske spredes værktøj, der er typisk en 1 ml sprøjte spids ^2.
5. Tillade silke filmene tørrer udækkede på en ren bænk kører en luftstrøm på 150 Pa i en periode på 90 minutter eller indtil film er tørre.
6. Når filmene er tørt sted hel række af film, herunder PDMS mårige, i en vand-annealing kammer> 4 timer til frembringelse af en vanduopløselig film. Dette er typisk en tom ekssikkator kammer med vand i bunden af bassinet trukket ved en 25 kPa vakuum ^15.
7. Fjern silke film fra vand-udglødning kammer og plads på en ren bænk.
8. Forbered en 70% EtOH bad inden for en 35 mm petriskål, og kontrolprocedurer substrater (dvs. af glas eller plast overflader) og rustfrit stål ringe i brøndene mindst 10 minutter for at sterilisere.
9. Fjerne silke film fra PDMS forme med pincet, dyppe dem i 70% EtOH, og anbringes prøven i 24-brønds plade forfyldt med 1 ml 70% EtOH sørge mønstrede side vender opad for at tillade celleadhæsion.
10. Efter at placere hver silke filmprøve i en tilsvarende brønd sted rustfri stålring vægte (11,65 mm indre diameter, 15,45 mm ydre diameter, og 1,18 mm tykkelse) på toppen.
11. Tillader prøver med ringe til at inkubere i 10 minutter for at sikre sterilitet.
12. Remove EtOH og vaskes hver prøve 3 x med 1 ml PBS. Lod hver vask sidde i 5 minutter for at tillade fuldstændig diffusion.
13. Fjern PBS ved hjælp af sugning glaspipette, samtidig med at sørge for at fjerne hovedparten af ​​bobler under silke filmprøverne.
14. Forberede cellelinie til såning. Som et eksempel Trypsinisér human cornea-limbale epithelial (HCLE) cellelinie med 0,25% trypsin og ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) opløsning af 7-min. Deaktivere trypsin under anvendelse af 1:1 volumen Dulbeccos modificerede Eagle medium (DMEM) passage medium med 10% FBS tilsat. Centrifuger trypsiniserede HCLE celler, tilføje 8-ml keratinocyt-serum frie medier (K-SFM) til celle pellet, ryst forsigtigt at sprede HCLEs, og generere celletal.
15. Prøven 500 pi HCLE suspension per brønd typisk ved anvendelse af en 10.000 celler / cm ² densitet.
16. Sted kulturer i inkubatoren ved 37 ° C og _5% CO2 og køre den ønskede forsøgsprotokol.

4. Repræsentative resultater

<p class = "jove_content">
Figur 1. Rutediagram sammenfattet 10-trins proces silke filmproduktion, og kultur-systemet præparat.

Figur 2 (a) 21-farvestof array af mønstrede line overflade topografi fremstillet på en 90 mm ​​diameter siliciumskive anvendelse af standard fotolitografiske og tør ætsningsteknikker. (B) Silk film beholde originale parallel linje mønstrede funktioner efter støbning på PDMS støbeoverflader. (C) Skematisk viser funktionen størrelse udformning valgt til at fremme cellulær justering. (D) Tværsnit af silke film illustrerer bevaret parallel foret mønstret overflade.

Figur 3. SEM af HCLE cellelinje klæbe til (A) mønstredeog (B) flade silke film på dag 2 i kultur. HCLE kulturer fortsat proliferere til konfluens på (C) mønstret og (D) flade overflader på dag 8 i kultur.

Figur 4. (A, D, G) mønstrede og (B, E, H) flade silke film kultur HCLE celler i sammenligning med (C, F, I) glas kontrol substrater (AC) dag 1 (DF) dag 4, og (GI) dag 8 i kultur. (J) CyQuant nukleinsyre indhold og (K) (3 - (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) metaboliske aktivitetsassay, der viser HCLE levedygtighed på både mønstret og flade silke filmsubstrater sammenlignet med glas styreflader over tid (Målestoksforhold = 100 um).

Video 1. Time lapse fase-kontrast imaging af HCLE celler migrerer over en mønstret silke filmoverfladen under en 18 timer. tidsperiode. Celler blev podet ved 10k/cm ² densitet og dyrket i 2 timer. før billedbehandling. Klik her for at se filmen .

Video 2. Time lapse fase-kontrast imaging af HCLE celler migrerer over en flad TCP kontrol overfladen under en 18 timer. tidsperiode. Celler blev podet ved 10k/cm ² densitet og dyrket i 2 timer. før billedbehandling. Klik her for at se filmen .

Discussion

Brugen af regenererede silke film som et substrat for cellekultur har vundet i popularitet i løbet af de sidste to årtier på grund af omfattende karakterisering af materialeegenskaberne af dette protein og øget forståelse af sin biomateriale nytte ^3,8. Kulturen her beskrevne system repræsenterer en roman in vitro testsystem til vurdering af celleoverflade interaktioner på mønstret silke film biomateriale substrater ^7. Systemet giver mulighed for dybdegående analyse af cellulære interaktioner over tid, som nemt kan vedtages til high-throughput dataindsamling. Dette er i høj grad aktiveret, fordi silke film besidder en række afstemmelige biomateriale egenskaber, der kan modificeres til direkte at påvirke celle funktion ^8,9,12, herunder: kontrol af overfladevand mikro / nano-overflade topografi ^7; forskellige overfladebehandlinger kemier gennem kovalent modifikation eller adsorption af biologisk aktive molekyler ^13; robust mekaanical egenskaber ^15,16; kontrol af materiale hydrofilicitet / hydrofobicitet ^16; isætning af biologiske forbindelser til frigivelse ^4,8,17, og styret opløsning / enzymatiske nedbrydningshastigheder gennem styring af den sekundære struktur (beta-sheet indhold) ^11,18,19 .

Gennemsigtighed silke film opnås ved annealing filmene for en tid under vakuum i nærvær af vanddamp ^7,15. Denne behandling fremgangsmåde tillader dannelsen af β-ark sekundær struktur, fremme uopløselighed af materialet i vand, samtidig med at minimal afbøjning af lys ^15. Denne gennemsigtighed af film er nøglen i muliggør direkte live-cell imaging, der kan anvendes under en række billeddiagnostiske metoder (dvs. brede felt og fluorescens) ved hjælp af et vilkårligt antal mikroskop systemer ^12,20. Ud over direkte-celle billeddannelse, kan silke film let fjernes fra the kultur-system at give mulighed for yderligere fiksering og analyse. Således, at mange forskellige direkte eksperimentel vurdering, som kan udføres på dette system er anvendelige til en bred vifte af celler / væv kilder for mange tekniske områder ^{3,8,9,12,13,21.} Tids-lapse billeddannende resultater illustrerer, hvordan tidstro kultur data kan opsamles, og som et eksempel blev anvendt til at illustrere, hvordan overfladetopografi påvirker celleinteraktioner. De repræsentative resultater viser, hvordan silke film biomaterialer kan anvendes til at understøtte HCLE kulturvækst og er amendable en række standard cellulær proliferation og metaboliske assays (fig. 4). Derudover er kulturerne fikseret og behandlet for scanning elektron billeddannelse eller andre protokoller (fig. 3).

Silk film substrater er produceret i laboratoriet med high fidelity, konsistens, og med relativt lave omkostninger (fig. 1). Dette muliggør reproducifleksibilitet under både kultur systemopsætningen og eksperimentelle resultater. Det er blevet påvist, at vand-anneale behandling frembringer en stabil silke filmmateriale i kultur, som er defineret nedbrydningshastigheder indtil koncentrationen af proteaser i opløsning ^2,15,22. Som et resultat af disse materialer kan anvendes i længere tid til langsigtet cellekultur, eller forblive implanteret i måneder eller år, afhængigt af fysiologisk placering ^8. Desuden har nyere arbejde vist, at både protein-strukturen og materialeegenskaberne af vand-annealede silke film er konsistente fra batch til batch tillader reproducerbare kultur resultater som vist ved hjælp af forskellige mekaniske og biofysisk testmetoder ^15,16. Derudover er materialets overflade vist stor troskab blandt film partier som angivet af SEM, atomic force micrscopy (AFM), og cellekulturundersøgelser {Lawrence: 2008wr, Omenetto: 2008tc, Bray: 2011kq} ^7,23,24. Materiale stabilhed og konsekvens er en vigtig faktor for, hvordan cellen vil fornemme kulturen underlaget gennem de forskellige mechanotransduction veje, og i sidste ende producere en ønsket / uønsket cellulært respons ^25,26.

Historisk for kultursubstrater, såsom vævskultur behandlet plast eller glas, giver passende substrater for cellevedhæftning. Disse materialer er ikke amendable yderligere anvendelighed in vivo. Det kan forudses, at en silke film biomateriale kan tilpasses in vitro, og når eksperimentelle forventninger blevet opnået tilpassede filmen kan translateres direkte til en in vivo model. F.eks parret design mellem in vitro og in vivo eksperimenter giver en stor fordel for sådanne implanterbare silke biomaterialer i forhold til andre substrater, som rutinemæssigt anvendes in vitro.